CC BY
26
оригинальные исследования
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДк 615.371:578.832.1].012
Видяева И.Г., Потапчук М.В., Репко И.А., Петров С.В., Цыбалова Л.М.
высокорепродуктивные АТТЕНУИРОВАННЫЕ РЕАССОРТАНТЫ h2n2 и h7n9
на основе донора a/гоhkоhг/1/68/162/35
ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России, 197376, г. Санкт-Петербург
на основе созданного в нии гриппа штамма вируса гриппа А/гонконг/1/68/162/35 (H3N2), обладающего свойствами аттенуации и высокой репродуктивности, получены реассортантные штаммы, содержащие поверхностные антигены вирусов гриппа А потенциально пандемических вирусов A/H2N2 и A/H7N9. высокая репродуктивная активность реассортантных штаммов и иммуногенность живой и инактивированной гриппозных вакцин, полученных на их основе, определяют возможность использования их в качестве вакцинных штаммов при создании живых и инактивированных вакцин против потенциально пандемических вирусов гриппа А.
Ключевые слова: вирус гриппа; вирусные реассортанты; донор; живая гриппозная вакцина; инактивирован-ная гриппозная вакцина.
Для цитирования: Видяева И.Г., Потапчук М.В., Репко И.А., Петров С.В., Цыбалова Л.М. Высокорепродуктивные аттенуированные реассортанты H2N2 и H7N9 на основе донора А/Гонконг/1/68/162/35. Вопросы вирусологии. 2016; 61(6): 257-262.
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2016-61-6-257-262
Vidyaeva I.G., Potapchuk M.V., Repko I.A., Petrov S.V., Tsybalova L.M.
highly reproductive attenuated h2N2 and h7N9 reassortants on the basis OF
A/hong KONG/1/68/162/35 DONOR VIRUs
Research Institute of Influenza, St. Petersburg, 197376, Russian Federation
Reassortants with surface antigens from potentially pandemic A/H2N2 and A/H7N9 influenza viruses were created on the basis of attenuated and highly reproductive A/Hong Kong/1/68/162/35(H3N2) donor virus obtained in the Research Institute of Influenza. High reproductive activity of reassortant viruses and immunogenicity of live and inactivated influenza vaccines based on these viruses indicate the possibility to use obtained reassortants for production of live and inactivated vaccines against potentially pandemic influenza A viruses.
K e y w o r d s: influenza virus; virus reassortants; donor .strain; live influenza vaccine; inactivated influenza vaccine. For citation: Vidyaeva I.G., Potapchuk M.V., Repko I.A., Petrov S.V., Tsybalova L.M. Highly reproductive attenuated H2N2 and H7N9 reassortants on the basis of A/Hong Kong/1/68/162/35 donor virus. Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2016; 61(6): 257-262. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2016-61-6-257-262 For correspondence: Inna G. Vidyaeva, Candidate of Medical Sciences, Senior research scientist, Laboratory of influenza vaccines, Research Institute of Influenza, St. Petersburg, 197376, Russian Federation. E-mail: inessa2775@inbox.ru Acknowledgments. The study had no sponsorship. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Received 07April 2016 Accepted 24 May 2016
Введение
Пандемия «азиатского» гриппа 1957—1958 гг., вызванная вирусом гриппа А подтипа H2N2, унесла жизни около 2 млн человек. К 1968 г. подтип H2N2 перестал циркулировать среди людей и сохранился в популяции птиц. В настоящее время вирус циркулирует среди птиц и рассматривается как один из наиболее вероятных возбудителей новой пандемии, так как люди моложе 50 лет не обладают иммунитетом к этому подтипу. В 2014 г. в журнале Virology группой авторов опубликовано исследование 22 вирусов подтипа A/H2N2, изолированных от диких и домашних птиц, которое показало, что все они имеют низкий уровень генетической и антигенной из-
менчивости. Большая часть изолятов проявила антигенное сходство с пандемическим вирусом А/Сингапур/1/57 (Н2К2), что предполагает возможность использования вирусов, выделенных в период пандемии 1957 г., для разработки вакцин [1]. В работе С. Pappas и соавт. [2] были проанализированы возможности передачи млекопитающим (хорькам) птичьих вирусов подтипа Н2 (А/ Н2К2 и А/Н2Ю). Генетический анализ гемагглютинина (НА), полученного из носовых смывов хорьков, показал наличие мутаций в первой субъединице (НА1), включая рецепторспецифичные адаптивные мутации Gln226Leu, определяющие человеческий тип рецепторов а-2-6, что укаказывает на возможность адаптации Н2-вирусов к
Для корреспонденции: Видяева Инна Геннадьевна, канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. гриппозных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России, 197376, г. Санкт-Петербург. E-mail: inessa2775@inbox.ru
problems of virology. 2016; 61 (6)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2016-61-6-257-262 ORIGINAL REsEARcH
млекопитающим и их потенциальную опасность для человека [2].
