CC BY
32
УДК 577.2
Бесклеточная
продукция
внеклеточного
домена никотинового
ацетилхолинового
рецептора
Е. Н. Люкманова1# , Г. С. Копеина2 , М. А. Шулепко2 , З. О. Шенкарев1 ,
А. С. Арсеньев1 , Д. А. Долгих1,2 , М. П. Кирпичников1,2
1 Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова,
РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
2 Биологический факультет Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова # e-mail: [email protected]
Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР) являются лиганд-зависимыми ионными каналами, встроенными в постсинаптические мембраны нейронов [1]. НАХР состоят из пяти гомологичных субъединиц, трансмембранные части которых образуют ионопроводящую пору, а внеклеточные Ы-концевые домены содержат сайты связывания лигандов (рис. 1). В нервной системе млекопитающих существует гомопентамер нАХР а7 типа (а7нАХР), с дисфункциями которого связано развитие ряда тяжелых заболеваниях нервной и эндокринной систем [2]. Исследования нАХР и разработка препаратов для лечения подобных заболеваний требует высокоэффективных систем продукции отдельных субъединиц и доменов рецептора, создание которых затруднено из-за склонности этих белков к агрегации [3].
Несколько лет назад группой американских ученых была определена пространственная структура ацетилхолин-связывающего белка из моллюска Lymnaea stagnaUs (АХСБ) [4]. АХСБ - водорастворимый белок, состоящий из пяти
одинаковых субъединиц, он имеет 25 % гомологию с внеклеточным доменом а7нАХР (а7ВД) и взаимодействует с такими лигандами нАХР, как ацетилхолин, а-конотоксины и а-нейротоксины [4]. Было показано, что замена фрагмента внеклеточного домена, заключенного между двумя цистеи-новыми остатками 128 и 142 (т. н. Cys-loop фрагмента) на гомологичный участок из АХСБ приводит к значительному повышению растворимости а7ВД [5].
В течение последних 10 лет бесклеточные системы, в особенности диализного типа (CECF-continuous exchange cell free), успешно используются для получения рекомбинантных белков [7, 8]. У этих систем есть несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, можно решить проблему агрегации путем ввода в реакционную смесь агентов, позволяющих удерживать синтезирующийся полипептид в растворе; во-вторых, можно проводить синтез изотопно-меченных по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований.
Рис. 1. Модель пространственной структуры нАХР [1]. Сравнение модели субъединицы а7ВД [6] с пространственной структурой субъединицы АХСБ [4]. Схема введения мутаций в ген а7ВД
Целью данной работы было создание эффективной системы бесклеточной продукции а7ВД человека. Для этого на основе полноразмерного гена а7нАХР (любезно предоставлен проф. Й. Линдстрёмом) были получены два мутантных гена а7ВД, содержащие замены, возможно, приводящие к повышению растворимости домена. Один ген (а7ВД/C116S/Cys-loop) кодировал последовательность а7ВД с заменой неспаренного остатка Cys116 на остаток Ser [3] и заменой фрагмента Cys-loop/a7ВД (Cys128-Cys142) на фрагмент Cys-loop/АХСБ [5]. При анализе модели а7ВД, предложенной в [6] (рис. 1), было замечено, что фрагмент 134-137 а7ВД имеет гидрофобную природу и, возможно, контактирует с мембранным окружением целого рецептора. В то же время аналогичный участок молекулы АХСБ содержит только гидрофильные остатки (рис. 1). Мы предположили, что для улучшения растворимых свойств а7ВД будет достаточным произвести замену только четырех аминокислотных остатков Trp134-Phe-Pro-Phe137, принадлежащих Cys-loop, на остатки Asp-Thr-Glu-Ser гомологичного участка АХСБ. Второй ген (a7ВД/C116S/DTES) кодировал последовательность а7ВД с этой заменой и заменой Cys116Ser (рис. 1).
Мутантные гены с дополнительной последовательностью, кодирующей 6His на С-конце молекулы, были клонированы в коммерческий вектор рЕТ22Ь(+). При синтезе обоих вариантов в бесклеточной системе большая часть белкового препарата накапливалась в виде нерастворимых агрегатов, и лишь небольшая часть целевого белка оставалась в растворе (рис. 2, дорожки 2-4). Причиной агрегации, возможно, служили неправильное формирование дисульфидных связей и стремление фрагмента рецептора к самопроизвольной пентамеризации, присущей а7ВД [9]. Эксперименты показали, что добавление в трансляционную смесь (ТС) смесей восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатионов в концентрации 0.1 мМ и 0.5 мМ соответственно повышало растворимую долю целевого белка до 30 % (рис. 2, дорожки 5-7). Присутствие в ТС низкомолекулярного агониста нАХР, 20 мМ карбамоилхолина (КБМХ), также приводило к увеличению выхода растворимой фракции до 30 % (рис. 2, дорожки 8-10). Добавление в ТС мягкого неионного детергента Вгц-35 в концентрации
0.5 % как агента, препятствующего самопроизвольной пен-тамеризации, наряду с добавлением глутатионов привело к синтезу практически полностью растворимого белка (рис. 2, дорожки 11-13). Следует отметить, что оба химерных варианта а7ВД демонстрировали одинаковое поведение как при синтезе белка, так и при последующих манипуляциях. Поэтому дальнейшая работа была продолжена только с вариантом a7ВД/C116S/DTES.
