CC BY
88
ЛИТЕРАТУРА
1. Белякова Н. В., Альховский С. В., Шевченко Е. С. и др. Изучение чувствительности эпидемических штаммов вируса гриппа A (H1N1), изолированных в России в сезоны 2006-2009 гг., к озель-тамивиру (Tamiflu™) с помощью молекулярно-генетических методов // Вопр. вирусол. - 2010. - № 5. - С. 10-13.
2. БурцеваЕ. И., Шевченко Е. С., БеляковаН. В. и др. Мониторинг чувствительности выделенных в России эпидемических штаммов вирусов гриппа к этиотропным // Вопр. вирусол. - 2009. - № 5. - С. 24-29.
3. Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация: Метод, рекомендации (утверждены ФС по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 18 апреля 2006 г. N.0100/4430-06-34) / Со-минина А. А., Бурцева Е. И., Лобова Т. Г. и др. - М., 2006.
4. Грипп: Руководство для врачей / Под ред. Г. И. Карпухина. -СПб., 2001.
5. Даниленко Д. М., Коновалова Н. И., Еропкин М. Ю. и др. Пандемический грипп в 2009 г. в России. Особенности выделения и биологические свойства // Вопр. вирусол. - 2011. - № 2. - С. 24-28.
6. Киселев О. И., Комиссаров А. Б., Стукова М. А. и др. Пандемический грипп в 2009 г. в России. Диагностика и молекулярнобиологические характеристики вируса // Вопр. вирусол. - 2011. - № 1. - С. 17-21.
7. Львов Д. К., Бурцева Е. И., Прилипов А. Г. и др. Изоляция 24.05.2009 и депонирование в Государственную коллекцию вирусов (ГКВ N.2452 от 24.05.2009) первого штамма А/IIV-Moscow/01/2009 (H1M1)swl, подобного свиному вирусу A (H1N1) от первого выявленного 21.05.2009 больного в Москве // Вопр. вирусол. - 2009. - № 5. - С. 10-14.
8. Львов Д. К., Бурцева Е. И., Прилипов А. Г. и др. Возможная связь летальной пневмонии с мутациями пандемического вируса гриппа A/H1N1swl в рецепторсвязываюшем сайте субъединицы НА1 гемагглютинина // Вопр. вирусол. - 2010. - № 4. - С. 4-14.
9. Львов Д. К., БурцеваЕ. И., Щелканов М. Ю. и др. Распространение нового пандемического вируса гриппа A (H1N1)v в России // Вопр. вирусол. - 2010. - № 3. - С. 4-9.
10. Львов Д. К., Бурцева Е. И., Лаврищева В. В. Информация Центра экологии и эпидемиологии гриппа Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН об итогах эпидемического сезона 2009-2010 гг. по гриппу и ОРВИ (с 40-й недели 2009 г. по 22-ю неделю 2010 г.) в мире и России // Вопр. вирусол. - 2011. - № 1. - С. 44-49.
11. Об итогах эпидемического подъема заболеваемости гриппом и ОРВИ в сезоне 2010-2011 гг. Письмо Роспотребнадзора РФ от 03.05.2011 N.01/5190-1-32. - http://www.rospotrebnadzor.ru.
12. Щелканов М. Ю., Львов Д. Н., Федякина И. Т. и др. Динамика распространения пандемического гриппа N1swl на Дальнем Востоке в 2009 г. // Вопр. вирусол. - 2010. - № 3. - С. 10-15.
13. Gilca R., De Serries G., Boulianne N. et al. Risk factors for hospitalization and severe outcomes of 2009 pandemic H1N1 influenza in Quebec, Canada // Influenza Respir. Virus. - 2011. - Vol. 5. - P. 247-255.
14. Khandaker G., Dierig A., Rashid H. et al. Systematic review of clinical and epidemiological features of the pandemic influenza A (H1N1)2009 // Influenza Respir. Virus. - 2001. - Vol. 5. - P. 148156.
15. Newmann G., Kawaoka Y. The first influenza pandemic of the new millennium // Influenza Respir. Virus. - 2011. - Vol. 5. - P. 157166.
16. http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2010/hlnl_vpc 2010810/en//index.html.
17. http://www.who.int/csr/disease/swineflu/guidance/vaccines/ candidates/summary_hlnl_and reagents_16_apr_2011.pdf.
18. http://www.who.int/csr/disease/influenza/2010_2011_GIP_ surveillance_seasonal_review/en/.
19. http://www.who.int/csr/disease/influenza/influenzanetwork/flunet/ antiviral_susceptibility/en/index.html/.
Поступила 22.08.11
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.371:578.832.1].014.47
Ю. З. Гендон, С. Г. Маркушин, Ю. М. Васильев, И. И. Акопова, Г. Г. Кривцов
Повышение иммуногенности инактивированной вакцины из штамма вируса гриппа а/калифорния/7/09 (НШ1) при использовании в качестве адъюванта хитозана и анализ антигенной специфичности этого штамма вируса гриппа
НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН, Москва
Добавление хитозана в качестве адъюванта к субъединичной вакцине из штамма вируса гриппа свиного происхождения А/Калифорния/7/09 (н1Ш1) повышает иммуногенность вакцины в 8-16 раз и существенно защитную эффективность этого препарата. Однократная вакцинация вакциной с хитозаном индуцирует образование антител в титрах, сходных с титрами при двукратной вакцинации без хитозана. Хитозан стабилизирует иммуногенность субъединичной вакцины при хранении при 4° С. не обнаружено какое-либо существенное сходство антигенной специфичности штамма А/Калифорния/7/09 (н1Ш1) со штаммами вирусов гриппа человека А/Брисбен/59/07 (н1Ш1) и А/Соломоновы острова/3/06 (№N1), входивших в состав гриппозных вакцин эпидемических сезонов 2008/2009 и 2007/2008 гг. соответственно, а также со штаммами вирусов гриппа человека нШ1, циркулировавшими около 30 лет назад.
