CC BY
7Повышенная кишечная проницаемость как потенциальная цель лечения и реабилитации пациентов с сахарным диабетом 1-го типа
Яцков Игорь Анатольевич,
кандидат медицинских наук, Ордена Трудового Красного Знамени Медицинский институт имени С.И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени
B.И. Вернадского» E-mail: [email protected]
Белоглазов Владимир Алексеевич,
профессор, доктор медицинских наук, Ордена Трудового Красного Знамени Медицинский институт имени
C.И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского»
E-mail: [email protected]
Репинская Ирина Николаевна,
Ордена Трудового Красного Знамени Медицинский институт имени С.И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского» E-mail: [email protected]
Шадчнева Наталья Александровна,
доцент, кандидат медицинских наук, Ордена Трудового Красного Знамени Медицинский институт имени С.И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского» E-mail: [email protected]
Онучина Ирина Геннадьевна,
Ордена Трудового Красного Знамени Медицинский институт имени С.И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского» E-mail: [email protected]
Целью исследования была оценка состояния кишечной проницаемости у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа (СД1), путем изучения уровня зонулина периферической крови, а также маркеров эндотоксинемии, воспаления, эндотелиальной дисфункции и ремоделирования сосудистой стенки (эндоте-лин-1 и трансформирующий фактор роста бета (TGF-beta)). В исследование было включено 92 пациента с СД1, которым при поступлении в стационар был проведен забор плазмы периферической крови. Также была отобрана группа контроля из 42 здоровых респондентов. Пациентам обеих групп было проведено исследование биоматериала (плазмы крови) методом иммуноферментного анализа. Уровень зонулина периферической крови у пациентов с СД1-174,0 (156,0-227,3) нг/мл был значимо выше, чем в группе контроля - 123,1 (91,7-169,3) нг/мл (p<0,001). В группе с СД1 зарегистрированы достоверно более высокие показатели СРБ, ЛСБ, эндотелина-1 и TGF-be-ta, чем в группе контроля. Полученные нами данные подтверждают наличие проблемы повышенной кишечной проницаемости у пациентов с СД1, а также её связь с изменениями уровня маркеров эндотелиальной дисфункции и ремоделирования стенки сосудистого русла.
Ключевые слова: сахарный диабет 1-го типа, гликемия, кишечная проницаемость, реабилитация, профилактика, риск.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-25-20052.
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) и их осложнения являются основной причиной смерти пациентов с сахарным диабетом 1-го типа (СД1) [1]. Причинами высокого кардиоваскулярного риска безусловно являются хроническая высокая гликемия, артериальная гипертензия и дислипидемия [2]. Данные состояния различными путями приводят к развитию окислительного стресса, ремоделиро-ванию сосудистой стенки и её ригидности, а также увеличению риска тромбообразования [3]. Помимо непосредственного действия на сосудистую стенку, гипергликемия способна влиять на функциональное состояние энтероцитарного барьера, выступающего в роли «щита», не позволяющего антигенным структурам, в том числе липополисахаридам грам-негативной флоры (ЛПС), достигать лимфы и приводить к развитию низкоинтенсивного воспалительного ответа, усугубляющего течение основного заболевания [4]. Увеличение пула циркулирующего ЛПС способствует активации провоспалительного пути через рецепторы sCD14 и толл-подобный рецептор 4-го типа (TLR4), приводя к повреждению эндотелиальных клеток, изменению нормальной функции трансформирующего фактора роста бета (TGF-beta), снижая его противовоспалительное действие и активируя транскрипционный фактор NF-kB [5, 6].
В связи с вышеизложенным, целью нашего исследования было оценить состояние кишечной проницаемости у пациентов с СД1, путем изучения уровня маркера кишечной проницаемости - зо-нулина периферической крови, а также маркеров системной эндотоксинемии, низкоинтенсивного воспаления, эндотелиальной дисфункции и ремоделирования стенки сосудистого русла (эндоте-лин-1 и трансформирующий фактор роста бета (TGF-beta)).
