CC BY
16
УДК 577.25
Потенциалчувствительный домен из третьего повтора канала скелетных мышц человека NaV1.4 — новая мишень действия «вольт-сенсорных» токсинов из ядов пауков
М. Ю. Мышкин1, А. С. Парамонов1, Д. С. Кульбацкий1, Е. А. Суркова1, А. А. Беркут1, А. А. Василевский1, Е. Н. Люкманова1,2, М. П. Кирпичников1,2, З. О. Шенкарев1* 1Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 117997 Россия
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
Москва, 119234 Россия
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 30.11.2020
Принята к печати 19.01.2021
DOI: 10.32607/actanaturae.11279
РЕФЕРАТ Потенциалзависимые натриевые каналы (NaV) имеют модульное строение и содержат пять мембранных доменов. Центральный поровый домен отвечает за проводимость ионов и их селективную фильтрацию, а четыре периферических потенциалчувствительных домена (ПЧД-I/IV) отвечают за активацию и быструю инактивацию канала. «Вольт-сенсорные» токсины из яда членистоногих взаимодействуют с ПЧД, оказывая влияние на активацию и/или инактивацию канала, и могут выступать прообразами новых препаратов для лечения различных каналопатий и болевых синдромов. Токсинсвязывающие сайты, расположенные в ПЧД-I, II и IV ^,-каналов млекопитающих, описаны ранее. На примере токсина Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei нами показано наличие токсинсвязывающего сайта в ПЧД-III №,1.4-канала скелетных мышц человека. Разработана система бесклеточного синтеза белка, позволяющая получать препараты изолированного (отделенного от канала) ПЧД-III и его ^N-меченого аналога в миллиграммовых количествах. Методом ЯМР-спектроскопии в мембраноподобном окружении мицелл DPC/LDAO (1 : 1) показано, что Hm-3 имеет сравнительно высокое сродство к ПЧД-III (константа диссоциации комплекса Kd ~6 мкМ), сравнимое со сродством токсина к ПЧД-I и превышающее аффинность токсина к ПЧД-II. При образовании комплекса положительно заряженные остатки Lys25 и Lys28 токсина, по-видимому, взаимодействуют с внеклеточной петлей S1-S2 ПЧД-III. При этом молекула Hm-3 также контактирует с фрагментом липидной мембраны, окружающей канал.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА бесклеточный синтез белка, взаимодействие лиганд-рецептор, ЯМР-спектроскопия, натриевые каналы, «вольт-сенсорные» токсины.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ DPC - додецилфосфохолин; LDAO - ^^диметилдодециламин-^оксид; NaV - по-тенциалзависимый натриевый канал; ПЧД - потенциалчувствительный домен; ПЧД-III - потенциалчувствительный домен из третьего повтора а-субъединицы канала Na,1.4 человека; ТМ - трансмембранный; ТС - трансляционная смесь.
ВВЕДЕНИЕ IV), каждый из которых содержит потенциалчув-
Потенциалзависимые Na+-каналы (NaV) - транс- ствительный домен (ПЧД, ТМ-сегменты S1-S4) мембранные (ТМ) белки, отвечающие за восхо- и сегменты S5-S6, формирующие пору канала [1]. дящую фазу потенциала действия в возбудимых Р-Субъединицы имеют один ТМ-сегмент и вне-клетках. Эти каналы состоят из порообразующей клеточный иммуноглобулиновый домен [2]. В гено-а-субъединицы, с которой ассоциированы регуля- ме человека представлено 10 генов, кодирующих торные Р-субъединицы (рис. 1А). а-Субъединица а-субъединицы NaV, и четыре гена Р-субъединиц. включает в себя четыре гомологичных повтора (I- Канал NaV1.4 экспрессируется в скелетных мышцах,
134 | ACTA NATURAE | ТОМ 13 № 1 (48) 2021
и мутации в гене его а-субъединицы (SCN4A) приводят к ряду врожденных заболеваний опорно-двигательного аппарата, таких, как миотония, парами-отония, гиперкалиемический и гипокалиемический периодический паралич, миастения и миопатия [3].