Другими потенциально пандемическими вирусами гриппа являются штаммы подтипа Н7. В 2003 г. зафиксирована наиболее масштабная вспышка заболевания птиц, вызванного высокопатогенным вирусом А/ Н7Ы7 в Нидерландах, во время которой птичьим вирусом были заражены 89 человек, один со смертельным исходом [3]. Кроме того, периодически регистрируются вспышки низкопатогенного гриппа птиц подтипа Н7, сопровождающиеся инфицированием людей. До недавнего времени не выявлялось случаев инфицирования вирусом А/Н7К9 птиц, животных или людей. Первые сообщения об инфицировании людей этим штаммом поступили в ВОЗ 31 марта 2013 г. из Китая. К настоящему времени зарегистрировано 602 случая инфицирования людей вирусом А/Н7№ — большинство в континентальном Китае [4]. Характерной особенностью нового штамма стало большое количество случаев со смертельным исходом среди заболевших людей (примерно 36%). Результаты нескольких исследований указывают на способность вирусов А/Н7№ активно размножаться в органах мышей, хорьков и приматов, а также в клетках, выстилающих эпителий дыхательных путей человека [5, 6]. Эти явления обусловили актуальность получения вакцинных штаммов против вируса А/Н7Ж
С целью получить вакцинный реас-сортант на основе эпидемического вируса А/Н2Ш, который был бы эффективен против вероятного возбудителя пандемии, мы проанализировали изменчивость первой субъединицы НА Н2 на протяжении 10 лет циркуляции вирусов А/Н2№ и выбрали 2 штамма как основу для создания вакцины: штамм А/Япония/305/57 (Н2№), идентичный по последовательности аминокислотных остатков НА1 эталонному штамму А/Сингапур/1/57, и А/Калифорния/1/66 (Н2№), филогенетически наиболее удаленный от эталонного штамма и отражающий состояние вируса на момент его элиминации из человеческой популяции (рис. 1).
В качестве донора внутренних генов при получении реассортантов на основе вирусов А/Н2Ш и А/Н7Ш мы использовали разработанный в НИИ гриппа универсальный донор А/Гонконг/1/68/162/35 (Н3№) [7, 8], который ориентирован на получение
Рис. 1. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей гемагглютини-нов подтипов Н2 вирусов гриппа А, циркулировавших в человеческой популяции с
1957 по 1966 г.
оригинальные исследования
реассортантных штаммов как для живой (ЖГВ), так и для инактивированной (ИГВ) гриппозных вакцин. Ранее нами было показано, что донор А/Гонконг/1/68/162/35 имеет высокую репродуктивную (9—9,5 lg ЭИД50) и гемагглютинирующую (1:1024—1:2048) активность, а также маркеры аттенуации к человеку ts-, ca-фенотип. Реассортанты на основе донора А/Гонконг/1/68/162/35 наследуют ts-, ca-фенотип и приобретают более высокую инфекционную, гемагглютинирующую и репродуктивную активность. При этом они безопасны и нетоксичны для лабораторных животных [8—10].
Цель работы — получение реассортантов на основе вирусов гриппа A/H2N2 и A/H7N9 и донора внутренних генов А/Гонконг/1/68/162/35 в качестве кандидатных вакцинных штаммов, исследование их репродуктивных свойств и иммуногенности.