Материал и методы
В исследование было включено 92 пациента с СД1, поступивших на плановую госпитализацию в эндокринологическое отделение Республиканской Клинической больницы им. Н.А. Семашко в г. Симферополь. Всем пациентам при поступлении в стационар был проведен забор биологического материала (плазмы крови). Также была сформирована группа контроля из 42 практически здоровых респондентов, которые были сопоставимы с основной группой пациентов с СД1 по возрастному и половому признаку. Характеристика исследуемых групп представлена в таблице 1.
сз о
о Л о
о сз о в
Таблица 1. Характеристика пациентов, включенных в исследование
Признаки Группа № 1 СД1 (n=92) Группа № 2 Контроль (n=42) p
1 2
Пол Муж. абс. (%) 45 (48,91) 16 (38,1) 0,244
Жен. абс. (%) 47 (51,09) 26 (61,9)
Возраст, полных лет Ме 34,5 (23,047,0) 29 (18-36) 0,082
ИМТ, кг/м2 Ме 23,0 (21,026,7) 22,5 (20,525) 0,432
ИБС, абс. (%) 6 (6,52) 0 (0,0) >0,05
АГ, абс. (%) 32 (34,78) 0 (0,0) <0,001
Стаж заболевания, полных лет Ме 9,0 (4,0-19,0) -
Примечание: ИМТ - индекс массы тела, ИБС - ишемическая болезнь сердца, АГ - артериальная гипертензия.
Критерием включения в группу пациентов СД1 с был верифицированный диагноз «Сахарный диабет 1-го типа».
Критериями включения в контрольную группу были нормальные показатели углеводного метаболизма, а именно - уровень глюкозы натощак < 5,6 ммоль/л и показатель HbAlc < 5,7%, а также отсутствие аутоиммунной и онкологической патологии, ССЗ и других хронических заболеваний, а также отсутствие беременности.
Критериями исключения для всех исследуемых были беременность, возраст старше 50 лет, воспалительные заболевания кишечника в анамнезе, наличие онкологических заболеваний, клинические признаки острого воспаления и лихорадка.
Данные о наличии сопутствующих заболеваний были получены из предшествующей госпитализации медицинской документации (амбулаторные карты пациентов).
Иммуноферментный анализ (ИФА) был использован для изучения уровня зонулина и маркеров, указывающих на эндотелиальную дисфункцию и ремоделирование стенки сосудов (TGF-beta и эн-дотелин-1) у обеих групп пациентов, которым проводилось исследование плазмы периферической крови.
Содержание зонулина (нг/мл), ЛСБ (нг/мл), эн-дотелина-1 (пкг/мл), TGF-beta (нг/мл) и СРБ (мг/л) в плазме периферической крови определялось количественным высокочувствительным иммунофер-ментным методом с использованием теста ELISA „ производства Cloud Clone corp. (Ухань, Хубей, Ки-о тай).
~ Исследования проводились с соблюдением пра-g вил Хельсинкской декларации 1975 года, пересмо-~ тренной в 2013 году. Все участники исследования £ дали свое письменное информированное добро-
вольное согласие до его начала. Протокол данного исследования одобрен Локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского», (г. Симферополь) № 5 от 12 апреля 2024 г.
Для анализа данных использовался пакет программ IBM SPSS Statistics 27. Проверка нормальности распределения количественных показателей проводилась с помощью W-критерия Шапиро - Уил-ка. Для сравнения групп использовался U-критерий Манна-Уитни. Показатели считались статистически значимыми при уровне значимости менее 0,05. Для определения связи использовался коэффициент ранговой корреляции Спирмена. При сравнении частот качественных признаков применяли тест х2 Пирсона или критерий Фишера. Критерий W принимался за нормальное распределение при р>0,1.
Результаты
Из данных, представленных в таблице 2 видно, что уровень зонулина периферической крови у пациентов с СД1-174,0 (156,0-227,3) нг/мл был статистически значимо выше, чем в группе относительно здоровых респондентов - 123,1 (91,7-169,3) нг/мл (p<0,001). В группе пациентов с СД1 зарегистрированы достоверно более высокие показатели СРБ, ЛСБ, эндотелина-1 и TGF-beta, чем в контрольной группе.
Таблица 2. Сравнение исследуемых показателей у пациентов с СД1 и группы контроля ^ ^1^3)).