NaV являются мишенями для множества нейроток-синов из разных организмов. В ПЧД и поре канала идентифицировано как минимум восемь рецептор-ных сайтов связывания токсинов [4]. Во внеклеточных петлях ПЧД повторов II и IV идентифицированы два канонических сайта связывания токсинов пауков и скорпионов (рис. 1А) [5]. Токсины, действующие на ПЧД-IV (сайт 3), ингибируют инактивацию канала, а токсины, действующие на ПЧД-II (сайт 4), например, «вольт-сенсорные» токсины пауков, влияют на активацию канала [5]. Несмотря на то что внеклеточные интерфейсы ПЧД-I и III могут быть частично закрыты иммуноглобулиновыми доменами Р-субъединиц [6, 7], эти домены, задействованные в активации канала, также могут содержать ток-синсвязывающие сайты, доступные при некоторых патофизиологических состояниях. Например, показано [8], что некоторые токсины ингибируют акти-
вацию химерного канала Ку2.1, содержащего петли S3-S4 из ПЧД-1 или III канала NaV1.2, и при этом не ингибируют исходный канал Ку2.1. Поиск места связывания нейротоксинов в каналах эукариот методом сайт-направленного мутагенеза затруднен, так как а-субъединица NaV содержит четыре ПЧД, каждый из которых может принимать участие в формировании отклика на действие токсина.
Ранее мы показали, что основным сайтом связывания токсина Нт-3 из яда паука Heriaeus melloteei в канале NaV1.4 человека является внеклеточная петля S3-S4 ПЧД-1 [9]. Кроме того, Нт-3 взаимодействует с внеклеточной петлей S1-S2 ПЧД-И, но со значительно меньшей аффинностью [10]. Токсин Нт-3 состоит из 35 аминокислотных остатков и при нейтральных рН имеет заряд +4. Вторичная структура Нт-3 включает в себя несколько Р-поворотов и Р-шпильку, сформированную остатками Cys23-Cys34. Пространственная структура Нт-3 стабилизирована тремя дисульфидными связями, формирующими так называемый «цисти-новый узел» [11]. Несколько ароматических остатков образуют на поверхности Нт-3 гидрофобный кла-
А
внеклеточное пространство
а-субъединица NaV сайт 4
ПЧД-II
Р-субъединица NaV сайт 3 _ NI
+
+
+
-дгкя 1 2 3 4
N
цитоплазма
ПЧД-III NaV1.4
MGTLRRASFKIVEHNWFETFIVFMILLSSGAbAFEDIYIEQRRVIRTII^YADKWTYIFIMEMLLKWVAYG
1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080
FKVYFTNAWSWLDFLIVDVS11 SLVANWLGYSELGPIKSLRTLRAIiRPLRAbSRFEGMRVVVNAlLGAIGSH6
1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150
66 45 35
25 18 14
кДа
поровый домен
ПЧД-IV
ПЧД-II
1 2
3
ПЧД-
4
Рис. 1. Схематическое изображение пространственной организации №у эукариот в мембране (А). Аминокислотная последовательность варианта ПЧД-Ш, использованного в работе (Б). Подчеркнуты остатки, искусственно введенные в последовательность. Вторичная структура показана согласно известной пространственной структуре [6] (PDB Ю: 6AGF). Отрицательно и положительно заряженные остатки обозначены красным и голубым фоном соответственно. Знаком «+» обозначены положительно заряженные остатки в спирали S4, служащей сенсором потенциала. Очистка образца ПЧД-Ш на М2+-аффинной смоле (б). Дорожки: 1 - маркер молекулярных масс; 2 - солюбилизированный осадок ТС; 3 - промывка колонки; 4 - элюция 500-мМ имидазолом. Молекулярная масса ПЧД-Ш: 16.3 кДа
В
Б
стер, поэтому, как и другие «вольт-сенсорные» токсины пауков, Hm-3 имеет сродство к мембранам [11] и, по-видимому, атакует ПЧД из мембраносвязан-ного состояния. Токсины этого семейства интересны не только как инструменты для структурно-функциональных исследований NaV, но также могут служить прообразами новых лекарств. Например, Hm-3 способен блокировать аберрантные токи утечки (ю-токи), возникающие в канале NaV1.4 при мутациях ПЧД-I и II, приводящих к развитию периодического паралича [9, 10].