Материал и методы
Вирусы. А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) — А/ГК/ХА — холодоадаптированный штамм — донор аттенуации и высокой репродуктивной активности (получен в лаборатории гриппозных вакцин ФБГУ «НИИ гриппа» [патент № 2511431]. A/Shanghai/2/2013 (H7N9) — PR8-IDCDC-RG32A — реассортант, полученный методом обратной генетики на основе вируса гриппа А/Шанхай/2/2013 (H7N9) и донора А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1) (Центр по контролю и профилактике инфекционных болезней (CDC), Атланта, США). А/Калифорния/1/66 (H2N2) — эпидемический штамм, полученный из ФГБУ «НИИ-ЭМ» РАН. А/Япония/305/57 (H2N2) — эпидемический штамм из коллекции вирусов ФГБУ «НИИ гриппа».
Реассортацию проводили классическим методом в 10—11-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) [11]. Состав генома реассортантов определяли методом ОТ-ПЦР и рестрикционного анализа с использованием специально подобранных праймеров и рестриктаз. Принадлежность нейраминидазы определяли методом ОТ-ПЦР с типоспецифичными праймерами к различным субтипам. Принадлежность НА определяли в РТГА [12].
Подготовка вакцинных препаратов. Для получения ЖГВ накопленный вирусный материал реассортантных вирусов разводили фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до концентрации 6,5 ^ЭИД50/мл. Препараты ИГВ получали методом изопикнического центрифугирования
в градиенте плотности сахарозы. Инактивацию проводили 0,02% формалином. Содержание НА в вакцинных препаратах оценивали методом электрофореза в по-лиакриламидном геле с последующей денситометрией. Препараты ИГВ содержали 15 мкг НА на дозу (0,5 мл). В качестве адъюванта использовали гидроксид алюминия — 500 мкг на дозу.
Температурочувствительность и холодоадаптиро-ванность вирусов оценивали по результатам их параллельного титрования в РКЭ при оптимальной (32 °С), повышенной (39 °С) и пониженной (26 °С) температуре и выражали в виде разницы показателей инфекционной активности в ^ ЭИД/0,2 мл (соответственно RCT и
RCT26).
Иммунизация животных. Мышей линии Ва1Ь/с массой 18—20 г иммунизировали ЖГВ двукратно интра-назально в дозе 6,5 ^ ЭИД50. Препараты ИГВ вводили внутримышечно двукратно с интервалом 2 нед в дозе 15 мкг НА на мышь. Сыворотки крови забирали у 5 мышей каждой группы на 14-й день после 2-й иммунизации. Контрольные группы иммунизировали ФСБ.
Серологические исследования. Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) проводили микрометодом, реакцию нейтрализации (РН) выполняли в культуре клеток MDCK [13].
Статистическую обработку результатов проводили с помощью непараметрического критерия Манна— Уитни. Все работы с животными проводили согласно Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных [14].
Результаты
Методом прямой генетической реассортации были получены реассортанты RA-36 (А/Япония/ГК/6:2 Н2№), RA-40 (А/Калифорния/ГК/6:2 Н2№) и RА-35 (А/Шанхай/ГК/6:2 Н7Ы9), заимствовавшие поверхностные антигены от потенциально пандемических штаммов, а гены внутренних белков — от штамма-донора А/ГК/ХА, что подтверждается результатами ОТ-ПЦР-рестрикционного анализа (рис. 2).
Реассортанты, полученные на основе донора А/ГК/ХА, показали высокую репродуктивную активность в РКЭ. Гемагглютинирующая активность реассортанта ЯА-36
RA-35 (H7N9)
М Л? ft* HI ""PTr И1 я 0 м 1 ■
м # и К
■ llw * • а «QM
а ".••р. --.
J 1 • Г ™ 1
RA-36 (H2N2) и RA-40 (H2N2)
м Ш ф ш 11 м ж * «И • • м VT, m
М Ml » мм т »'т • Щ т т к * м тт: и т я м т « • «« тг
м HL0.M if" т •■|дмг т К 0 М ттт •• «
N • 0м " *. •ч j * м it: yf к ■ ¿м <гт«
Рис. 2. Геномный состав реассортантов, полученных на основе донора внутренных генов А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2). RA-36 (А/Япония/ГК/6:2 H2N2), RA-40 (А/Калифорния/ГК/6:2 H2N2) и КА-35 (А/Шанхай/ГК/6:2 H7N9).
