CC BY
13
УДК 573.088.1
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫЧИСЛЕНИЯ ПРИРОСТА БИОМАССЫ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ IN VITRO
В.Ю. Сидорова, доктор с.-х. наук Е.Б. Петров, кандидат с.-х. наук В.В. Миронов, доктор технических наук ИМЖ - филиал ФГБНУ ФНАЦ ВИМ E-mail: [email protected]
Аннотация. Методы расчета выхода клеточной биомассы стволовых клеток животных основаны на приблизительном определении веса урожая. Среди них метод Моно, метод расчета количества биомассы на основании потребления углеродного или кислородного субстрата (в молях) и др. Исследования оптимизации деления стволовой клетки при росте биомассы были проведены посредством применения методов статистической обработки, сортировки и поиска литературной информации, приближенного решения задач и оптимизационного метода, основанного на выявлении биологических особенностей жизнедеятельности ММСК животных. Алгоритм деления стволовых клеток слагается из двух основных стадий
- интерфазы и собственно митоза. Длительность их неодинакова: продолжительность интерфазы равняется 8-10 часам или 85% цикла, собственно митоза - 1-2 часам или 15%. Такая кратность деления позволяет получить в результате митотического цикла образование двух дочерних клеток из одной материнской. Жизненный цикл стволовой клетки разделяют на интерфазу и митоз. Во время интерфазы идет активный синтез и накопление питательных веществ. Митотический цикл с образованием двух клеток следующей генерации рассчитывается из количества 2n штук, где n - число делений. Всего клонов одной клетки может быть не больше 200 делений, практически 80, в результате чего образуется 1,20893E+24 штук СК. Если известно, что время одного митоза продолжается 24 часа, то скорость прироста клеток биомассы (В) за n клеточных циклов будет выглядеть следующим образом: B = S/ln/t, где l
- количество клеток, составляющих «фронтальную» линию роста, t - время протекания митотического цикла. Результаты исследования могут применяться при расчете времени и скорости заселения мат-риксов - носителей клеточных культур различных форм при планировании времени экспериментальных исследований и величины площади поверхности носителей при заселении различных объемов клеток. Ключевые слова: расчет выхода клеточной биомассы, алгоритм деления стволовых клеток, клонообра-зование, время прохождения одного митоза.
Введение. Для определения величины выхода клеточной биомассы существует несколько различных способов. Большинство из них основано на приблизительном определении веса урожая [8, 9]. Так, при расчете выхода биомассы исходят из константы (коэффициента), вычисляемой на основе материального баланса устойчивой системы культивирования; выход клеточной биомассы в расчете на использованный субстрат обозначают как индекс 7х/£, где определяется соотношение соответствующих концентраций образовавшихся клеток и использованного субстрата [1,2,3,4]. Широко известны расчеты количества биомассы в граммах для определения выхода клеток на основа-
нии потребления углеродного или кислородного субстрата, в молях. Выход биомассы можно здесь рассчитать, определив продукцию сухой фракции за период культивирования по отношению к массе использованного в этот же период углеродного/кислородного субстрата. В условиях лимитирования площади субстрата и скорости роста выход клеток составляет примерно 10±2 г сухой биомассы на 1 моль синтезируемого вещества. В культуральной среде рост клеток определяется концентрацией питательного компонента, поэтому более важно соотношение компонентов среды, а не их абсолютные количества [5,6,7]. Между тем часто требуется определить не массу, а площадь поверхно-
сти субстрата (матрикса), занимаемую адге-зирующей биомассой за определенный промежуток времени, или период культивирования на определенной площади [8-13].
Материал и методы исследования. В ходе исследования были использованы следующие методы: математического моделирования, формализации, системного подхода и другие. Материалом исследования послужил матрикс-носитель для культивирования стволовых клеток животных [14]. Исследования оптимизации деления стволовой клетки при росте биомассы были проведены посредством применения методов обработки, сортировки и поиска литературной информации, приближенного решения задач и оптимизационного метода, основанного на выявлении биологических особенностей жизнедеятельности ММСК животных. Алгоритм деления стволовых клеток слагается из двух основных стадий - интерфазы и собственно митоза. Длительность их неодинакова: продолжительность интерфазы - подготовки к митозу - равняется 8-10 часам или 85%, продолжительность собственно митоза - 1-2 часа или 15%. Такая кратность деления позволит получить в результате митотиче-ского цикла две дочерние клетки из одной материнской [10].