В представленной работе на примере токсина Hm-3 нами впервые показано наличие токсинсвя-зывающего сайта в ПЧД-III канала NaV1.4 человека. С этой целью мы использовали альтернативный подход, основанный на рекомбинантной продукции изолированного (отделенного от канала) ПЧД и анализе сайтов связывания методом ЯМР-спектроскопии. Возможность структурных ЯМР-исследований изолированных ПЧД [12] и их комплексов с токсинами [9, 10] показана ранее.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Изолированный ПЧД-III (остатки 1019-1157, рис. 1Б) получали с помощью сопряженной бесклеточной системы синтеза диализного типа на основе экстракта S30 из Escherichia coli, используя протоколы, разработанные для других ПЧД [9, 10]. Генетическую конструкцию для синтеза ПЧД-III с С-концевым His6-тагом клонировали в плазмидный вектор pIVEX2.3d, обеспечивающий высокую эффективность бесклеточного синтеза. Последовательность ПЧД-III содержит два остатка Cys, не участвующих в образовании дисульфидных связей. Для уменьшения тенденции к агрегации рекомбинантного домена эти остатки были заменены на Ser (рис. 1Б, подчеркнуты). Бесклеточный синтез проводили без добавления мембраномоделирующих компонентов в трансляционную смесь (ТС). При этом синтезированный ПЧД-III накапливался в виде осадка с чистотой более 90% (рис. 1В). 15^меченый аналог ПЧД-III синтезировали с использованием обогащенной изотопом 15N смеси 16 аминокислот (Cortecnet, Лез-Юлис, Франция), полученной из водорослей, и отдельных 15^меченых аминокислот Asn, Gln и Trp. Цистеин в реакцию синтеза не добавляли, так как использованный в работе вариант ПЧД-III не содержит этой аминокислоты. Выходы препаратов ПЧД-III немеченого и ^N-меченого белка составили 0.5 и 0.35 мг на 1 мл ТС соответственно. Для ЯМР-исследования осадок, содержащий синтезированный ПЧД-III, растворяли в 10% растворе додецилфосфохолина (DPC), очищали с помощью №2+-аффинной хроматографии в присутствии 0.5% DPC (рис. 1В), переводили в це-
левой буфер (20 мМ Трис-ацетат, pH 5.5) и добавляли детергент ^^диметилдодециламин^-оксид (LDAO) до молярного соотношения DPC/LDAO 1 : 1. Ранее эту мембраномоделирующую среду применяли для исследования комплексов ПЧД-I и II с токсином Hm-3 [9, 10]. Концентрацию детергентов контролировали по спектрам 1D :Н-ЯМР. ЯМР-спектры получали на спектрометре AVANCE III 800 (Bruker).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Общий вид 2D :H,15N корреляционного ЯМР-спектра ПЧД-III (рис. 2А) соответствовал спектрам ПЧД-I и II, полученным ранее [9, 10]. Наблюдаемая небольшая дисперсия сигналов 1HN характерна для спиральных ТМ-белков. Однако в спектре наблюдалось не более 90 сигналов HN-групп основной цепи из 130-140 ожидаемых. В соответствующих областях спектра представлены шесть из восьми HN-сигналов остатков Gly и четыре из пяти сигналов HNE1 боковых цепей остатков Trp. Отсутствие части сигналов в спектре, а также неоднородная интенсивность и полуширина наблюдаемых сигналов указывают на процессы конформационного обмена в мкс-мс-диапазоне. Эти процессы связаны, вероятно, с пластичностью структуры ПЧД-III и динамикой контактов между ТМ-спиралями. Наблюдаемые уширения сигналов не позволили получить отнесение сигналов ЯМР ПЧД-III, поэтому взаимодействие с Hm-3 исследовали качественно, без картирования сайта связывания в ПЧД.