Маркеры Группа № 1 СД1 (n=92) Группа № 2 Контроль (n=42) p
Зонулин, нг/ мл 174,0 (156,0227,3) 123,1 (91,7169,3) <0,001*
ЛСБ, мг/л 5,76 (4,37-8,65) 1,05 (0,33-1,78) <0,001*
СРБ, мг/л 0,81 (0,43-2,07) 0,15 (0,09-0,31) <0,001*
Эндотелин-1, пкг/мл 34,3 (27,5-39,9) 26,4 (21,3-34,1) <0,001*
TGF-beta, нг/ мл 2,1 (1,5-3,11) 1,32 (0,17-4,27) <0,001*
* - результаты достоверны при р<0,05
Корреляционный анализ выявил наличие прямой корреляционной связи между показателем зонулина и эндотелина-1 (р=0,312; р<0,009), связь характеризовалась умеренной силой по шкале Чед-дока. Зарегистрирована слабая положительная корреляционная связь между показателем уровня зонулина и TGF-beta (р=0,254; р<0,036). Статистически значимых корреляционных связей между показателями ЛСБ и зонулином, а также СРБ (р>0,05) выявлено не было.
Обсуждение
На данный момент в литературе имеются данные о наличии повышенной кишечной проницаемости
как у пациентов с СД1, так и у пациентов с высоким риском развития СД1 [7]. При этом нарушается парацеллюлярная и трансцеллюлярная проницаемость, с преобладанием парацеллюлярного типа [7]. Кроме того, прослеживается прямая зависимость между уровнем проницаемости, уровнем антиостровковых антител и скорости прогрессии заболевания [7]. Также на увеличение кишечной проницаемости указывает обнаружение в недавних исследованиях повышенного уровня зонулина, кишечного белка, связывающего жирные кислоты (1^АВР) и ЛПС у пациентов с СД1 [8].
В норме основные эндотоксин-связывающие системы, а именно ЛСБ и sCD14, соединяясь с ЛПС и перенося его на рецепторы TLR4 запускают иммунный ответ, который «тренирует» иммунную систему [9]. По мнению ряда ученых, экспозиция ЛПС в детском возрасте даже профилактирует развитие аллергических и аутоиммунных реакций в дальнейшем [10]. Безусловно бесконтрольное поступление антигенных структур, минующих кишечный барьер, не может происходить без каких-либо последствий. При наличии неинфекционной или инфекционной патологии, например, сахарного диабета 2-го типа, ишемической болезни сердца, ожирения, новой коронавирусной инфекции и бронхиальной астмы, в основном, регистрируются повышенные уровни ЛСБ и sCD14 [11, 12, 13]. Это связано с «метаболической эндотоксинемией», увеличением поступающего ЛПС через естественные барьеры, в частности, тонкий кишечник [12]. Активация TLR4 сопровождается провоспалительной системной реакцией, что характеризуется увеличением СРБ, как маркера низкоинтенсивного воспаления [12]. Чем больше ЛПС поступает в системный кровоток и лимфу, тем более выражен воспалительный ответ. При СД1 выявляется некоторый дисбаланс ЛПС-связывающих систем с отсутствием каких-либо корреляционных связей между маркерами воспаления и ЛСБ, что было выявлено и в нашем исследовании [14] Данное состояние может быть связано как с дисфункцией самих ЛСБ и э0014, так и модулирующих их молекул, а одним из объяснений служит длительная высокая гликемия, влияющая на белки-переносчики ЛПС.
Несмотря на выявленный дисбаланс систем, связывающих эндотоксин, у пациентов с СД1, регистрируемый уровень СРБ всё же выше, чем у здоровых респондентов. Это указывает на предрасположенность к развитию низкоинтенсивного воспаления при СД1.