ORIGINAL REsEARcH
Таблица 1
Биологические свойства реассортантов и родительских вирусов
Штамм Инфекционная активность при температуре, 1§ ЭИД50/0,2 мл RCT26, фенотип фенотип гае/ 50мкл
26 °C 32 °C 39 °C
A/Shanghai/2/2013 (H7N9) — PR8-IDCDC-RG32A <0,5 7,66 6,0 7,1 поп-са- 1,66 non-ts- 128—256
RA-35 А/Шанхай/ГК/6:2 (H7N9) 8,33 9,5 <0,5 1,2 са- 9,0 ts- 512—1024
А/Япония/305/57 5,0 8,5 5,5 3,5 поп-са- 3,0 non-ts- 128—256
RA-36 (А/Япония/ГК/6:2 H2N2) 6,75 9,5 2,5 2,75 са- 7,0 ts- 1024
А/Калифорния/1/66 2,75 8,5 2,0 5,75 поп-са- 6,5 ts- 64—128
RA-40 (А/Калифорния/ГК/6:2 H2N2) 6,75 9,5 <0,5 2,75 са- 9,0 ts- 1024
А/ГК/1/68/162/35 8,5—9,5 9,0—10,0 1,5 0,5 са- 7,5 ts- 1024—2048
Таблица 2
Антигенная специфичность реассортанта А/Шанхай/Гк/6:2 (H7N9) в РТГА
Сыворотки, титр в РТГА Тестируемые вирусы
A/Шанхай/2/2013 (H7N9) АШанхай/ГК/6:2 (H7N9)
А(Ы1Ш^т09 (160) <10 <10
А(И1Ш) (160) <10 <10
А(Ы2Ш) (160) <10 <10
А(Ы3Ш) (320) <10 <10
В(320) <10 <10
А(Ы7Ы9) (640) 640 640
А(Ы7Ю) (640) 320 320
составила 1:1024 ГАЕ, RA-40 — 1:2048 ГАЕ, RA-35 — 1:1024, что соответствует повышению титра вируса в 4—8 раз по сравнению с исходными вариантами для всех штаммов. Инфекционная активность в РКЭ возросла на 1—2 ^ ЭИД50/0,2 мл и достигла 9,5 ^ ЭИД50/0,2 мл (табл. 1).
Все полученные реассортанты наследовали от штамма-донора А/Гонконг/1/68/162/35 ts-, са-фенотип — спо-
собность хорошо репродуцироваться при пониженной температуре и почти полную потерю способности к репродукции при повышенной температуре (см. табл. 1). Для оценки генетической стабильности реассортант-ных вакцинных штаммов их 5-кратно пассировали при 32°С в системе РКЭ. Все вирусы после пассирования сохранили фенотипические характеристики, присущие исходным вариантам. Степень температурочувствитель-ности и холодоадаптированности, а также уровень репродукции не изменялись при 5-кратном пассировании. Таким образом, реассортантные штаммы удовлетворяют требованиям температурочувствительности и холодовой адаптации, предъявляемым к вакцинным штаммам для ЖГВ, и высокой репродуктивности для ИГВ.
При исследовании антигенной специфичности полученных реассортанатов в РТГА было показано, что все они не реагировали с гетерологичными типоспецифи-ческими сыворотками. Реассортант А/Шанхай/ГК/6:2 (Н7Ы9) реагировал со специфическими иммунными крысиными сыворотками типа А/ЫЖ9 и А/Ы7Ю (табл. 2). При исследовании специфичности вирусов Ы2К2 было выявлено наличие перекрестного антигенного взаимодействия (табл. 3), что соответствует данным литературы [15] и результатам, полученным в наших исследованиях иммунных сывороток мышей (рис. 3, 4).