Ключевые слова: адъювант, хитозан, грипп, вакцина
increasing the immunogenicity of inactivated chitosan adjuvanted vaccine from A/Califomia/7/09 (H1№) strain and analyzing the antigenic specificity of this influenza virus strain
Yu. Z. Ghendon, S. G. Markushin, Yu. M. Vasiliev, 1.1. Akopova, G. G. Krivtsov
I. I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Контактная информация:
Васильев Юрий Михайлович, канд. биол. науч. ст. науч. сотр.; e-mail: yury.m.vasiliev@gmail.com
28
Addition of chitosan as an adjuvant to subunit vaccine from the swine origin influenza virus A/California/7/09 (H1N1) increases vaccine immunogenicity by 8-16 times and significantly enhances its protective potency. Single immunization with chitosan adjuvanted vaccine induced similar antibody titers as two immunizations with unadjuvanted vaccine. Chitosan stabilized the immunogenicity of subunit vaccine when stored at 4° C. The antigenic specificity of the A/California/7/09 (H1N1) virus strain did not resemble substantially that of the human influenza strains A/Brisbane/59/07 (H1N1) and A/Solomon isles/3/06 (H1N1), which are among the 2008/2009 and 2007/2008 seasonal influenza vaccines, respectively, as well as that of the human influenza H1N1 virus strains that circulated about 30 years ago.
Key words: adjuvant, chitosan, influenza, vaccine
В марте 2009 г. в Мексике был выделен вирус гриппа A/H1N1 свиного происхождения, способный инфицировать людей и передаваться от человека к человеку. Этот вирус вызывал заболевания гриппом во многих странах мира, и Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определила сложившуюся ситуацию как пандемию гриппа, хотя с этим определением не все согласны [3].
Тем не менее при пандемии гриппа необходимо вакцинировать значительно большее количество людей, чем при сезонных эпидемиях гриппа, и в очень короткие сроки, в связи с чем крайне важно иметь вакцины, обладающие повышенной иммуногенностью, что может позволить снизить дозу антигена и как следствие вакцинировать большее количество людей при ограниченной мощности производства гриппозных вакцин, а также индуцировать защитный иммунитет даже при однократной иммунизации.
Имеются данные, что при добавлении к инактивированным гриппозным вакцинам адъювантов иммуногенность вакцин существенно повышается [1, 4]. В настоящее время для инактивированных гриппозных вакцин используют лишь несколько адъювантов - адъюванты на основе алюминия, например гидроксид алюминия, и на основе сквалена (MF59, AS03). В клинических исследованиях расщепленной вакцины из штамма А/Калифорния/7/09 (H1N1) (вирус гриппа свиного происхождения) было обнаружено, что при использовании адъюванта AS03A вакцина в дозе 5,25 мкг гемагглютинина оказалась столь же иммуногенной, что и вакцина без адъюванта, но при дозе гемагглютинина 21 мкг [31]. Однако при использовании аналогичной вакцины с этим адъювантом наблюдалась высокая реактогенность у 87,5% добровольцев в возрасте 18-60 лет и у 65% в возрасте 60 лет уже после однократной вакцинации [32]. При вакцинации детей в возрасте от 6 мес до 12 лет расщепленной вакциной из того же штамма вируса с аналогичным адъювантом (AS03В, содержащим меньшее количество токоферола, чем AS03A) или цельновирионной вакциной из того же штамма вируса иммуногенность, а также реактогенность расщепленной вакцины с адъювантом оказались значительно выше, чем цельновирионной вакцины без адъюванта [34]. В других исследованиях реактогенность аналогичной вакцины с адъювантом AS03В также была высокой: среди детей в возрасте от 6 до 35 мес болевые реакции в месте введения вакцины отмечались у 35% после первой вакцинации и у 41% после второй, а повышение температуры до 37,5°С и выше - у 20% детей после первой вакцинации и у 67% после второй [5]. В исследовании субъединичной вакцины из штамма А/Калифорния/7/09 (H1N1) с адъювантом MF59 в дозе 3,75 мкг высокие титры антител наблюдались уже после однократной вакцинации добровольцев, однако ряд местных и системных реакций на вакцинацию отмечен у 90% вакцинированных и более [10]. При использовании в качестве адъюванта гидроксида алюминия расщепленная вакцина из штамма А/Калифорния/7/09 (H1N1) оказалась менее иммуногенной, чем вакцина в той же дозе, но без этого адъюванта [25, 37]. Кроме того, имеются данные о неблагоприятных реакциях у вакцинированных при использовании этого адъюванта [4, 26, 37]. Следует также отметить, что при вакцинации детей расщепленной вакциной из штамма А/Калифорния/7/09
(H1N1) без какого-либо адъюванта иммуногенность этого препарата была достаточно низкой: титры антител 1:40 и выше при вакцинации детей выявлялись у 5,9% детей в возрасте от 6 мес до 3 лет, а среди детей в возрасте от 3 до 9 лет - у 34,9% [28].
В исследованиях, проведенных нами ранее [13, 14], было показано, что при добавлении в качестве адъюванта хитозана к инактивированным вакцинам из вирусов гриппа человека, а также вирусов птиц, вводимым внутримышечно, существенно повышалась иммуногенность этих препаратов, и высокие титры антител индуцировались даже при значительном снижении дозы антигена и однократной иммунизации.