Помимо воспаления, ЛПС способен влиять на такие звенья патогенеза ССЗ при СД1, как эндотели-альная дисфункция, фиброз и ремоделирование стенки сосудов [15]. Выявленные нами статистически более высокие показатели TGF-beta, эндотели-на-1 и зонулина, по сравнению с группой контроля, а также прямая корреляционная связь между данными маркерами может свидетельствовать о влиянии повышенной кишечной проницаемости на патогенез ССЗ при СД1. Открытым остается вопрос, является ли это результатом повышения ЛПС крови,
или других молекул, поступающих через энтероци-тарный барьер. Безусловно, для этого необходим анализ непосредственно уровня эндотоксина крови у пациентов с СД1 и его сопоставления с показателями зонулина, ЛСБ и маркерами фиброза и эндо-телиальной дисфункции. Однако представленные данные все же подчеркивают значение повышенной проницаемости при СД1, которое следует, по нашему мнению, рассматривать как потенциальную мишень в разработке лечебно-профилактических и восстановительных программ при СД1.
Заключение
Полученные нами данные подтверждают наличие повышенной кишечной проницаемости у пациентов с СД1, а также её связь с изменениями уровня маркеров эндотелиальной дисфункции и ремоде-лирования стенки сосудистого русла. Для более точного понимания причины развития дисфункции энтерального барьера и патофизиологических механизмов изменения сосудистой стенки, возникающих на фоне повышенной кишечной проницаемости у пациентов с СД1 необходимы дальнейшие углубленные научные изыскания. Изучение методов снижения кишечной проницаемости в перспективе может являться профилактической мерой в уменьшении кардиоваскулярного риска у пациентов с СД1.
Литература
1. Dedov II, Shestakova MV, Vikulova OK, et al. Diabetes mellitus in the Russian Federation: dynamics of epidemiological indicators according to the Federal Register of Diabetes Mellitus for the period 2010-2022. Diabetes mellitus. 2023;26(2):104-123. doi:10.14341/DM 13035
2. ElSayed NA, Aleppo G, Aroda VR, et al. Introduction and Methodology: Standards of Care in Di-abetes-2023. Diabetes Care. 2023;46(Suppl 1): S1-S4. doi: 10.2337/dc23-Sint.
3. Morandi A, Corradi M, Orsi S, Piona C, Zusi C, Costantini S, Marigliano M, Maffeis C. Oxidative stress in youth with type 1 diabetes: Not only a matter of gender, age, and glycemic control. Diabetes Res Clin Pract. 2021 Sep;179:109007. doi: 10.1016/j.diabres.2021.109007.
4. Li X, Atkinson MA. The role for gut permeability in the pathogenesis of type 1 diabetes - a solid or leaky concept? Pediatr Diabetes. 2015 Nov;16(7):485-92. doi: 10.1111/pedi.12305.
5. Ciesielska A, Matyjek M, Kwiatkowska K. TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-in-duced pro-inflammatory signaling. Cell Mol Life Sci. 2021 Feb;78(4):1233-1261. doi: 10.1007/ s00018-020-03656-y.
6. Seki E, De Minicis S, Österreicher CH, Kluwe J, Osawa Y, Brenner DA, Schwabe RF. TLR4 enhances TGF-beta signaling and hepatic fibrosis. Nat Med. 2007 Nov;13(11):1324-32. doi: 10.1038/ nm1663.
C3
о
о Л о
о
сз
о в
в u
CM
о
CM
7. M0nsted M0, Falck ND, Pedersen K, Buschard K, Holm LJ, Haupt-Jorgensen M. Intestinal permeability in type 1 diabetes: An updated comprehensive overview. J Autoimmun. 2021 Aug;122:102674. doi: 10.1016/j.jaut.2021.102674.
8. Hoffmanová I, Sánchez D, Hábová V, Andél M, Tu cková L, Tlaskalová-Hogenová H. Serological markers of enterocyte damage and apoptosis in patients with celiac disease, autoimmune diabetes mellitus and diabetes mellitus type 2. Physiol Res. 2015;64(4):537-46. doi: 10.33549/physiol-res.932916.
9. Mitroulis I, Ruppova K, Wang B, Chen LS, Grzy-bek M, Grinenko T, Eugster A, Troullinaki M, Palladini A, Kourtzelis I, Chatzigeorgiou A, Schlitzer A, Beyer M, Joosten LAB, Isermann B, Lesche M, Petzold A, Simons K, Henry I, Dahl A, Schultze JL, Wielockx B, Zamboni N, Mirtschink P, Coskun Ü, Hajishengallis G, Netea MG, Chavakis T. Modulation of Myelopoiesis Progenitors Is an Integral Component of Trained Immunity. Cell. 2018 Jan 11;172(1-2):147-161.e12. doi: 10.1016/j. cell.2017.11.034.
