CC BY
88
УДК 577.21
Повреждения ДНК при тепловом стрессе
О. Л. Кантидзе1*, А. К. Величко1, А. В. Лужин1, С. В. Разин1'2* 'Институт биологии гена РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 34/5
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12
*E-mail: [email protected]; [email protected]
Поступила в редакцию 17.12.2015
Принята к печати 17.02.2016
РЕФЕРАТ Хотя механизмы клеточного ответа на тепловой стресс изучаются уже несколько десятилетий, многое остается неясным. Это связано с тем, что основное внимание было сконцентрировано на изучении белков и факторов теплового шока, их участии в регуляции транскрипции, поддержании белкового гомео-стаза и т.д. В последнее время достигнут определенный прогресс в исследовании влияния теплового стресса на целостность ДНК. В обзоре охарактеризованы и обсуждены известные и потенциальные механизмы образования различных повреждений ДНК при тепловом стрессе.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ДНК-топоизомеразы, повреждение ДНК, репарация ДНК, репликация ДНК, тепловой шок.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ОЦР - одноцепочечные разрывы ДНК; ДЦР - двухцепочечные разрывы ДНК; topi -ДНК-топоизомераза I; top2 - ДНК-топоизомераза II.
ВВЕДЕНИЕ
Тепловой стресс (тепловой шок, гипертермия) - один из наиболее хорошо изученных комплексных стресс-факторов. В реакции клетки на тепловой стресс участвует большинство субклеточных компартментов и метаболических процессов [1-3]. Давно известно, что клетки, подвергнутые тепловому стрессу, обладают повышенной чувствительностью к агентам, индуцирующим двухцепочечные разрывы ДНК (ДЦР), в частности к ионизирующей радиации [4, 5]. Это явление получило название «температурная радиочувствительность». Предполагалось, что причина этого эффекта заключается в способности теплового стресса ингибировать системы репарации ДНК [5]. Действительно, за несколько десятилетий обнаружено, что тепловой стресс способен ингибировать ключевые компоненты практически всех систем репарации (рисунок). Тепловой стресс подавляет активность систем эксцизионной репарации оснований (BER, base excision repair) [6-9] и нуклеотидов (NER, nucleotide excision repair) [10, 11]. Наиболее изучено действие теплового стресса на эксцизион-ную репарацию оснований: тепловой стресс может непосредственно инактивировать ДНК-полимеразу в и некоторые ДНК-гликозилазы [6, 9]. Недавно получили свидетельства того, что тепловой стресс может также ингибировать систему репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatch repair) [12].
Наибольший вклад в температурную радиочувствительность вносит подавление систем репарации ДЦР, которое происходит при тепловом стрессе. Известно, что тепловой стресс подавляет работу систем как негомологичного соединения концов ДНК (NHEJ, nonhomologous end joining), так и гомологичной рекомбинации (HR, homologous recombination). В случае NHEJ влияние теплового стресса ограничивается комплексом ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK): показано, что гипертермия может приводить к агрегации гетеродимера Ku70/80 (и соответственно к уменьшению его ДНК-связывающей активности), подавлению экспрессии Ku80 и/или к ингибирова-нию каталитической субъединицы DNA-PK [13-15]. Иначе обстоит дело с HR - тепловой стресс способен ингибировать эту систему репарации на нескольких ключевых этапах [16]. Вопросам влияния гипертермии на системы репарации высших эукариот посвящен недавно опубликованный обзор П.М. Кравчик и соавт. [17], к которому мы и адресуем читателей. Основным же предметом нашего мини-обзора будет вопрос о прямых повреждениях ДНК, которые способен индуцировать тепловой стресс (рисунок).
ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ РАЗРЫВЫ ДНК ПРИ ТЕПЛОВОМ СТРЕССЕ
Тепловой стресс может не только ингибировать системы репарации ДНК, но и выступать в качестве по-
негомологичное соединение концов ДНК (NHEJ) гомологичная рекомбинация (HR)
эксцизионная репарация оснований (BER) эксцизионная репарация нуклеотидов (NER)
Тепловой стресс
8-оксогуанин дезаминированный цитозин AP-сайты
одноцепочечные разрывы ДНК (top1-зависимые)
I
двухцепочечные разрывы ДНК (возникают не сразу, зависят от репликации)
репарация ошибочно спаренных оснований
двухцепочечные разрывы ДНК (возникают сразу после воздействия)
Влияние теплового стресса на целостность ДНК и системы репарации (подробнее см. текст)
вреждающего ДНК агента. Так, известно, что тепловой стресс может приводить к накоплению в клетке 8-оксогуанина, дезаминированного цитозина и апу-риновых участков ДНК (AP-сайтов) [18-20]. Можно представить, что подобные повреждения ДНК, как и одноцепочечные разрывы ДНК (ОЦР), пассивно накапливаются в клетке в результате ингибирования тепловым стрессом систем эксцизионной репарации. Более интересным и дискуссионным является вопрос о природе индуцированных тепловым стрессом ДЦР в ДНК, а также о возможности активной индукции тепловым стрессом ОЦР. Долгое время считалось, что тепловой стресс не индуцирует ДЦР, а приводит только к возникновению ОЦР, которые образуются в результате ингибирования гипертермией процесса репликации ДНК [21-23]. С помощью нескольких комплементарных подходов (метод ДНК-комет, флуоресцентное мечение разрывов с помощью ДНК-полимеразы I) мы показали, что тепловой стресс действительно индуцирует ОЦР в клетках, находящихся в S-фазе клеточного цикла [24]. В той же работе показано, что гипертермия способна ингибировать репликацию ДНК: в зависимости от температуры и клеточной линии тепловой стресс приводит либо к замедлению, либо к аресту репликативных вилок
[24]. Стоит, однако, отметить, что возникновение ОЦР в S-фазных клетках не связано с ингибированием тепловым стрессом репликации ДНК [25]. Недавно мы идентифицировали механизм возникновения ОЦР при тепловом стрессе. Оказалось, что тепловой стресс индуцирует ОЦР путем ингибирования ДНК-топоизомеразы I (topi), фермента, релаксирующего супервитки в молекуле ДНК, внося временный ОЦР
[25]. В ходе каталитического цикла top1 происходит разрезание одной цепи ДНК и образование промежуточного ковалентно связанного комплекса фермента
с ДНК. Стабилизация такого комплекса является основным механизмом генотоксического действия ядов top1 (например, камптотецина и его производных) [26, 27]. Тепловой стресс (45°С) не только способен подавлять каталитическую активность фермента, он приводит к накоплению в клетке ковалентно связанных комплексов top1 и ДНК. Можно заключить, что действие гипертермии на top1 схоже с действием ядов, с той лишь разницей, что тепловой стресс, вероятно, подавляет активность top1 на всех стадиях каталитического цикла. Хотя известно, что tор1 может связываться с уже существующими в клетке ОЦР [28, 29], в случае теплового стресса именно она является причиной их возникновения. Наиболее убедительные доказательства этого получены в опытах по подавлению экспрессии фермента с помощью РНК-интерференции [25]. Показано, что в условиях сниженной экспрессии top1 не активируется программа клеточного старения, зависящего от индукции ОЦР и их конвертации в персистирующие ДЦР [25]. Это свидетельствует о том, что в клетках, не экс-прессирующих top1, не происходит образования ОЦР при тепловом стрессе. Таким образом, роль top1 в образовании индуцированных тепловым стрессом ОЦР кажется нам вполне очевидной. Интересно также и то, что в клетках HeLa ковалентно связанные комплексы top1 с ДНК эффективно образуются только при температурах выше 44°С. Таким образом, при клинически релевантных температурах - 41-43°С - не должно происходить образования ОЦР. Тот факт, что возникновение ОЦР при тепловом стрессе в основном наблюдается в клетках, находящихся в S-фазе клеточного цикла, обусловлен тем, что основная функция top1 - разрешение топологических проблем, возникающих в ходе репликации ДНК. Можно утверждать, что чувствительность неделя-
щихся клеток (терминально дифференцированных, арестованных на стадии G0 и т.д.) в смысле возникновения ОЦР должна быть существенно снижена. Она не может полностью отсутствовать, так как функции topl в клетке не ограничены процессом репликации ДНК. В связи с этим стоит отметить, что индукция тепловым стрессом ОЦР, вероятно, происходит не только в S-фазе клеточного цикла - ОЦР возникают и в G1- и G2-фазах, однако с крайне малой частотой. Согласно нашим неопубликованным данным, количество возникающих ОЦР при тепловом стрессе в разных клеточных линиях напрямую коррелирует с уровнем экспрессии topl. Суммируя полученные данные, можно утверждать, что тепловой стресс ин-гибирует активность topl in vivo и приводит к формированию ковалентно связанных комплексов между ферментом и ДНК и, как следствие, к образованию ОЦР.
ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫЕ РАЗРЫВЫ ДНК ПРИ ТЕПЛОВОМ СТРЕССЕ
Возникающие при тепловом стрессе ОЦР служат источником образования ДЦР. Такие ДЦР обладают несколькими интересными характеристиками - они специфичны для S-фазы клеточного цикла и возникают в клетке не сразу после воздействия теплового стресса, а спустя 3-6 ч [25]. Эти отсроченные ДЦР возникают вследствие столкновения реплика-тивных вилок, возобновивших движение после индуцированного тепловым стрессом ареста, с ОЦР, которые образуются в результате ингибирования topl [25]. Замедленная кинетика образования таких ДЦР, с одной стороны, связана с ингибированием при тепловом стрессе репликации ДНК, а с другой, с подавлением процесса транскрипции [25]. Процесс активной транскрипции необходим для детекции и последующего снятия комплекса topl, ковалент-но связанного с ДНК, что приводит к демаскированию ОЦР и создает возможность для столкновения с ними репликативных вилок [30, 31]. Судя по всему, отсроченные ДЦР эффективно распознаются клеточными системами, о чем свидетельствуют ATM/ ATR-зависимое фосфорилирование H2AX (маркер ДЦР) и последующее привлечение других факторов репарации к сайту разрыва (53BP1, Rad51 и др.). Тем не менее репарация таких повреждений не происходит, что приводит к существованию в клетке постоянного сигнала о повреждении ДНК и, как следствие, к запуску программы преждевременного клеточного старения [25, 32].
Таким образом, нами впервые установлен механизм формирования отсроченных ДЦР в результате действия теплового стресса. Однако вопрос о том, может ли тепловой стресс немедленно индуциро-
вать ДЦР, долгое время оставался дискуссионным. В течение последних лет в разных лабораториях показано, что тепловой стресс может индуцировать фосфорилирование гистона Н2АХ [33-37], являющееся одним из первых событий в процессах узнавания и репарации ДЦР [38, 39]. Тем не менее интерпретация этих результатов достаточно противоречива: некоторые утверждают, что фокусы уН2АХ маркируют ДЦР, индуцированные температурой [34, 37]; другие склонны считать, что тепловой шок сам по себе не приводит к повреждению ДНК, а уН2АХ в этом случае является побочным продуктом клеточного ответа на стресс [33, 35, 36]. Недавно нами доказана способность гипертермии провоцировать образование ДЦР [24, 40]. Это подтверждено с использованием двух независимых подходов: метода ДНК-комет и техники мечения концов ДНК терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой. Однако эффект температурной индукции ДЦР характерен только для клеток, находящихся в G1-и G2-фазах клеточного цикла. Эти ДЦР маркируются АТМ-зависимым фосфорилированием Н2АХ [24]. Интересно, что сразу после воздействия гипертермии не наблюдается привлечения к фокусам уН2АХ других факторов репарации, в частности белка 53ВР1 [24, 41]. В то же время такие ДЦР достаточно эффективно репарируются в течение первых 3-6 ч после теплового стресса. Вероятно, это означает, что активная репарация индуцированных тепловым стрессом ДЦР начинается не сразу после воздействия, а спустя некоторое время после функционального восстановления ингибированных тепловым стрессом систем репарации. До сих пор, однако, не ясно, каков механизм (медиатор) немедленного формирования ДЦР в условиях теплового стресса. В качестве возможных кандидатов на эту роль можно рассматривать такие процессы, как активация ретроэлементов [42, 43], генерация активных форм кислорода [18], остановка транскрипции [44, 45]. Выше перечислены процессы, которые, как известно, могут приводить к образованию ДЦР и, при определенных условиях, происходить при тепловом стрессе. Тем не менее ни одна из этих гипотез не может убедительно объяснить индукцию тепловым стрессом ДЦР в не^-фазных клетках. На наш взгляд, наиболее вероятный механизм формирования индуцированных тепловым стрессом ДЦР состоит в подавлении активности ДНК-топоизомеразы II (1ор2), фермента, изменяющего топологию ДНК путем внесения временных ДЦР [46]. Такие разрывы сопровождаются образованием ковалентной связи между молекулой белка и одним из концов цепи ДНК. Ингибирование 1ор2 на стадии ковалентно связанного комплекса приводит к обра-