I-х 4096-,
го
X S 1024-
Q
> а 256-
s
s 64-
Q
Е 16-
л
2 0) 4-
S
X 1-
га
t
О
А/Япония/ГК РТГА
I
J0 ^ J9 <5> <5>
N х<5 о о
а
л
t о
4096п 1024 256Н 64 164 4 1
б
А/Калифорния/ГК РТГА
IX 4096-,
а
X S § 1024-
Q
fc 256-
s
S I- 64-
Q
Е 16-
а
5 а) 4-
5
X 1-
л
t
О
А/Шанхай/ГК РТГА
l
Рис. 3. Титры гемагглютинирующих антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных ЖГВ и ИГВ на основе вирусов Н2№
(а, б) и Н7№ (в).
Здесь и на рис. 4: ГШ — гетерологичный штамм.
оригинальные исследования
а
4096п 1024256641641-
А/Япония/ГК РН
X,
А/Калифорния/ГК РН
X
О л О
4096п 1024 256-1 64 16 4 1
О л о
^ £ #
А/Шанхай/ГК РН
а
Ш X
О
4096 1024 256-| 64 16-| 4 1
Рис. 4. Титры нейтрализующих антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных ЖГВ и ИГВ на основе вирусов Н2№ (а, б)
и Н7№ (в).
Препараты ЖГВ и ИГВ, подготовленные на основе реассортантных штаммов, использовали для иммунизации мышей и исследования иммуногенности. Данные по содержанию антигемагглютинирующих и нейтрализующих антител к вирусам гриппа в сыворотках крови мышей, иммунизированных препаратами ЖГВ и ИГВ реассортантных штаммов (см. рис. 3, 4), демонстрируют достоверное (£ < 0,05) повышение уровня антигемагглю-тинирующих и вируснейтрализующих антител по сравнению с контрольными животными во всех группах.
После иммунизации ИГВ на основе реассортантных вирусов А/Калифорния/ГК/6:2 (Н2№), А/Япония/ГК/6:2 (Н2К2) и А/Шанхай/ГК/6:2 (Н7К9) в сыворотках мышей были выявлены антигемагглютинирующие и вирусней-трализующие антитела в титрах, достаточных для формирования защитного иммунитета (СГТ в РТГА от 403 до 1940,1, в РН — от 640 до 1940,1) (см. рис. 3, 4). В случае штаммов Н2К2 в сыворотках мышей выявлялись антигемагглютинирующие и нейтрализующие антитела как к штамму, на основе которого были получены вакцины, так и к гетерологичному штамму того же подтипа, что позволяет предполагать широкий спектр действия вакцин в рамках подтипа вируса гриппа А/Н2К2.
Заключение
Работы по созданию вакцин против пандемических вирусов гриппа ведутся во всем мире, ряд вакцин прошли или проходят испытания на приматах и людях. Это в
основном вакцины, полученные на основе штаммов вируса гриппа А/Н2К2, циркулировавших в человеческой популяции с 1957 по 1968 г., или на основе современных штаммов животного происхождения [16— 19]. Аналогичные работы ведутся и в отношении вируса гриппа А/ Н7Ш [15, 20, 21]. Во всех случаях проводились исследования либо живых, либо инактивированных вакцин. В нашем исследовании одни и те же штаммы использовались для получения и живой, и инактивированной вакцины и в обоих случаях показали аттенуированность, высокую репродуктивность, а препараты, полученные на их основе, — высокую иммуногенность. Можно заключить, что все исследованные штаммы обладают набором признаков, необходимых вакцинному штамму, — структурой генома, антигенной специфичностью НА соответствующих вирусов «дикого» типа, хорошей адаптацией к культивированию при пониженной температуре, температурочувствительностью, а также высоким уровнем репродукции в куриных эмбрионах. Высокие уровни титров гемагглютинирующих и нейтрализующих антител в сыворотках крови иммунизированных животных позволяют рассматривать полученные реассортан-ты RA-35 (А/Шанхай/ГК/6:2 Н7Ш), RA-36 (А/Япония/ ГК/6:2 Н2№) и RA-40 (А/Калифорния/ГК/6:2 Н2№) в качестве кандидатных вакцинных и производственных штаммов в условиях предпандемической ситуации для производства как инактивированной, так и живой гриппозной вакцины после исследований, посвященных