Хитозан - линейный полисахарид, состоящий из произвольно распределенных Р-(1-4)-связанных D-глюкозамина (деацетилированная единица) и ^ацетил^-глюкозамина (ацетилированная единица). Хитозан (хитин) - неаллергенное, биодеградируемое, биосовместимое вещество, а производные хитина широко используются в медицине, ветеринарии, косметической и фармацевтической промышленности, а также как пищевые добавки [20, 21, 33].
В задачу настоящего исследования входило изучение способности хитозана как адъюванта повышать иммуно-генность инактивированной вакцины, приготовленной из штамма вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (H1N1) свиного происхождения, а также исследовать наличие антигенного перекреста штаммов А/Калифорния/7/09 (H1N1) с рядом штаммов вируса гриппа человека, циркулировавших в различное время.
Материалы и методы
Хитозан. Препарат 1% раствора хитозана (молекулярная масса 300 кДа, деацетилирован на 85%; получен в НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН) в 0,2 М глутаматном буфере добавляли в равном объеме к вакцине или инактивированным вирусам (конечная концентрация хитозана 0,5%) или препарат 1% хитозана разводили в 4 раза 0,2 М глутаматным буфером до концентрации хитозана 0,25% и добавляли в равном объеме к вакцине (конечная концентрация хитозана в вакцине 0,125%).
Антигены. Использовали субъединичную вакцину из штамма вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (H1N1) NYMС Х-179А, производного от штамма А/Калифорния/7/09 (H1N1), произведенную на заводе «Иммунопрепарат» ФГПУ НПО «Микроген». Кроме того, в качестве антигенов использовали штаммы вирусов гриппа человека серотипа H1N1 - А/Брисбен/59/07, А/Соломоновы острова/3/06, А/Чили/1/83, А/Дунедин/6/83, А/Москва/904/77, выращенные в куриных эмбрионах и инактивированные формалином.
Иммунизация. В каждой экспериментальной группе использовали 4-6 мышей Balb/с массой 12-14 г в возрасте 6-8 нед. Мышей вакцинировали, вводя внутримышечно по 0,2 мл антигена, содержащего 3 мкг гемагглютинина и 0,5 или 0,125% хитозана либо глутаматный буфер вместо хитозана (контрольная группа). Мышей вакцинировали однократно или двукратно. Вторую вакцинацию проводили через 21 день после первой теми же антигенами. Кровь брали на 21-й дань после первой и на 10-й день после второй вакцинации при эфирном наркозе.
29
Анализ задерживающих гемагглютинацию и нейтрализующих антител. Сыворотки мышей обрабатывали RDE, после чего готовили двукратные разведения сывороток, начиная с 1:20, и определяли титр антител в реакции задержки гемагглютинации и в реакции нейтрализации по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ. Реакцию ставили с гомологичными или в ряде опытов с антигенно отличными штаммами вирусов гриппа человека НШ1, выделенными в разные годы во время сезонных эпидемий гриппа.
Анализ защитной эффективности вакцины. Мышей вакцинировали двукратно по вышеописанной схеме, вводя внутримышечно 0,2 мл вакцины с хитозаном в концентрации 0,5 или 0,125%. В качестве антигена использовали вакцину из штамма вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (Н1Ш). Через 10 дней после второй иммунизации мышей инфицировали интраназаль-но живым вирусом А/Калифорния/7/09 (H1N1), вводя по 0,1 мл с 100 ЭИД50/0,1 мл или 1000 ЭИД50/0,1 мл этого вируса. На 3-и сутки после инфицирования проводили эвтаназию мышей и в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» извлекали легкие, из которых готовили 10% суспензию на физиологическом растворе и определяли титр вируса в суспензии титрованием на куриных эмбрионах. В контрольной группе использовали мышей, вакцинированных препаратами без хито-зана, а также невакцинированных мышей.
Статистическая обработка. Анализировали данные 3-4 опытов в каждой серии исследований. Значимость различия средних определяли с помощью критерия Стью-дента. Различия с доверительной вероятностью р < 0,05 считали статистически значимыми.
Результаты
Влияние хитозана на иммуногенностъ инактивированных препаратов вируса гриппа А/HINI
В этих опытах мышей вакцинировали однократно или двукратно субъединичной вакциной, полученной из штамма вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (H1N1), или инактивированным штаммом вируса гриппа человека, штамм А/Брисбен/59/07 (H1N1). Содержание хитозана составляло 0,5 или 0,125% в вакцине и 0,5% в инактивированном препарате вируса. В контрольной группе вместо хитозана добавляли глутаматный буфер.
Полученные данные (табл. 1) показали, что добавление к вакцине хитозана в концентрации 0,125% увеличивало титры задерживающих гемагглютинацию антител после однократной иммунизации в 16 раз, а после двукратной иммунизации - в 8 раз, при этом титры антител после однократной иммунизации с хитозаном были выше титров антител при двукратной иммунизации без хитозана.
После вакцинации той же вакциной, но с 0,5% хитоза-на, титры антител при однократной иммунизации также увеличивались в 16 раз, а при двукратной иммунизации - в 2 раза в сравнении с титрами при вакцинации без хи-тозана.
Сходные данные получены при однократной и двукратной вакцинации инактивированным вирусом гриппа человека, штамм А/Брисбен/59/07 (H1N1), с 0,5% хитозана. Это свидетельствует о том, что хитозан в равной степени повышает титры антител при вакцинации мышей как вирусом гриппа свиного происхождения, так и вирусом гриппа человека.
Таким образом, эти исследования показали, что хи-тозан способен существенно повышать иммуноген-ность субъединичной вакцины из штамма вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (H1N1), а также инактивированного препарата из штамма вируса А/Брисбен/59/07 (H1N1).