10. Eder W, von Mutius E. Hygiene hypothesis and endotoxin: what is the evidence? Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2004 Apr;4(2):113-7. doi: 10.1097/ 00130832-200404000-00008. PMID: 15021064.
11. Яковлев М.Ю. Системная эндотоксинемия. Го-меостаз и общая патология. - М.: Наука; 2021.
12. Белоглазов В.А., Яцков И.А., Кумельский Е.Д., Половинкина В.В. Метаболическая эндотоксинемия: возможные причины и последствия. Ожирение и метаболизм. 2021;18(3):320-326. https://doi.org/10.14341/omet12750
13. Lipopolysaccharide-binding systems in patients with SARS-COV-19 infection having various degrees of severity / V. Beloglazov, I. Yatskov, A. Nikolaeva [et al.] // Annals of Allergy, Asthma and Immunology. - 2021. - Vol. 127, No. S5. -P. 39. - DOI 10.1016/j.anai.2021.08.117.
14. Fedulovs A, Pahirko L, Jekabsons K, Kunrade L, Valeinis J, Riekstina U, et al. Association of Endo-toxemia with Low-Grade Inflammation, Metabolic Syndrome and Distinct Response to Lipopolysac-charide in Type 1 Diabetes. Biomedicines. 2023; 11(12):3269. https://doi.org/10.3390/biomedi-cines11123269.
15. Wang, M., Feng, J., Zhou, D. et al. Bacterial lipopolysaccharide-induced endothelial activation and dysfunction: a new predictive and therapeutic paradigm for sepsis. Eur J Med Res 28, 339 (2023). https://doi.org/10.1186/s40001-023-01301-5
INCREASED INTESTINAL PERMEABILITY AS
A POTENTIAL GOAL OF TREATMENT AND
REHABILITATION OF PATIENTS WITH TYPE 1
DIABETES MELLITUS1
Yatskov I.A., Beloglazov V.A., Repinskaya I.N., Shadchneva N.A., Onuchina I.G.
V.I. Vernadsky Crimean Federal University
1 Funding. The research was supported by the Russian Science Foundation grant No. 24-25-20052.
The aim of our study was to evaluate the state of intestinal permeability in patients with type 1 diabetes mellitus (DM1) by examining the level of peripheral blood zonulin, as well as markers of endotoxemia, inflammation, endothelial dysfunction and vascular wall remodeling (endothelin-1 and transforming growth factor beta (TGF-beta)). Ninety-two patients with DM1 who underwent peripheral blood plasma sampling on admission to the hospital were included in the study. A control group of 42 healthy respondents was also selected. Patients of both groups were examined for biomaterial (blood plasma) by enzyme immunoassay. The level of peripheral blood zonulin in patients with DM1-174.0 (156.0-227.3) ng/mL was significantly higher than in the control group - 123.1 (91.7-169.3) ng/mL (p<0.001). Significantly higher values of CRP, LBP, endothe-lin-1 and TGF-beta were registered in the group with DM1 than in the control group. Our data confirm the presence of the problem of increased intestinal permeability in patients with DM1, as well as its relationship with changes in the level of markers of endothelial dysfunction and vascular wall remodeling.
Keywords: type 1 diabetes mellitus, glycemia, intestinal permeability, rehabilitation, prevention, risk.
References
1. Dedov II, Shestakova MV, Vikulova OK, et al. Diabetes mellitus in the Russian Federation: dynamics of epidemiological indicators according to the Federal Register of Diabetes Mellitus for the period 2010-2022. Diabetes mellitus. 2023;26(2):104-123. doi:10.14341/DM13035
2. ElSayed NA, Aleppo G, Aroda VR, et al. Introduction and Methodology: Standards of Care in Diabetes-2023. Diabetes Care. 2023;46(Suppl 1): S1-S4. doi: 10.2337/dc23-Sint.