Образцы немеченого и ^N-меченого Hm-3 получали, используя рекомбинантную продукцию в клетках E. coli [9, 11]. Для исследования взаимодействия ПЧД-III/Hm-3 в образец ^N-меченого ПЧД в мицеллах DPC/LDAO поэтапно добавляли немеченый Hm-3 до молярного соотношения ПЧД/токсин 1 : 4. Концентрацию детергентов поддерживали постоянной, чтобы предотвратить изменение в распределении токсина между водной фазой и мицеллами. Согласно полученным ранее данным о взаимодействии Hm-3 с мицеллами DPC/LDAO [9], ~97% молекул токсина в условиях эксперимента были связаны с мицеллами. При добавлении токсина в спектре ПЧД-III наблюдались изменения химических сдвигов и амплитуд некоторых сигналов (рис. 2Б). Эти изменения указали на специфическое взаимодействие ПЧД/токсин. Обратимый процесс образования-диссоциации комплекса ПЧД/Hm^ идет с характерным временем в мкс-мс-диапазоне, и для разных сигналов ПЧД этот обменный процесс является либо быстрым, либо промежуточным (по шкале времен ЯМР). Константу диссоциации комплекса определили путем аппроксимации зависимости химического сдвига сигналов ПЧД-III от концентрации Hm-3
136 I ACTA NATURAE | TOM 13 № 1 (48) 2021
110-
115-
120-
125-
130-
л
105
129 Н4 132
10.7 10.4
8.5
8.0 7.5
1H, м.д.
7.0
1054 .д.
.м
110-
1 3
123- J1 0
Чу-. ■1 9
т> ■
m 126- \ jg> !
8.2
-Г"
7.7 8.3
7.8
114-.д
i
117-
2 129 4
ÎP1
'mßP*'
- : 1гТ)1 : f.- .............
^УТ ¡gig) 132-
8.2 1H, м.д. 7.7 10.8 1H, м.д. 10.5
H1
ю
8.04
8.03
0 50 100 150
[Hm-3]0, мкМ
Рис. 2. ЯМР-исследование взаимодействия 15N-Me4eHoro ПЧД-III с немеченым Hm-3. А - 2D 1H,15N-TROSY-cneKTp 43 мкМ ПЧД-III в мицеллах DPC/LDAO (45/45 мМ, 800 МГц, pH 5.5, 45°С). Б - наложение фрагментов спектров ПЧД-III, полученных без Hm-3 (черные контуры) и после добавления 160 мкМ Hm-3 (красные контуры). Стрелками показано направление изменения положения сигналов. Пунктирными линиями обозначены сигналы, «исчезающие» при добавлении токсина. В - изменение 1H химического сдвига HN-сигнала при 8.03/115.4 м.д. (показан звездочкой на панели Б2) аппроксимировано уравнением, описывающим связывание в присутствии избытка мицелл детергента
Б
В
(рис. 2В), учитывая вклад взаимодействия Нт-3/ мицелла [9]. Полученное значение (5.8 ± 3.8 мкМ) соответствовало константе диссоциации комплекса ПЧД-1/Нт-3 (6.2 ± 0.6 мкМ) [9] и было меньше значения для комплекса с ПЧД-П (~11 мкМ) [10], что указывает на более сильное взаимодействие токсина с ПЧД-1 и ПЧД-Ш.