зованию ДЦР [46]. Достаточно давно получены данные о том, что тепловой стресс может ингибировать активность top2 in vitro [47]. Тот факт, что тепловой стресс может снижать генотоксический потенциал ядов top2, также свидетельствует о влиянии гипертермии на этот фермент [48]. Существуют две изоформы top2, причем экспрессия одной из них зависит от стадии клеточного цикла [49, 50]. Такая динамика экспрессии могла бы легко объяснить зависимость индукции ДЦР от фазы клеточного цикла.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Подводя итог, можно утверждать, что, помимо комплексного подавления почти всех систем репарации в клетках высших эукариот, тепловой стресс напрямую приводит к образованию различных повреждений ДНК. Интересно, что тип и судьба индуцируемых тепловым стрессом повреждений зависят от стадии
клеточного цикла, на которой клетка подверглась действию высоких температур. Так, в S-фазе клеточного цикла гипертермия приводит к 1ор1-зависимому образованию ОЦР, часть из которых спустя несколько часов может конвертироваться в сложно репа-рируемые ДЦР. В то же время тепловой стресс немедленно индуцирует ДЦР в клетках, находящихся на стадии G1 или G2 клеточного цикла. Несмотря на то что в общем виде описываемая схема действия теплового стресса характерна для всех проанализированных нами клеточных линий, стоит все же иметь в виду, что количество разрывов и степень репарационного ответа клетки могут очень сильно варьировать в зависимости от силы теплового стресса и типа (линии) клеток. •
Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (грант № 14-24-00022).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Richter K., Haslbeck M., Buchner J. // Mol. Cell. 2010. V. 40. P. 253-266.
2. Velichko A.K., Markova E.N., Petrova N.V., Razin S.V., Kantidze O.L. // Cell Mol. Life Sci. 2013. V. 70. P. 4229-4241.
3. Кантидзе О.Л., Величко А.К., Разин С.В. // Биохимия. 2015. V. 80. P. 1181-1185.
4. Dewey W.C., Sapareto S.A., Betten D.A. // Radiat. Res. 1978. V. 76. P. 48-59.
5. Iliakis G., Wu W., Wang M. // Int. J. Hyperthermia. 2008. V. 24. P. 17-29.
6. Dikomey E., Becker W., Wielckens K. // Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 1987. V. 52. P. 775-785.
7. Raaphorst G.P., Feeley M.M., Chu G.L., Dewey W.C. // Radiat. Res. 1993. V. 134. P. 331-336.
8. Batuello C.N., Kelley M.R., Dynlacht J.R. // Anticancer Res. 2009. V. 29. P. 1319-1325.
9. Fantini D., Moritz E., Auvre F., Amouroux R., Campalans A., Epe B., Bravard A., Radicella J.P. // DNA Repair (Amst.). 2013. V. 12. P. 227-237.
10. Hettinga J.V., Konings A.W., Kampinga H.H. // Int. J. Hyperthermia. 1997. V. 13. P. 439-457.
11. Muenyi C.S., States V.A., Masters J.H., Fan T.W., Helm C.W., States J.C. // J. Ovarian Res. 2011. V. 4. P. 9.
12. Nadin S.B., Cuello-Carrion F.D., Sottile M.L., Ciocca D.R., Vargas-Roig L.M. // Int. J. Hyperthermia. 2012. V. 28. P. 191-201.
13. Burgman P., Ouyang H., Peterson S., Chen D.J., Li G.C. // Cancer Res. 1997. V. 57. P. 2847-2850.
14. Qi D., Hu Y., Li J., Peng T., Su J., He Y., Ji W. // PLoS One. 2015. V. 10. P. e0122977.
15. Ihara M., Takeshita S., Okaichi K., Okumura Y., Ohnishi T. // Int. J. Hyperthermia. 2014. V. 30. P. 102-109.
16. Eppink B., Krawczyk P.M., Stap J., Kanaar R. // Int. J. Hyperthermia. 2012. V. 28. P. 509-517.
17. Oei A.L., Vriend L.E., Crezee J., Franken N.A., Krawczyk P.M. // Radiat. Oncol. 2015. V. 10. P. 165.
18. Bruskov V.I., Malakhova L.V., Masalimov Z.K., Chernikov A.V. // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P. 1354-1363.