Экспериментальная база. Данные имитационного моделирования экспериментальных данных были обработаны при помощи общепринятых статистических методов и программ МБ Ехсе1-2010. В ходе исследования проведены расчеты различных вариантов определения времени и площади матрик-сов-носителей при заселении стволовыми клетками животных ММСК КРС в ходе митоза и адгезии к субстрату, при учете величины 1 структурной единицы клетки 20 нм.
Обсуждение полученных результатов. Жизненный цикл стволовой клетки разделяют на интерфазу и митоз. Во время интерфазы идет активный синтез и накопление необходимых для деления клеток веществ. Мито-тический цикл - это совокупность процессов, происходящих в клетке от одного деления до следующего и заканчивающихся образованием двух клеток следующей генерации, всего
2п штук, где п - число делений. Всего клонов одной клетки может быть не больше 200 делений, практически 80, в результате чего образуется 1,20893Е+24 штук СК (рис. 1).
Рис. 1. Клонообразование в митозе
Митотический пролиферативный цикл является важнейшим компонентом клеточного цикла. Частота митотических делений стволовых клеток при переходе их в активное состояние наибольшая в костном мозге, где наблюдается 10 млн делений гемопоэти-ческих стволовых клеток эритроцитов в секунду, тогда как в нервной ткани деления ММСК редки, находятся в состоянии покоя и делятся 1 раз в 48 часов и даже реже. Стволовые клетки мышечной ткани при активации во время митоза пролиферируют со скоростью одно деление в 15-24 часа и при определенных условиях окружающей среды дифференцируют в новые виды клеточной ткани. В целом, рост биомассы зависит от таких физических величин, как частота ми-тотических делений (п), время одного мито-тического деления (¿), длина «фронтального» ряда (1) площади поверхности (Я) адгезиро-ванной биомассы, апоптоза - гибели клеток (Ар) и потерь в ходе ассиметричных делений и мутаций. Таким образом, прирост клеток биомассы (В) за п клеточных циклов будет выглядеть следующим образом: В = 81ЬпН -(Ар%), где I - количество клеток, составляющих «фронтальную» линию роста, I - время протекания митотического цикла, п - количество циклов.
Время распространения стволовых клеток при митозе по матриксу-носителю зависит от его формы и скорости движения фронтального слоя, при котором продвижение возможно только при наличии свободного пространства (рис. 2). Если известно, что время прохождения одного митоза продолжается
24 часа, то скорость прироста клеток биомассы (В) за п клеточных циклов будет выглядеть следующим образом:
S = B• l nlt ,
где l - количество клеток, составляющих «фронтальную» линию роста, t - время протекания митотического цикла.
Рис. 2. Фронтальный слой СК
Пусть стволовые клетки выращиваются в стандартном культуральном флаконе на матрасе, равном по величине 25 (5-5) см2. Тогда скорость прироста монослоя составит: 25 см /5 см-1 сут.= 5 см/сут., или 5-30=150 см/сут., то есть скорость оказалась выше имеющейся площади в 6 раз (150/25). Уменьшение времени культивирования в 6 раз позволит прогнозировать оптимальные условия культивирования условия, т.е. для получения урожая при заданных параметрах нам необходимо (30/6=5) 5 суток. При расселении клеточной биомассы на сферическом носителе учитывают площадь поверхности сферы, которая равна учетверенной величине квадрата радиуса сферы, умноженного на число п, равного 3,14. При расчете площади поверхности скаффолдов учитываются сферы 200 нм со средним радиусом 50 нм ± 3...6 6. Величина скорости прироста будет составлять: скорость прироста (Вх), где х - заранее известный параметр, равный величине одной стволовой клетки или 20 нм, зависит от плотности заселения стволовых клеток на 1 см2 поверхности матраса. При заселении 1 млн клеток мы получаем за 30 суток (30 делений) от одной клетки 1073741824 клонов мозаичного заполнения пальцеобразной формы (рис. 3).