Таблица 1
Влияние хитозана на иммуногенность инактивированных препаратов вируса гриппа А/НШ1
Титры антител,
Препарат и вариант иммунизации задерживающих гемагглю-
тинацию (1/x)
Хитозан 0,125%, Однократная Без хитозана 80
вакцина из штамма А/Калифорния/7/09 вакцинация С хитозаном 1280
(H1N1) Двукратная Без хитозана 640
вакцинация С хитозаном 5120
Хитозан 0,5%, Однократная Без хитозана 80
вакцина из штамма А/Калифорния/7/09 вакцинация С хитозаном 1280
(H1N1) Двукратная вакцинация Без хитозана С хитозаном 640 1280
Хитозан 0,5%, инак- Двукратная Без хитозана 320
тивированный вирус вакцинация С хитозаном 2560
А/Брисбен/59/07 (H1N1)
Примечание. Мышей вакцинировали однократно или двукратно субъединичной вакциной из штамма А/Калифорния/7/09 (H1N1) или инактивированным препаратом вируса гриппа человека, штамм А/Брисбен/59/07 (H1N1). К препаратам вирусов добавляли хитозан в концентрации 0,125 или 0,5% или физиологический раствор (контрольная группа).
Влияние хитозана на защитную эффективность вакцины из штамма вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (MINI)
Защитную эффективность субъединичной вакцины из штамма вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (H1N1) с добавлением хитозана (0,5 или 0,125%) или без адъюванта изучали путем двукратной иммунизации мышей с последующим заражением живым вирусом того же штамма в дозе 100 эИД50/0,1 мл или 1000 ЭИД50/0,1 мл и определением титров вируса в суспензии легких мышей.
В первом опыте при использовании дозы заражения 100 ЭИД50/0,1 мл в суспензии легких невакцинированных, но инфицированных вирусом мышей титр вируса составлял 105,0 ЭИД^/0,1 мл. В легких мышей, иммунизированных вакциной без хитозана, титр вируса составлял
104.5 ЭИД50/0,1 мл, а в легких мышей, иммунизированных вакциной с 0,5% хитозаном, вирус не выявлялся.
Во втором опыте, в котором концентрация хитозана в вакцине составляла 0,125%, а доза заражения - также 100 ЭИД50/0,1 мл, титр вируса в легких невакцинированных, но инфицированных мышей составлял 104,5 ЭИД/0,1 мл, в легких мышей, иммунизированных вакциной без хито-зана, - 102,0 ЭИД5/0Д мл, а в легких мышей, иммунизированных вакциной с хитозаном, - 101,0 ЭИД/0,1 мл.
В другом опыте при дозе заражения 1000 ЭИД^/0,1 мл титр вируса в легких неиммунизированных мышей составлял 107,0 ЭИД^/0,1 мл, в легких мышей, иммунизированных вакциной без хитозана, - 106,0 ЭИД50/0,1 мл, в легких мышей, иммунизированных вакциной с 0,5% хитозана, -
104.5 ЭИД50/0,1 мл, а в легких мышей, иммунизированных вакциной с 0,125% хитозана, - 105,0 ЭИД50/0,1 мл.
Результаты этих опытов свидетельствуют о том, что хитозан способен существенно повышать защитную эффективность субъединичной вакцины из штамма вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (H1N1), однако повышение защитной эффективности при добавлении 0,125% хитоза-на оказалось несколько меньшим, чем при концентрации хитозана 0,5% при заражении как 100 ЭИД/0,1 мл, так и 1000 ЭИД50/0,1 мл.
Влияние хитозана на стабильность иммуногенных свойств гриппозной вакцины при хранении
Были проведены исследования стабильности иммуногенных свойств субъединичной вакцины из штамма виру-
30
Таблица 2
Анализ антигенной специфичности штамма вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (H1N1) и некоторых штаммов вируса гриппа человека НШ1, выделенных в разное время
Реакция Штамм-антиген (инактивированный вирус) А/Калифорния/7/09 А/Брисбен/59/07 А/Соломоновы острова/3/06 А/Чили/1/83 А/Дунедин/6/83 А/Москва/904/77
А/Калифорния/7/09 480* < 20 < 20 < 20 < 20 < 20
Задержки А/Брисбен/59/07 < 20 960 160 < 20 < 20 < 20
гемаг- острова/3/06 < 20 640 2560 < 20 < 20 < 20
глютина-
ции А/Чили/1/83 < 20 < 20 < 20 160 20 20
А/Дунедин/6/83 < 20 < 20 < 20 40 1280 40
А/Москва/904/77 < 20 < 20 < 20 20 20 1280
А/Калифорния/7/09 20 480 < 20 < 20 < 20| < 20 < 20
А/Брисбен/59/07 < 20 2560 640 < 20 < 20 < 20
Нейтра- острова/3/06 < 20 640 20 480 < 20 < 20 < 20
лизации
А/Чили/1/83 < 20 < 20 < 20 640 40 60
А/Дунедин/6/83 < 20 < 20 < 20 20 640 40
А/Москва/904/77 < 20 < 20 < 20 160 40 640
П р и м е ч а н и е. Мышей двукратно иммунизировали инактивированными препаратами вирусов гриппа с добавлением 0,5% хитозана.
Полученные сыворотки обрабатывали RDE и ставили реакцию задержки гемагглютинации и нейтрализации, начиная с разведения 1:20; * - титры антител, задерживающих гемагглютинацию (1/x).