3. Morandi A, Corradi M, Orsi S, Piona C, Zusi C, Costantini S, Marigliano M, Maffeis C. Oxidative stress in youth with type 1 diabetes: Not only a matter of gender, age, and glycemic control. Diabetes Res Clin Pract. 2021 Sep;179:109007. doi: 10.1016/j. diabres.2021.109007.
4. Li X, Atkinson MA. The role for gut permeability in the pathogenesis of type 1 diabetes - a solid or leaky concept? Pediatr Diabetes. 2015 Nov;16(7):485-92. doi: 10.1111/pedi.12305.
5. Ciesielska A, Matyjek M, Kwiatkowska K. TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling. Cell Mol Life Sci. 2021 Feb;78(4):1233-1261. doi: 10.1007/ s00018-020-03656-y.
6. Seki E, De Minicis S, Osterreicher CH, Kluwe J, Osawa Y, Brenner DA, Schwabe RF. TLR4 enhances TGF-beta signaling and hepatic fibrosis. Nat Med. 2007 Nov;13(11):1324-32. doi: 10.1038/nm1663.
7. Monsted M0, Falck ND, Pedersen K, Buschard K, Holm LJ, Haupt-Jorgensen M. Intestinal permeability in type 1 diabetes: An updated comprehensive overview. J Autoimmun. 2021 Aug;122:102674. doi: 10.1016/j.jaut.2021.102674.
8. Hoffmanová I, Sánchez D, Hábová V, Andél M, Tucková L, Tlaskalová-Hogenová H. Serological markers of enterocyte damage and apoptosis in patients with celiac disease, autoimmune diabetes mellitus and diabetes mellitus type 2. Physiol Res. 2015;64(4):537-46. doi: 10.33549/physiolres.932916.
9. Mitroulis I, Ruppova K, Wang B, Chen LS, Grzybek M, Grinenko T, Eugster A, Troullinaki M, Palladini A, Kourtzelis I, Chatzigeor-giou A, Schlitzer A, Beyer M, Joosten LAB, Isermann B, Lesche M, Petzold A, Simons K, Henry I, Dahl A, Schultze JL, Wielockx B, Zamboni N, Mirtschink P, Coskun Ü, Hajishengallis G, Ne-tea MG, Chavakis T. Modulation of Myelopoiesis Progenitors Is an Integral Component of Trained Immunity. Cell. 2018 Jan 11;172(1-2):147-161.e12. doi: 10.1016/j.cell.2017.11.034.
10. Eder W, von Mutius E. Hygiene hypothesis and endotoxin: what is the evidence? Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2004 Apr;4(2):113-7. doi: 10.1097/00130832-200404000-00008. PMID: 15021064.
11. Yakovlev M.Y. Systemic endotoxinemia. Homeostasis and general pathology. - Moscow: Nauka; 2021.
12. Beloglazov V.A., Yatskov I.A., Kumelsky E.D., Polovinki-na V.V. Metabolic endotoxemia: possible causes and consequences. Obesity and metabolism. 2021;18(3):320-326. (In Russ.) https://doi.org/10.14341/omet12750
13. Lipopolysaccharide-binding systems in patients with SARS-COV-19 infection having various degrees of severity / V. Beloglazov, I. Yatskov, A. Nikolaeva [et al.] // Annals of Allergy,
Asthma and Immunology. - 2021. - Vol. 127, No. S5. - P. 39. -DOI 10.1016/j.anai.2021.08.117. 14. Fedulovs A, Pahirko L, Jekabsons K, Kunrade L, Valeinis J, Riekstina U, et al. Association of Endotoxemia with Low-Grade Inflammation, Metabolic Syndrome and Distinct Response to
Lipopolysaccharide in Type 1 Diabetes. Biomedicines. 2023; 11(12):3269. https://doi.org/10.3390/biomedicines11123269. 15. Wang, M., Feng, J., Zhou, D. et al. Bacterial lipopolysaccharide-induced endothelial activation and dysfunction: a new predictive and therapeutic paradigm for sepsis. Eur J Med Res 28, 339 (2023). https://doi.org/10.1186/s40001-023-01301-5