Рис. 3. Мозаичное заполнение площади матраса при клонообразовании
Область применения результатов. Результаты исследования могут применяться при расчете времени и скорости заселения матриксов-носителей различной формы клеточными культурами стволовых клеток животных различной формы, при планировании времени экспериментальных исследований и величины площади поверхности носителей при заселении объемов различным количеством клеток.
Выводы:
1. Стволовая клетка в процессе деления проходит разные фазы состояния: роста, подготовки к делению и деления.
2. Алгоритм деления стволовых клеток слагается из двух основных стадий - интерфазы и собственно митоза. Длительность их неодинакова: продолжительность интерфазы
- подготовки к митозу - равняется 8-10 часам или 85%, продолжительность собственно митоза - 1-2 часа или 15%.
3. Рост биомассы (В) зависит от таких физических величин, как частота митотиче-ских делений (п), время одного митотического деления ({), длина «фронтального» ряда (/), площадь поверхности (Я) адгезированной биомассы, апоптоз (Ар), состоящий из асси-метричности деления, мутации.
4. Величина прироста клеток биомассы за п клеточных циклов определяется согласно выражению В = Я// - (Арурп, где / - количество клеток, составляющих «фронтальную» линию роста, I - время протекания митоти-ческого цикла.
5. Если известно, что время прохождения одного митоза продолжается 24 часа, то скорость прироста клеток биомассы (В) за п клеточных циклов будет выглядеть следующим образом: В = Я/Ъп/1, где / - кол-во клеток, составляющих «фронтальную» линию роста, I
- время протекания митотического цикла.
Литература:
1. Характеристика мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани КРС / Волкова И.М. и др. // С.-х. биология. 2012. №2. С. 32.
2. Иванкин А.Н. Гидролиз нанобиомакромолекуляр-ных систем. М., 2010. 396 с.
3. Эволюция межфазной поверхности в барботируе-мом слое / А.Ю. Ненаездников и др. // Энергия 2008. Иваново, 2013. Т. 4. С. 327-330.
4. Савченкова И.П. Перспективы использования стволовых клеток в ветеринарии // Ветеринария. 2011. №7.
5. Сидорова В.Ю. Ассоциированные подмножества в замкнутых системах // Математические модели в теоретической экологии и земледелии. М., 2014. С. 65-69.
6. Сидорова В.Ю. Использование различных видов матриксов для культивации стволовых клеток КРС как альтернативного источника получения пищевого белка // Сельское, лесное, рыбное хозяйство и АПК. Воронеж, 2015.
7. Сидорова В.Ю. Культивирование стволовых клеток животных ММСК КРС для пищевых целей по технологии «in vitro» // Аграрная наука. 2016. №7. С. 19-23.
8. Сидорова В.Ю. Особенности специфической деградации пищевых носителей // Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения / ФГБОУ РАМЖ. Быково, 2016. С. 206-210.
9. Культивирование микроорганизмов. СПб., 2012.
10. Моделирование выращивания мяса in vitro на плоских и объёмных носителях // Прикладная мат., квантовая теория и программирование. 2014. Т. 10, №1.
11. Перспективы использования стволовых клеток с. -х. животных в АПК // Биотехнология. 2014. Т. 2.
12. Bhat Z.F. Animal-free meat fabrication // American Journal of Food Technology. 2011. Vol. 6(6). P. 441.
13. Post M. J. Cultured meat from stem cells: Challenges and prospects // Meat Science. 2012. Vol. 92. P. 297-301.
14. Thornton P. K. Livestock production: recent trends, future prospects // Philosophical transactions of the royal society. 2010. Vol. 365. P. 2853-2867.
Literatura:
1. Harakteristika mezenhimnyh stvolovyh kletok, vyde-lennyh iz kostnogo mozga i zhirovoj tkani KRS / Volkova I.M. i dr. // S.-h. biologiya. 2012. №2. S. 32.
2. Ivankin A.N. Gidroliz nanobiomakromolekulyarnyh sistem. M., 2010. 396 s.
3. EHvolyuciya mezhfaznoj poverhnosti v barbotiruemom sloe / A.YU. Nenaezdnikov i dr. // EHnergiya 2008. Ivanovo, 2013. T. 4. S. 327-330.