са гриппа А/Калифорния/7/09 (НШ1) при хранении при 4°С. Вакцина с 0,5% хитозаном и без адъюванта хранилась при 4°С в течение года. Двукратная вакцинация мышей этими препаратами показала, что вакцина, хранившаяся без хитозана, практически потеряла иммуноген-ность: титр задерживающих гемагглютинацию антител до хранения составлял 1:640, а после хранения - менее 1:40. В то же время иммуногенность вакцины, хранившейся с 0,5% хитозаном, не изменилась: титр задерживающих гемагглютинацию антител до и после хранения составлял 1:5120.
Анализ антигенной специфичности штамма вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (MINI) и некоторых штаммов вирусов гриппа человека H1N1, выделенных в разное время
Имеются данные, что во время вспышек гриппа, вызванных вирусом гриппа А/Калифорния/7/09 (H1N1), заболевали преимущественно дети и лица до 30 лет, причем на эти возрастные группы приходилось до 80% всех случаев заболевания, вызванных этим вирусом [3, 16, 35]. В то же время было обнаружено, что у лиц, вакцинированных инактивированными трехвалентными вакцинами эпидемических сезонов 2008/2009 и 2007/2008 гг., содержащими в качестве компонента H1N1 штамм А/Брисбен/59/07 (H1N1) и штамм А/Соломоновы острова/3/06 (H1N1) соответственно, наблюдалась частичная защита от инфекции вирусом А/Калифорния/7/09 (H1N1) [11, 24, 29]. В связи с этими данными мы исследовали наличие определенного сходства антигенной специфичности штамма вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (H1N1) со штаммами вирусов гриппа А/Брисбен/59/07 (H1N1) и А/Соломо-новы острова/3/06 (H1N1), а также с некоторыми другими штаммами вируса гриппа человека серотипа H1N1, циркулировавшими около 30 лет назад - А/Чили/1/83, А/Дунедин/6/83, А/Москва/904/77. С этой целью мы получили препараты этих штаммов вирусов гриппа, инактивированных формалином, с добавлением 0,5% хитозана, и провели двукратную иммунизацию мышей. Полученные сыворотки обрабатывали RDE и определяли титры задерживающих гемагглютинацию и нейтрализующих антител в реакции с гомологичными и антигенно отличными вирусами гриппа H1N1 по методике, рекомендованной ВОЗ.
Результаты опытов, представленные в табл. 2, показали, что для штамма А/Калифорния/7/09 (H1N1) задерживающие гемагглютинацию и нейтрализующие антитела в антисыворотке к этому вирусу выявлялись лишь при реакции с гомологичным штаммом вируса.
У штаммов А/Брисбен/59/07 (H1N1) и А/Соломоновы острова/3/06 (H1N1) антитела в антисыворотках выявлялись в высоких титрах в реакции с гомологичным штаммом вируса, а также в 1/4—1/6 титра в реакции задержки ге-магглютинации и 1/4-1/32 титра в реакции нейтрализации между этими двумя антигенно отличными штаммами.
При реакции антисывороток против штаммов вирусов гриппа, циркулировавших около 30 лет назад, со штаммами А/Калифорния/7/09 (H1N1), А/Брисбен/59/07 (H1N1) и А/Соломоновы острова/3/06 (H1N1) задерживающие гемагглютинацию и нейтрализующие антитела не выявлялись.
Таким образом, в реакции как задержки гемагглютина-ции, так и нейтрализации не обнаруживали существенного сходства антигенной специфичности между штаммом А/Калифорния/7/09 (H1N1) и штаммамиА/Брисбен/59/07 (H1N1) и А/Соломоновы острова/3/06 (H1N1), а также между этими штаммами и изученными нами штаммами вируса гриппа человека H1N1, циркулировавшими около 30 лет назад. В то же время у штаммов А/Брисбен/59/07 (H1N1) и А/Соломоновы острова/3/06 (H1N1), а также штаммов вируса гриппа, циркулировавших в 1977-1983 гг., выявлялось некоторое сходство антигенной специфичности.
Обсуждение
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что добавление в качестве адъюванта хитозана к субъединичной вакцине из штамма вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (H1N1) существенно повышает иммуногенность как при однократной, так и при двукратной иммунизации, а также защитную эффективность этого препарата при двукратной вакцинации животных (мышей).
В сравнении с данными, полученными нами ранее в опытах с вакцинами против вирусов гриппа человека, а также птиц [13, 14], повышение иммуногенности вакцины из вируса гриппа свиного происхождения с добавле-
31
нием в качестве адъюванта 0,5% хитозана оказалось примерно таким же.
Можно полагать, что хитозан может быть оптимальным адъювантом для вакцин из вирусов гриппа не только человека, но и животных.
Имеются данные о том, что около 1,3 млн доз инактивированной вакцины против вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (НШ1), изготовленных Sanofi Pasteur и расфасованных в одноразовые шприцы, были отозваны в связи со снижением иммуногенности при хранении вакцины [7], а у 12 млн доз аналогичной вакцины срок хранения был сокращен с марта-июня 2011 г. до февраля 2010 г. по той же причине [9]. В наших опытах субъединичная вакцина из штамма вируса гриппа А/Калифорния/7/09 NYMC Х-179А (H1N1), изготовленная в России и хранившаяся при 4°С в течение года, полностью потеряла имму-ногенность. В то же время эта же вакцина с 0,5% хитозана, хранившаяся в тех же условиях в течение такого же срока, полностью сохранила иммуногенность. Эти данные свидетельствуют о стабилизирующих свойствах хитозана.