Таблица 3
Антигенная специфичность вирусов ^N2 в РТГА
Сыворотки, титр в РТГВ Тестируемые вирусы
А/Калифорния/1/66 Н2Ш А/Япония/305/57 Н2Ш А/Токио/3/67 Н2Ш А/Сингапур/1/57 Н2Ш А/Япония/ ГК/6:2 Н2Ш А/Калифорния/ ГК/6:2 Н2Ш
А(Н1Ш^т09 (160) <10 <10 <10 <10 <10 <10
А(Н1Ш) (160) <10 <10 <10 <10 <10 <10
А(Н3Ш) (320) <10 <10 <10 <10 <10 <10
В(320) <10 <10 <10 <10 <10 <10
А/Калифорния/1/66 Н2Ш (512) 512 256 128 256 256 512
А/Япония/305/57 Н2Ю (512) 32 512 16 128 512 128 261
original research
специфической безопасности штаммов и протективно-му действию препаратов, полученных на их основе. В настоящее время проводится цикл исследований полученных нами реассортантов в данном направлении.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 1—6, 15—21 см. REFERENCES)
7. Цыбалова Л.М., Горев Н.Е., Репко И.А., Потапчук М.В., Сергеева М.В., Киселев О.И. Вирус гриппа А/Гонконг/1/68/162/35 — универсальный донор внутренних генов для вакцинных и производственных штаммов. Патент РФ № 2511431; 2011.
8. Цыбалова Л.М., Горев Н.Е., Потапчук М.В., Репко И.А., Корот-ков А.В., Сергеева М.В. и др. Характеристика холодоадаптиро-ванного штамма вируса гриппа А/Гонконг/1/68/162/35 как потенциального донора аттенуации и высокой репродуктивности. Вопросы вирусологии. 2012; 57(6): 13—7.
9. Потапчук М.В., Репко И.А., Сергеева М.В., Коротков А.В., Комиссаров А.Б., Сандыбаев Н.Т. и др. Характеристика реас-сортантных штаммов вируса гриппа на основе нового донора A/HongKong/1/68/162/35(H3N2). Вопросы вирусологии. 2012; 57(6): 42—6.
10. Сергеева М.В. Сравнительное исследование специфической активности живой и инактивированной вакцин против потенциально пандемического гриппа на морских свинках. Медицинский академический журнал. 2012; 12(4): 52—4.
11. Александрова Г.И. Применение метода генетической реассорта-ции для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопросы вирусологии. 1997; 42(4): 387—95.
12. МУ 3.3.2.1758—03. Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. М.; 2003.
13. Соминина А.А., Кривицкая В.З., Войцеховская Е.М., Медведева Н.А., Липина Н.В., Потапенко Л.Б. Практические рекомендации по лабораторной диагностике вирусных инфекций. СПб.; 2005.
14. Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (Биоэтический кодекс). Available at: http://www.msu.ru/bioetika/ recomend.doc
REFERENCES
1. Jones J.C., Baranovich T., Marathe B.M., Danner A.F., Seiler J.P., Franks J. et al. Risk assessment of H2N2 influenza viruses from the avian reservoir. J. Virol. 2014; 88(2): 1175—88.
2. Pappas C., Yang H., Carney P.J., Pearce M.B., Katz J.M., Stevens J. et al. Assessment of transmission, pathogenesis and adaptation of H2 subtype influenza viruses in ferrets. Virology. 2015; 477: 61—71.
3. Koopmans M., Wilbrink B., Conyn M., Natrop G., van der Nat H., Vennema H. et al. Transmission of H7N7 avian influenza A virus to human beings during a large outbreak in commercial poultry farms in the Netherlands. Lancet. 2004; 363(9409): 587—93.
4. World Health Organization. Available at: http://www.euro.who.int
5. Bao L., Xu L., Zhu H., Deng W., Chen T., Lv Q. et al. Transmission of H7N9 influenza virus in mice by different infective routes. Virol. J. 2014; 11: 185.
6. Siegers J.Y., Short K.R., Leijten L.M., de Graaf M., Spronken M.I., Schrauwen E.J. et al. Novel avian-origin influenza A (H7N9) virus
attachment to the respiratory tract of five animal models. J. Virol. 2014; 88(8): 4595—9.