19. Lindahl T., Nyberg B. // Biochemistry. 1974. V. 13. P. 34053410.
20. Warters R.L., Brizgys L.M. // J. Cell Physiol. 1987. V. 133. P. 144-150.
21. Corry P.M., Robinson S., Getz S. // Radiology. 1977. V. 123. P. 475-482.
22. Jorritsma J.B., Konings A.W. // Radiat. Res. 1984. V. 98. P. 198-208.
23. Warters R.L., Brizgys L.M., Axtell-Bartlett J. // J. Cell Physiol. 1985. V. 124. P. 481-486.
24. Velichko A.K., Petrova N.V., Kantidze O.L., Razin S.V. // Mol. Biol. Cell. 2012. V. 23. P. 3450-3460.
25. Velichko A.K., Petrova N.V., Razin S.V., Kantidze O.L. // Nucleic Acids Res. 2015. V. 43. P. 6309-6320.
26. Pommier Y. // Nat. Rev. Cancer. 2006. V. 6. P. 789-802.
27. Ashour M.E., Atteya R., El-Khamisy S.F. // Nat. Rev. Cancer. 2015. V. 15. P. 137-151.
28. Lebedeva N., Rechkunova N., Boiteux S., Lavrik O. // IUBMB Life. 2008. V. 60. P. 130-134.
29. Lebedeva N., Auffret Vander Kemp P., Bjornsti M.A., Lavrik O., Boiteux S. // DNA Repair (Amst.). 2006. V. 5. P. 799-809.
30. Lin C.P., Ban Y., Lyu Y.L., Desai S.D., Liu L.F. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 21074-21083.
31. Lin C.P., Ban Y., Lyu Y.L., Liu L.F. // J. Biol. Chem. 2009. V. 284. P. 28084-28092.
32. Petrova N.V., Velichko A.K., Razin S.V., Kantidze O.L. // Cell Cycle. 2016. V. 15. P. 337-344.
33. Hunt C.R., Pandita R.K., Laszlo A., Higashikubo R., Agarwal M., Kitamura T., Gupta A., Rief N., Horikoshi N., Baskaran R., et al. // Cancer Res. 2007. V. 67. P. 3010-3017.
34. Kaneko H., Igarashi K., Kataoka K., Miura M. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 328. P. 1101-1106.
35. Laszlo A., Fleischer I. // Int. J. Hyperthermia. 2009. V. 25. P. 199-209.
36. Laszlo A., Fleischer I. // Cancer Res. 2009. V. 69. P. 2042-2049.
37. Takahashi A., Mori E., Somakos G.I., Ohnishi K., Ohnishi T. // Mutat. Res. 2008. V. 656. P. 88-92.
38. Rogakou E.P., Boon C., Redon C., Bonner W.M. // J. Cell. Biol. 1999. V. 146. P. 905-916.
39. Rogakou E.P., Pilch D.R., Orr A.H., Ivanova V.S., Bonner W.M. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 5858-5868.
40. Величко А.К., Разин С.В., Кантидзе О.Л. // ДАН. 2013. V. 450. P. 224-227.
41. Petrova N.V., Velichko A.K., Kantidze O.L., Razin S.V. // Cell Biol. Int. 2014. V. 38. P. 675-681.
42. Belgnaoui S.M., Gosden R.G., Semmes O.J., Haoudi A. // Cancer Cell Int. 2006. V. 6. P. 13.
43. Gasior S.L., Wakeman T.P., Xu B., Deininger P.L. // J. Mol. Biol. 2006. V. 357. P. 1383-1393.
44. Sordet O., Nakamura A.J., Redon C.E., Pommier Y. // Cell Cycle. 2010. V. 9. P. 274-278.
45. Sordet O., Redon C.E., Guirouilh-Barbat J., Smith S., Solier S., Douarre C., Conti C., Nakamura A.J., Das B.B., Nicolas E., et al. // EMBO Rep. 2009. V. 10. P. 887-893.
46. Nitiss J.L. // Nat. Rev. Cancer. 2009. V. 9. P. 338-350.
47. Osheroff N., Shelton E.R., Brutlag D.L. // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 9536-9543.
48. Kampinga H.H. // Br. J. Cancer. 1995. V. 72. P. 333-338.
49. Goswami P.C., Roti Roti J.L., Hunt C.R. // Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P. 1500-1508.
50. Kimura K., Saijo M., Ui M., Enomoto T. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 1173-1176.