Как отмечалось выше, при анализе инфекционности вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (H1N1) были получены данные о том, что основная заболеваемость гриппом, вызванная этим штаммом, приходилась на людей моложе 30 лет [3, 16, 35]. Следует упомянуть, что во время пандемии гриппа 1977 г., вызванной вирусом гриппа человека А/СССР/90/77 (H1N1), болели преимущественно лица в возрасте до 20 лет. Это объяснялось тем, что серотип вируса гриппа человека H1N1 исчез из циркуляции в 1957 г., т. е. за 20 лет до рассматриваемой ситуации, и все люди, родившиеся после 1957 г., не имели иммунитета к серотипу H1N1. При этом необходимо отметить, что по антигенной специфичности штаммы вируса гриппа серотипа H1N1, циркулировавшие до 1958 г., и штаммы 1977 г. практически не различались [2]. В связи с этими данными можно было предположить, что более 30 лет назад среди людей циркулировал вирус гриппа H1N1, который имел определенное сходство с вирусом А/Калифорния/7/09 (H1N1). Однако в наших исследованиях не удалось обнаружить какое-либо существенное сходство антигенной специфичности штамма вируса А/Калифорния/7/09 (H1N1) и штаммов вирусов гриппа человека, циркулировавших около 30 лет назад, - А/Чили/1/83 (НШ1), А/Дунедин/6/83 (H1N1), А/Москва/904/77 (H1N1) - в реакции как задержки гемаг-глютинации, так и нейтрализации.
При анализе заболеваемости гриппом, вызванной вирусом А/Калифорния/7/09 (H1N1), было обнаружено, что лица, вакцинированные сезонной гриппозной вакциной эпидемического сезона гриппа 2008/2009 гг., обладали некоторой защитой от вируса А/Калифорния/7/09 (H1N1) [11, 24, 29]. Между тем в проведенных нами исследованиях не выявлено какое-либо сходство антигенной специфичности штамма А/Калифорния/7/09 (H1N1) и штаммов А/Брисбен/59/07 (H1N1) и А/Соломоновы острова/3/06 (H1N1), входящих в состав сезонных вакцин эпидемических сезонов 2008/2009 и 2007/2008 гг. соответственно. Следует отметить, что данные серологических исследований, проведенных в США [6, 8], также показали отсутствие существенного сходства антигенной специфичности между штаммами А/Калифорния/7/09 (H1N1) и А/ Брисбен/59/07 (H1N1).
Какое-либо сходство антигенной специфичности между штаммом А/Калифорния/7/09 (H1N1) и сезонными штаммами вирусов гриппа человека H1N1, циркулировавших в 2007/2008 и 2008/2009 гг., а также штаммов вируса гриппа человека H1N1, циркулировавших около 30 лет назад, мы не обнаружили в реакции как задержки гемагглю-тинации, так и нейтрализации, что позволяет высказать предположение, что по крайней мере гемагглютинин этих штаммов вируса гриппа не имеет каких-либо существен-
ных сходств антигенной специфичности, достаточных для индукции антител для перекрестной защиты. Тем не менее определенную роль в частичной защите сезонных гриппозных вакцин эпидемического сезона 2007/2008 и 2008/2009 гг. от инфекции вирусом А/Калифорния/7/09 (H1N1) может индуцировать комплекс внутренних белков сезонных вирусов гриппа H1N1, которые входят в состав некоторых гриппозных вакцин, а также, возможно, нейраминидазы. Кроме того, снижение заболеваемости лиц старше 30 лет также может быть связано с частичным сходством антигенной специфичности комплекса внутренних белков, а также, возможно, нейраминидазы вируса А/Калифорния/7/09 (H1N1) и вирусов гриппа человека H1N1, циркулировавших около 30 лет назад. Следует, однако, упомянуть о том, что при использовании методики псевдотипической нейтрализации было выявлено антигенное сходство вирусов гриппа А/Калифорния/7/09 (H1N1) и А/Брисбен/59/07 (H1N1) [23].
В последнее время появились данные, свидетельствующие о том, что защита от инфекции вирусом А/Калифорния/7/09 (H1N1), повышающаяся с увеличением возраста, может быть обусловлена наличием антител к этому вирусу, которые встречаются тем чаще, чем старшие возрастные группы. Действительно, было показано, что среди лиц в возрасте до 55 лет антитела к этому вирусу обнаруживаются у 6,7%, от 56 до 65 лет - у 12,4%, от 66 до 95 лет - у 22,4% [30]. Более 50% людей, вакцинированных в 1976 г. вакциной из штамма вируса гриппа свиней А/Нью-Джерси/8/76 (H1N1), имели антитела к вирусу А/Калифорния/7/09 (НШ1) [19]. По данным СDС, примерно у 1/3 пожилых лиц в США обнаружили определенный уровень иммунитета к вирусу А/Калифорния/7/09 (H1N1) [8].
В ряде исследовании обнаружено определенное сходство антигенной специфичности пандемического вируса гриппа человека H1N1 1918 г. и вируса А/Калифорния/7/09 (H1N1). Так, исследования, проведенные в Австралии, показали, что у лиц старше 85 лет, переболевших гриппом в 1918 г., присутствовали антитела в достаточно высоких титрах к вирусу А/Калифорния/7/09 (H1N1) [15]. Было также показано, что моноклональные антитела, полученные на основе В-клеток людей, родившихся до 1915 г., могут нейтрализовать гемагглютинин вирусов гриппа H1N1 1918 г. и А/Калифорния/7/09 (H1N1) [22]. Обнаружено, что иммунологическая память В-клеток может сохраняться по крайней мере 90 лет. Так, В-клетки людей, родившихся в 1915 г. и болевших гриппом в 1918 г, при реакции с восстановленным штаммом вируса гриппа 1918 г., секретировали антитела, нейтрализующие гемаг-глютинин вируса гриппа человека 1918 г., а моноклональные антитела, полученные на основе этих В-клеток, также нейтрализовали гемагглютинин вируса гриппа свиней H1N1 1930 г. [36].