При дальнейшей очистке химерных белков из ТС с помощью металл-афинной хроматографии происходила практически полная преципитация белковых препаратов. Поэтому были подобраны условия ренатурации а7ВД/ C116S/DTES из осадка ТС. Были реализованы различные подходы для растворения осадка, включающие использование как 8 М мочевины, 6 М гуанидинхлорида, так и 1 % раствора детергента лаурилсаркозина натрия (LS). Наибольшая эффективность растворения a7ВД/C116S/DTES из осадка была достигнута при использовании смеси 3 М мочевины и 1 % LS в присутствии ДТТ. Дальнейшая ре-натурация a7ВД/C116S/DTES происходила на металл-афинной смоле в результате промывки смесью GSSG/GSH и в градиенте понижения концентрации мочевины и LS. Однако полученный белковый препарат обладал низкой стабильностью в растворе. Тогда был использован вариант ренатурации, в котором 1 % LS постепенно заменяли на 0.1 % Р-додецилмальтозид (DDM) или 0.1 % додецилфос-фохолин ^РС). В результате были получены стабильные (более 1 месяца при +4 0С) белковые препараты с конечным выходом 1 мг белка с 1 мл трансляционной смеси. Препараты а7ВД в DDM и DPС были проанализированы с помощью гель-фильтрации (рис. 3). В случае использования DDM белок находился преимущественно в виде растворимых высокомолекулярных агрегатов (рис. 3), а использование DPС позволило получить гомогенный (>90 %) препарат а7ВД с диаметром частиц около 7 нм, что соответствует размеру мономера а7ВД (5 нм) в комплексе с мицеллой DPС (4 нм).
Рис. 2. Электрофоретический анализ синтеза a7ВД/C116S/DTES в бесклеточной системе. 1 — маркеры молекулярных весов; 2, 5, 8, 11 — общий белок ТС; 3, 6, 9, 12 — растворимая фракция ТС; 4, 7, 10, 13 — нерастворимая фракция ТС
Рис. 3. Анализ с помощью гель-фильтрации на смоле Superdex-200 (GE Healthcare) a7ВД/C116S/DTES в растворе DDM и DPC. КД-спектр а7ВД/С1^/ DTES в растворе DPC
Рис. 4. Ю 15N-HSQC спектры ЯМР токсина N111/1 в присутствии мицелл ЭРС и возрастающих концентраций a7ВД/C116S/DTES, а также полученная на их основе изотерма связывания. Кривая разведения показана пунктирной линией
Анализ вторичной структуры a7ВД/С116S/DTES в растворе DPС методом КД спектроскопии выявил преобладание Р-структуры, что соответствует теоретически рассчитанным значениям (рис. 3). Способность a7ВД/С116S/ DTES в растворе DPС взаимодействовать с антагонистами нАХР была исследована методом ЯМР-спектроскопии с использованием 15П-меченого аналога длинного нейротоксина N^1^^, полученного, как описано в [10]. Раствор токсина в DPС титровали раствором домена рецептора, и по ослаблению сигналов токсина в Ш 15N-HSQС спектре судили о взаимодействии токсина с а7ВД (рис. 4). Было показано, что каждая молекула а7ВД специфически связывает две молекулы токсина с эффективной константой около 2 мкМ и сравнительно большой кооперативностью (коэффициент Хилла 1.8).
Таким образом, нами разработана новая система бактериальной бесклеточной продукции активного внеклеточного домена а7нАХР. Добавление DPC к препарату белка способствует стабилизации домена в растворе, сохраняя вторичную структуру и не препятствуя взаимодействию с антагонистами. Разработка данной системы открывает новые перспективы для структурно-функциональных исследований взаимодействия нАХР с его лигандами. •
Данная работа была выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук (программа «Молекулярная и клеточная биология»), Российского фонда фундаментальных исследований и при поддержке гранта Президента РФ «молодой кандидат» МК-6386.2008.4.
Список литературы:
1. Unwin N. J.Mol.Biol. 2005. 346. 967
2. Sharma G., Vijayaraghavan S. Curr Med Chem. 2008. 5(28). 2921-32.
3. Tsetlin V.I., Dergousova N.I., Azeeva E.A., Kryukova E.V., Kudelina I.A., Shibanova E.D., Kasheverov I.E., Methfessel C. Eur.J.Biochem. 2002. 269. 2801-2809
4. Brejc K., J.van Dijk W., Klaassen R.V., Schuurmans M., van der Oost J., Smit A.B., Sixma T.K. Nature 2001. 411. 269-276
5. Avramopoulou V., Mamalaki A., Tzartos S.J. J. Biol. Chem., 2004. 279(37). 38287-93.
6. Fruchart-Gaillard C., Gilquin B., Antil-Delbeke S., Le Novere N., Tamiya T., Corringer
P.J., Changeux J.P., Menez A., Servent D. Proc. Natl. Acad. Sci., 2002. 99(5). 3216-21.
7. Klammt C., Schwarz D., Eifler N., Engel A., Piehler J., Haase W., Hahn S., Dotsch V. Bernhard F. J. Struct. Biol., 2007. 158(3). 482-93.
8. Klammt C., Lohr F., Schafer B., Haase W., Dotsch V., Ruterjans H., Glaubitz C., Bernhard F. FEBS Lett., 2004. 271. 568-580.
9. Wells G.B., Anand R., Wang F., Lindstrom J. J Biol Chem., 1998. 273(2). 964-73.
10. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Schulga A.A., Ermolyuk Y.S., Mordvintsev D., UtkinY.N., Shoulepko M.A., Hogg R., Bertrand D., Dolgikh D.A., Tsetlin V.I., Kirpichnikov M.P. J. Biol. Chem., 2007. 282(34). 24784-91.