Обратное титрование, когда к образцу ^-меченого Нт-3 добавляли немеченый ПЧД-Ш, показало, что положительно заряженные остатки Lys25 и Lys28, находящиеся в Р-шпильке токсина, а также остаток Phe12, заглубленный в гидрофобную область мицеллы, принимают участие в образовании комплекса с ПЧД (рис. 3). Этот сайт связывания совпадает с сайтами, ответственными за взаимодействие Нт-3 с ПЧД-1 и II [9, 10]. В ходе этих более ранних исследований показано, что пара заряженных остатков Нт-3 - Lys25 и Lys28 - способна специфически взаимодействовать со спиральными мотивами, со-
держащими два отрицательно заряженных остатка (Asp или Glu), разделенных двумя или тремя незаряженными остатками. В последовательности ПЧД-III такие мотивы встречаются только во внеклеточной петле S1-S2 и в ТМ-части спирали S2 (рис. 1Б). Однако, согласно известной пространственной структуре канала NaV1.4 человека [6], остатки Glu1066 и Asp1069 расположены глубоко в трансмембранной части спирали S2, а их боковые цепи обращены внутрь молекулы ПЧД-III. Учитывая амфипатиче-ские свойства Hm-3 [11], мы предполагаем, что токсин не может погружаться глубоко в мембрану и взаимодействовать с этими остатками. В то же время боковые цепи остатков Glu1051, Asp1052 и Glu1056, расположенных в петлевом участке S1-S2, доступны растворителю и могут взаимодействовать с молекулой Hm-3, связанной с поверхностью мембраны.
Напротив, другая внеклеточная петля ПЧД-III -S3-S4 - содержит только один отрицательно заря-
105Н .д.
.м
115 120 125 130 135-
Б
А
С14
„•С19
Э22.
N6'
Р12 •
С2, 133 •
1
Э13 5М6
^29 " N30: ,К5 -■Е15к28 С17. ИМ1 С18*
N30 ^LЗ^
о К7
У25° А10® »«321-21
'\Л/11
'\Л/16
С 23 2 У35
•|3
А20.
К24
Б26
127
А4
1 Г
110
СС1АКЫКЕСА
0.010
в
Д61Н15К м.д.
и|
в
1 20I 30 135
БСЕ1ясссА1,зс|куз::кки1.к:1:с:у
в
I— -■!■ -
+ПЧД-
11/|0
Нт-3 + ПЧД-Ш (РРС^РАО)
1.00
вша ¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡п,, ¡и, |
10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 1Н, м.д.
К28
114- Р12 1 125- 2
С2з а
.д. ___
.м
С2
щ
117" 133® N30 128- УЗ 5 ®
О
К28 1 3
С9
л! 1
8.7 8.5 8.3
1Н, м.д.
9.7 9.5
-I—I—I—|—I—I—I—|—I—I—Г
8.4 8.2 8.0
Рис. 3. ЯМР-исследование взаимодействия ^-меченого Нт-3 с немеченым ПЧД-Ш. А - 2D 1H,15N-HSQC-спектр 30 мкМ Нт-3 в мицеллах DPC/LDAO (45/45 мМ, 800 МГц, рН 5.5, 45°С). Б - наложение фрагментов спектров Нт-3, полученных без ПЧД-Ш (черные контуры/линии) и после добавления 40 мкМ ПЧД-Ш (красные контуры/ линии, конечное соотношение ПЧД-Ш/Нт-3 3 : 2). Стрелками показано направление изменения положения сигналов. На панели Б3 показано селективное уменьшение амплитуды сигнала Lys28 при добавлении ПЧД-Ш. б, Г - первичная, вторичная и пространственная структуры токсина Нт-3 [11] (PDB Ю: 2MQU), а также изменение химических сдвигов и амплитуд сигналов Нт-3 при добавлении ПЧД-Ш. Показаны положительно и отрицательно заряженные остатки и дисульфидные мостики. Остатки, для которых наблюдаются значительные изменения, выделены фоном (б) и обозначены шариками (Г). Пунктирной линией изображена поверхность мицеллы детергента [9]
женный остаток Glu1121 и, вероятно, не может выступать в качестве сайта связывания токсина Нт-3. Это согласуется с результатами предыдущего исследования химерного канала Ку2.1, содержащего петлю S3-S4, пересаженную из ПЧД-Ш канала N8^1.4, в ходе которого не выявлено значимого взаимодействия с токсином Нт-3 [9]. Таким образом, полученные данные указывают на то, что внеклеточная петля S1—S2 ПЧД-Ш канала N8^.4 человека содержит сайт, способный взаимодействовать с «вольт-сенсорными» токсинами пауков. Следует отметить, что исследование токсинсвязывающих сайтов, которые располагаются на участке S1-S2 ПЧД каналов N8^ с помощью химерных каналов, по-видимому, невозможно. Попытки пересаживать петли S1-S2 из различных каналов в Ку2.1 приводили к нефункциональным химерам [13].