Следует отметить, что мыши, вакцинированные вирусом гриппа 1918 г. или классическим вирусом гриппа свиней H1N1 (1918-1943 гг.), были защищены при последующей инфекции вирусом гриппа А/Калифорния/7/09 (H1N1) [27].
При изучении клеточного иммунитета людей до начала циркуляции вируса гриппа А/Калифорния/7/09 (H1N1) было обнаружено, что у большинства взрослых людей СD8+ Т-клетки обладали определенной активностью к вирусу А/Калифорния/7/09 (H1N1). Это объяснялось малой вариабельностью эпитопов вируса А/Калифорния/7/09 (H1N1) и сезонных вирусов гриппа, распознаваемых этими клетками [18]. Было также показано, что СD8+ Т-клетки, появляющиеся при инфекции вирусом А/Калифорния/7/09 (H1N1), могут распознавать определенные эпитопы вирусного белка NP как вируса А/Калифорния/7/09 (H1N1), так и вируса H1N1 1918 г [17].
32
Можно полагать, что иммунологическая память, накопленная за годы контактов людей с вирусами гриппа как при гриппозной инфекции, так и при вакцинациях, может обеспечить по крайней мере частичную защиту и существенное снижение тяжести течения инфекции при появлении новых антигенных вариантов вируса, в том числе вируса А/Калифорния/7/09 (НШ1), при этом определенную роль могут играть как антитела, так и клеточный иммунитет.
Не исключено, что важную роль в защите пожилых людей от инфекции вирусом А/Калифорния/7/09 (НШ1) играет пандемический вирус НШ1 1918 г, перешедший затем к свиньям и циркулировавший среди этих животных без особых изменений антигенной специфичности до 1990 г. [12]. В дальнейшем стали возникать реассор-тантные вирусы гриппа свиней, но и вирусы НШ1 продолжали циркулировать наряду с другими серотипами [12]. Время от времени вирусы гриппа свиней НШ1 инфицировали людей, но без передачи инфекции от человека к человеку [3]. Таким образом, можно предположить, что вирус гриппа свиней А/Калифорния/7/09 (НШ1) является дальним родственником вируса гриппа НШ1, вызвавшего пандемию 1918 г., который после перехода к свиньям и долгих лет циркуляции среди них в результате неизвестных пока мутаций вновь вернулся к людям, приобретя способность передаваться от человека к человеку, но сохранив некоторые белки или участки белка своего далекого предшественника, с которыми иммунная система людей была знакома 90 лет назад, но и это давнее знакомство позволяет в той или иной степени противостоять инфекции новым потомком вируса 1918 г., а это противостояние тем больше, чем ближе по возрасту люди ко времени появления пандемического штамма вируса гриппа 1918 г. Что же касается защитного действия сезонных гриппозных вакцин эпидемических сезонов 2007/2008 и 2008/2009 гг. в отношении вируса А/Калифорния/7/09 (НШ1), то механизм этой защиты пока неясен.
ЛИТЕРАТУРА
1. Васильев Ю. М. Адъюванты гриппозных вакцин - современное состояние // Журн. микробиол. - 2010. - № 1. - С. 100-110.
2. ГендонЮ. З. Пандемии гриппа: предположения и факты // Журн. микробиол. - 2008. - № 5. - С. 109-118.
3. ГендонЮ. З. Свиной грипп Н1Ш/Калифорния - страсти и факты // Журн. микробиол. - 2010. - № 4. - С. 105-114.
4. Aguilar J., Rodriguez E. Vaccine adjuvants revisited // Vaccine. -2007. - Vol. 25. - P. 3752-3762.
5. Carmona A., Omenaca F., Tejedor J. et al. Immunogenicity and safety of AS03-adjuvanted 2009 influenza A H1N1 vaccine in children 6-35 months // Vaccine. - 2010. - Vol. 28. - P. 5837-5844.
6. CDC. Effectiveness of 2008-09 trivalent influenza vaccine against 2009 pandemic influenza A (H1N1) - United States, May-June 2009 // MMWR. - 2009. - Vol. 58. - P. 1241-1245.
7. CDC. Non-safety-related voluntary recall of Sanofi Pasteur 2009 H1N1 flu vaccine in pre-filled syringes (February 2010) // http://cdc. gov/h1n1flu/vaccination/qa_recall.htm.
8. CDC. Serum cross-reactive antibody response to a novel influenza A (H1N1) virus after vaccination with seasonal influenza vaccine // MMWR. - 2009. - Vol. 58. - P. 521-524.
9. CDC. Shortened expiration period for Sanofi Pasteur 2009 H1N1 vaccine in pre-filled syringes questions & answers // http://cdc.gov/ h1n1flu/vaccination/qa_expiration.htm.
10. Clark T, Pareek M., Hoschler K. et al. Trial of 2009 influenza A (H1N1) monovalent MF59-adjuvanted vaccine // N. Engl. J. Med. -2009. - Vol. 361. - P. 2424-2435.
11. Garcia-Garcia L., Valdespino-Gomez J., Lazcano-Ponce E. et al. Partial protection of seasonal trivalent inactivated vaccine against novel pandemic influenza A/H1N1 2009: case-control study in Mexico City // Br. Med. J. - 2009. - Vol. 339. - b3928.
12. Garten R., Davis C., Russell C. et al. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans // Science. - 2009. - Vol. 325. - P. 197-201.
13. Ghendon Y., Markushin S., Krivtsov G. et al. Chitosan as an adjuvant for parenterally administered inactivated influenza vaccines // Arch. Virol. - 2008. - Vol. 153. - P. 831-837.