4. Savchenkova I.P. Perspektivy ispol'zovaniya stvolovyh kletok v veterinarii // Veterinariya. 2011. №7.
5. Sidorova V.YU. Associirovannye podmnozhestva v zamknutyh sistemah // Matematicheskie modeli v teoreti-cheskoj ehkologii i zemledelii. M., 2014. S. 65-69.
6. Sidorova V.YU. Ispol'zovanie razlichnyh vidov matrik-sov dlya kul'tivacii stvolovyh kletok KRS kak al'ternativ-nogo istochnika polucheniya pishchevogo belka // Sel's-koe, lesnoe, rybnoe hozyajstvo i APK. Voronezh, 2015.
7. Sidorova V.YU. Kul'tivirovanie stvolovyh kletok zhi-votnyh MMSK KRS dlya pishchevyh celej po tekhnolo-gii «in vitro» // Agrarnaya nauka. 2016. №7. S. 19-23.
8. Sidorova V.YU. Osobennosti specificheskoj degrada-cii pishchevyh nositelej // Povyshenie konkurentosposob-nosti zhivotnovodstva i zadachi kadrovogo obespeche-niya / FGBOU RAMZH. Bykovo, 2016. S. 206-210.
9. Kul'tivirovanie mikroorganizmov. SPb., 2012.
10. Modelirovanie vyrashchivaniya myasa in vitro na plo-skih i ob"yomnyh nositelyah // Prikladnaya mat., kvanto-vaya teoriya i programmirovanie. 2014. T. 10, №1.
11. Perspektivy ispol'zovaniya stvolovyh kletok sel's.-h. zhivotnyh v APK // Biotekhnologiya. 2014. T. 2.
12. Bhat Z.F. Animal-free meat fabrication // American Journal of Food Technology. 2011. Vol. 6(6). P. 441.
13. Post M. J. Cultured meat from stem cells: Challenges and prospects // Meat Science. 2012. Vol. 92. P. 297-301.
14. Thornton P. K. Livestock production: recent trends, future prospects // Philosophical transactions of the royal society. 2010. Vol. 365. P. 2853-2867.
THE SEQUENCE OF THE ANIMALS STEM CELLS BIOMASS CALCULATING AT ITS GROWING IN VITRO V.Y. Sidorova, doctor of agricultural sciences E.B. Petrov, candidate of agricultural sciences V.V. Mironov, doctor of technical sciences IMJ - branch filial of FGBNY FNAC VIM
Abstract. Methods for animal stem cells biomass calculating are based on the approxi-mate determination of the crop weight. Among them are the Mono method, the method of of the amount of biomass based on the consumption of carbon or oxygen of the substrate calculation, in moles, etc. Studies the division of stem cells optimization during the biomass growth was carried out by applying methods of statistical processing, sorting and searching of literary information, the approximate solution of the task and the optimization method based on detecting the biological characteristics of animals MMSC. The algorithm of stem cell division consists of 2 main stages-interphase and mitosis. Their varies duration is: interphase 8-10 hours or 85% of the cycle, the ac-tual mitosis - 1-2 hours, or 15%. Such multiplicity of division allows to obtain as a result of mitotic cycle the formation of 2 daughter cells from one parent ones. Stem cell life cycle is divided into interphase and mitosis. During interphase there is an active synthesis and accumulation of nutrients. The mitotic cycle with the formation of two cells of the next generation is calculated from the num-ber of 2n, where n - is the number of divisions. All clones of a single cell can be no more than 200 divisions, almost 80, resulting in a 1,20893 E+24 SC. If it is known that the time of one mitosis lasts for 24 hours, then the rate of growth of biomass cells (B) per n cell cycles will be as follows: B = s/1 * n /t, where : l - the number of cells that make up the "frontal"growth line, t - the time of the mitotic cycle. The results of the study can be used: in the calculation of the time and rate of settlement of carrier matrices of various forms of cell cultures of animal stem cells of different shapes, in the planning of the experimental study and the size of the surface area of the carriers in the of different cell volumes setting.
Keywords: cell biomass yield calculation, stem cells division algorithm, kloning, the time of mitosis.