Разработанная в настоящей работе система бесклеточного синтеза ПЧД-Ш позволит в дальнейшем исследовать взаимодействие домена и с другими токсинами, а также может быть использована для скрининга прототипов лекарственных препаратов, селективно взаимодействующих с ПЧД-Ш. Предложенный метод исследования фармакологических свойств изолированных ПЧД каналов NaV с использованием спектроскопии ЯМР имеет преимущество перед методами, основанными на исследовании химерных каналов, так как позволяет, во-первых, картировать остатки токсинов, важные для взаимодействия с доменами, а во-вторых, изучать токсинсвязывающие сайты, которые располагаются не только в петле S3-S4, но и на участке S1-S2. •
Работа поддержана грантом РНФ № 16-14-10338.
б
138 | АСТА ЫАТиИАЕ | ТОМ 13 № 1 (48) 2021
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Catterall W.A. // J. Physiol. 2012. V. 590. P. 2577-2589.
2. O'Malley H.A., Isom L.L. // Annu. Rev. Physiol. 2015. V. 77. P. 481-504.
3. Cannon S.C. // Handbook Exp. Pharmacol. 2018. V. 246. P. 309-330.
4. Xu L., Ding X., Wang T., Mou S., Sun H., Hou T. // Drug. Dis-cov. Today. 2019. V. 24. P. 1389-1397.
5. Stevens M., Peigneur S., Tytgat J. // Front. Pharmacol. 2011. V. 2. P. 71.
6. Pan X., Li Z., Zhou Q., Shen H., Wu K., Huang X., Chen J., Zhang J., Zhu X., Lei J., et al. // Science. 2018. V. 362. P. eaau2486.
7. Shen H., Liu D., Wu K., Lei J., Yan N. // Science. 2019. V. 363. P. 1303-1308.
8. Bosmans F., Martin-Eauclaire M.F., Swartz K.J. // Nature. 2008. V. 456. P. 202-208.
9. Mannikko R., Shenkarev Z.O., Thor M.G., Berkut A.A.,
Myshkin M.Y., Paramonov A.S., Kulbatskii D.S., Kuzmin D.A., Sampedro Castañeda M., King L., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2018. V. 115. P. 4495-4500.
10. Myshkin M.Y., Mannikko R., Krumkacheva O.A., Kulbatskii D.S., Chugunov A.O., Berkut A.A., Paramonov A.S., Shulepko M.A., Fedin M.V., Hanna M.G., et al. // Front. Pharmacol. 2019. V. 10. P. 953.
11. Berkut A.A., Peigneur S., Myshkin M.Y., Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Arseniev A.S., Grishin E.V., Tytgat J., Shenkarev Z.O., Vassilevski A.A. // J. Biol. Chem. 2015. V. 290. P. 492-504.
12. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Shin-garova L.N., Yakimov S.A., Dubinnyi M.A., Chupin V.V., Kir-pichnikov M.P., Blommers M.J., Arseniev A.S. // J. Am. Chem. Soc. 2010. V. 132. P. 5630-5637.
13. Alabi A., Bahamonde M., Jung H., Kim J.I., Swartz K.J. // Nature. 2007. V. 450. P. 370-375.