14. Ghendon Y., Markushin S., Vasiliev Y. et al. Evaluation of properties of chitosan as an adjuvant for inactivated influenza vaccines administered parenterally // J. Med. Virol. - 2009. - Vol. 81. - P. 494-506.
15. Gilbert G., Cretikos M., Hueston L. et al. Influenza A (H1N1) 2009 antibodies in residents of New South Wales, Australia, after the first pandemic wave in the 2009 southern hemisphere winter // PLoS One.
- 2010. - Vol. 5. - e12562.
16. GirardM., Tarn J., Assossou O. et al. The 2009 A (H1N1) influenza virus pandemic: A review // Vaccine. - 2010. - Vol. 28. - P. 48954902.
11. Gras S., Kedzierski L., Valkenburg S. et al. Cross-reactive CD8+ T-cell immunity between the pandemic H1N1-2009 and H1N1-1918 influenza A viruses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2010. - Vol. 107.
- P. 12599-12604.
18. Greenbaum J., KotturiM., Kirn Y. et al. Pre-existing immunity against swine-origin H1N1 influenza viruses in the general human population // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2009. - Vol. 106. - P. 20365-20370.
19. HancockK., Veguilla V, LuX. et al. Cross-reactive antibody responses to the 2009 pandemic H1N1 influenza virus // N. Engl. J. Med. - 2009.
- Vol. 361. - P. 1945-1952.
20. Illum L. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient // Pharm. Res. - 1998. - Vol. 15. - P. 1326-1331.
21. Illum L., Jabbal-GillI., HinchdiffeM. et al. Chitosan as a novel nasal delivery system for vaccines // Adv. Drug Deliv. Res. - 2001. - Vol. 51. - P. 81-96.
22. Krause J., Tumpey T., Huffman C. et al. Naturally occurring human monoclonal antibodies neutralize both 1918 and 2009 pandemic influenza A (H1N1) viruses // J. Virol. - 2010. - Vol. 84. - P. 31273130.
23. Labrosse B., Tourdjman M., Porcher R. et al. Detection of extensive cross-neutralization between pandemic and seasonal A/H1N1 influenza viruses using a pseudotype neutralization assay // PLoS One. - 2010. - Vol. 5. - e11036.
24. Lee V., Toy J., Chen M. et al. Inactivated trivalent seasonal influenza vaccine induces limited cross-reactive neutralizing antibody responses against 2009 pandemic and 1934 PR8 H1N1 strains // Vaccine. -2010. - Vol. 28. - P. 6852-6857.
25. Liang X., Wang H., Wang J. et al. Safety and immunogenicity of 2009 pandemic influenza A H1N1 vaccines in China: a multicentre, doubleblind, randomised, placebo-controlled trial // Lancet. - 2010. - Vol. 375. - P. 56-66.
26. LindbladE. Aluminium compounds for use in vaccines // Immunol. Cell. Biol. - 2004. - Vol. 82. - P. 497-505.
27. Manicassamy B., MedinaR., HalR. et al. Protection of mice against lethal challenge with 2009 H1N1 influenza A virus by 1918-like and classical swine H1N1 based vaccines // PLoS Pathog. - 2010. - Vol.
6. - e1000745.
28. Oh C., Lee J., Kang J. et al. Safety and immunogenicity of an inactivated split-virus influenza A/H1N1 vaccine in healthy children from 6 months to <18 years of age: a prospective, open-label, multicenter trial // Vaccine. - 2010. - Vol. 28. - P. 5857-5863.
29. Orellano P., Reynoso J., Carlino O. et al. Protection of trivalent inactivated influenza vaccine against hospitalizations among pandemic influenza A (H1N1) cases in Argentina // Vaccine. - 2010.
- Vol. 28. - P. 5288-5291.
30. Rizzo C., Rota M., Bella A. et al. Cross-reactive antibody responses to the 2009 A/H1N1v influenza virus in the Italian population in the pre-pandemic period // Vaccine. - 2010. - Vol. 28. - P. 3558-3562.
31. Roman F., Vaman T., Gerlach B. et al. Immunogenicity and safety in adults of one dose of influenza A H1N1v 2009 vaccine formulated with and without AS03A-adjuvant: preliminary report of an observer-blind, randomised trial // Vaccine. - 2010. - Vol. 28. - P. 1740-1745.
32. RomanF., Vaman T., KafejaF et al. AS03(A)-Adjuvanted influenza A (H1N1) 2009 vaccine for adults up to 85 years of age // Clin. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 51. - P. 668-677.
33. SinglaA., ChawlaM. Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects - an update // J. Pharm. Pharmacol. - 2011. - Vol. 53. - P. 1047-1067.
34. Waddington C., Walker W., Oeser C. et al. Safety and immunogenicity of AS03B adjuvanted split virion versus non-adjuvanted whole virion H1N1 influenza vaccine in UK children aged 6 months - 12 years: open label, randomised, parallel group, multicentre study // Br. Med. J. - 2010. - Vol. 340. - c2649.
35. WHO. Seroepidemiological studies of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus // Wkly Epidemiol. Rec. - 2010. - Vol. 85. - P. 229-235.
36. Yu X., Tsibane T., McGraw P. et al Neutralizing antibodies derived from the B cells of 1918 influenza pandemic survivors // Nature. -2008. - Vol. 455. - P. 532-536.
37. Zhu F., WangH., FangH. et al. A novel influenza A (H1N1) vaccine in various age groups // N. Engl. J. Med. - 2009. - Vol. 361. - P. 2414-2423.
Поступила 09.03.11
33