7. Tsybalova L.M., Gorev N.E., Repko I.A., Potapchuk M.V., Sergeeva M.V., Kiselev O.I. Influenza virus strain A/Hong Kong/1/68/162/35 — universal donor of internal genes for reassortants and reassortant strains. Patent RF N 2511431; 2011. (in Russian)
8. Tsybalova L.M., Gorev N.E., Potapchuk M.V., Repko I.A., Korotkov A.V., Sergeeva M.V. et al. Characteristics of cold-adapted strain of influenza A/Hong Kong/1/68/162/35 as a potential donor of attenuation and high fertility. Voprosy virusologii. 2012; 57(6): 13—7. (in Russian)
9. Potapchuk M.V., Repko I.A., Sergeeva M.V., Korotkov A.V., Komissarov A.B., Sandybaev N.T. et al. Characteristics of reassortant influenza virus strains based on new donor A/HongKong/1/68/162/35 (H3N2). Voprosy virusologii. 2012; 57(6): 42—6. (in Russian)
10. Sergeeva M.V. A comparative study of the specific activity of live and inactivated vaccines against potential pandemic influenza in guinea pigs. Meditsinskiy akademicheskiy zhurnal. 2012; 12(4): 52—4. (in Russian)
11. Aleksandrova G.I. Use of a method of a genetic reassortation for receiving vaccine influenza strains. Voprosy virusologii. 1997; 42(4): 387—95. (in Russian)
12. Methodical instructions 3.3.2.1758—03. Methods for determination of parameters of quality of immunobiological drugs for the prevention and diagnosis of influenza. Moscow; 2003. (in Russian)
13. Sominina A.A., Krivitskaya V.Z., Voytsekhovskaya E.M., Medvede-va N.A., Lipina N.V., Potapenko L.B. et al. Practical Recommendations for the Laboratory Diagnosis of Viral Infections [Prakticheskie rekomendatsii po laboratornoy diagnostike virusnykh infektsiy]. St. Petersburg; 2005. (in Russian)
14. International recommendations for biomedical research involving animals (Bioethics Code). Available at: http://www.msu.ru/bioetika/ recomend.doc (in Russian)
15. Duan Y., Gu H., Chen R., Zhao Z., Zhang L., Xing L. et al. Response of mice and ferrets to a monovalent influenza A (H7N9) split vaccine. PLoS One. 2014; 9(6): e99322.
16. Isakova-Sivak I., Stukova M., Erofeeva M., Naykhin A., Donina S., Petukhova G. et al. H2N2 live attenuated influenza vaccine is safe and immunogenic for healthy adult volunteers. Hum. Vaccin. Immu-nother. 2015; 11(4): 970—82.
17. Broadbent A.J., Santos C.P., Paskel M., Matsuoka Y., Lu J., Chen Z. et al. Replication of live attenuated cold-adapted H2N2 influenza virus vaccine candidates in non human primates. Vaccine. 2015; 33(1): 193—200.
18. Chen G.L., Lamirande E.W., Cheng X., Torres-Velez F., Orandle M., Jin H. et al. Evaluation of three live attenuated H2 pandemic influenza vaccine candidates in mice and ferrets. J. Virol. 2014; 88(5): 2867—76.
19. Isakova-Sivak I., de Jonge J., Smolonogina T., Rekstin A., van Amer-ongen G., van Dijken H. et al. Development and Pre-Clinical Evaluation of Two LAIV Strains against Potentially Pandemic H2N2 Influenza Virus. PLoS One. 2014; 9(7): e102339.
20. To K.K., Zhang A.J., Chan A.S., Li C., Cai J.P., Lau C.C. et al. Recombinant influenza A virus hemagglutinin HA2 subunit protects mice against influenza A(H7N9) virus infection. Arch. Virol. 2015; 160(3): 777—86.
21. Kong H., Zhang Q., Gu C., Shi J., Deng G., Ma S. et al. A live attenuated vaccine prevents replication and transmission of H7N9 virus in mammals. Sci. Rep. 2015; 5: 11233.
Поступила 07.04.16 Принята в печать 24.05.16
