CC BY
68
УДК 631.152:658.012.011.56:573.6:63
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ОБРАЗЕЦ БИОРЕАКТОРА С СИСТЕМОЙ УПРАВЛЕНИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МЯСА IN VITRO КАК ПЕРСПЕКТИВНОГО ИСТОЧНИКА ПОЛНОЦЕННОГО БЕЛКА
Е.Б. Петров, кандидат сельскохозяйственных наук, заведующий отделом В.Ю. Сидорова, доктор сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник Н.Н. Новиков, кандидат технических наук, заведующий лабораторией Всероссийский научно-исследовательский институт механизации животноводства E-mail: [email protected]
Аннотация. Разработан экспериментальный двухкамерный биореактор с системой управления, поддерживающий технологию культивирования in vitro мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота (ММСК КРС) с целью получения культурального мяса. Разработка научно обоснованных технических решений реакторных блоков и системы управления биореактора проведена на основе экспериментальных данных, полученных лабораторией стволовой клетки ФГБНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко. Сборно-разборные реакторные блоки в своей основе представляют цилиндры высотой 160 мм, диаметрами 100мм (внутренний) и 130 мм (наружный). При сборке образуются культуральные камеры объёмом 1000 мл и камеры для рубашки теплоносителя в целях поддержания стабильной температуры. Цилиндры закрываются верхней и нижней крышками, в которых размещены порты для рабочей камеры и рубашки теплоносителя. Реакторные блоки соединяются с системой тер-мостатирования и между собой силиконовыми трубками через входные/выходные штуцеры. Основные контролируемые параметры процессов в камерах биореактора следующие: температура культивирования 37,0±0,50С; поддержание нейтральной или слабощелочной среды - рН на уровне 7,2-7,4, концентрации СО2 в воздушной смеси на уровне 5%±0,1%, избыточное давление в культуральных камерах 0,2 бара. Для обеспечения стерильности системы предусмотрена фильтрация поступающего воздуха и потоков жидкости, температура стерилизации составных частей биореактора 1220С±1,00С. Система подогрева воздушной и жидкой фаз обеспечивается жидкостным термостатом мощностью 2,2 кВт. Электропитание термостата осуществляется от сети переменного тока напряжением 220В 50 Гц. Контроль рН среды в экспериментальном образце предусмотрен визуально и может быть обеспечен при необходимости автоматически. Устройство предназначено для использования в исследовательских лабораториях, биотехнологической промышленности, ветеринарии, медицине, животноводстве и т.д. Ключевые слова: технические средства, системы управления, технологические схемы, автоматическое регулирование, биореактор, экспериментальный образец биореактора, получение мяса in vitro, стволовые клетки, альтернативный источник белка, культуральное мясо, технология in vitro, получение биомассы.
Введение. В настоящее время во многих странах ведутся исследования, связанные с потенциально возможным прорывом в производстве культурального мяса. Вектор направления включает промышленное обогащение пищевых продуктов белками животного происхождения, а также задел для биотехнологии культивирования различных типов животных клеток.
Предложений технических средств для культивирования стволовых клеток в биореакторах с обеспечением оптимальных параметров для их роста в автоматизированном
режиме нами не встречено. В этой связи перед нами стояла цель разработать инженерные решения, отвечающие биологии культивирования мезенхимных мультипотентных стволовых клеток крупного рогатого скота (ММСК КРС) с целью получения культурального мяса. Разработка научно обоснованных технических решений реакторных блоков и системы управления биореактора проведена на основе экспериментальных данных, полученных лабораторией стволовой клетки Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко [1].
Journal of VNIIMZH №1(25)-2017
83
Методы исследований. Работа проводилась с использованием результатов экспериментальных лабораторных исследований по культивированию ММСК КРС, методов технико-технологического анализа, экспертных оценок, теории исследования операций, конечных автоматов и автоматического регулирования.
Объекты исследований: технологические схемы и устройства для клеточных культур, контрольно-измерительные приборы, каталоги авторских свидетельств и патентов, данные лабораторных экспериментов культивирования ММСК КРС, интернет-ресурс и публикации в научно-техническом фонде периодической литературы.
Результаты исследований. Для культивирования стволовых клеток как альтернативного источника мясного белка по технологии in vitro было разработано культураль-ное устройство, представляющее собой двухкамерный биореактор. Изготовлены экспериментальный образец биореактора и экспериментальный образец системы управления им. Основными блоками культурального биореактора для получения мяса in vitro как полноценного белка являются сборно-разборные реакторные блоки, блоки термостатиро-вания для поддержания температурного режима, подготовки воздушной смеси и управления технологическим процессом (рис. 1).
Сборно-разборные реакторные блоки в своей основе представляют собой цилиндры высотой 160 мм и диаметрами 100 мм (внутренний) и 130 мм (наружный). Таким образом образуются культуральная камера объемом 1000 мл и камера для поддержания стабильной температуры (рубашка для теплоносителя).
Цилиндры имеют крышки (верхнюю и нижнюю), в которых размещены порты для рабочей камеры биоректора и рубашки теплоносителя. Крышки культурального биореактора для получения мяса in vitro как полноценного белка имеют механизмы крепления с культуральными сосудами и крепления культуральных сосудов в сборе на стойке.
Верхняя крышка снабжена портами для подачи подготовленной газовой смеси, конт-
роля параметров СО2, пробоотборника, загрузки/выгрузки, контроля параметров температуры, предохранительного клапана, рубашки биореактора для поддержания температурного режима. Нижняя крышка культу-рального биореактора имеет порт рубашки биореактора для поддержания температурного режима и порт для перемещения жидких компонентов среды.
Рис. 1. Культуральный биореактор для получения
мяса in vitro как полноценного белка: 1 - блок управления биореактором; 2 - сборно-разборные
реакторные блоки (культуральные сосуды); 3 - блок обеспечения и контроля температурного режима
Реакторные блоки соединяются между собой и с системой термостатирования силиконовыми трубками через входные/выходные штуцеры.
Биореактор имеет камеру подготовки культуральной жидкости (камера перемешивания) и камеру роста биомассы ММСК КРС. В камерах обеспечиваются следующие параметры: t = 37,0±0,5°С для жидкой и воздушной фаз, концентрация СО2 в воздушной смеси на уровне 5,0±0,1%, избыточное давление в камерах биореактора 0,2 бара. Поддержание в питательной среде рН по технологии - нейтральная или слабощелочная на уровне 7,2-7,4.
Процесс перемешивания компонентов питательной жидкости в камере перемешивания биореактора может осуществляться практически любым способом, т.к. параметры перемешивания в данном случае могут не учитывать требований, связанных с наличием биообъектов в питательной среде [2, 3, 4].
Обсуждение результатов исследований. Технологический процесс культивирования ММСК КРС состоит из четырех этапов. На первом этапе проходит подготовка питательной среды из компонентов, поступивших в камеру смешивания, из которой культураль-ная среда подается в камеру роста (второй этап).
Во время третьего этапа происходит культивирование ММСК КРС, в результате среда истощается и выделяются продукты метаболизма клеток. В этот же период по мере истощения питательной среды в камере роста одновременно проводится подготовка новой порции культуральной среды в камере смешивания и по обратной связи через блок управления биореактором осуществляется замена истощенной питательной среды (четвертый этап).
Во время четвертого этапа слив среды происходит ламинарно (достаточно медленно для того, чтобы не ухудшить состояние клеток и не повредить их механически). Затем из камеры смешивания таким же образом происходит заполнение камеры роста новой порцией культуральной среды. Начинается новый цикл.
Техническое обеспечение процесса. Система подогрева воздушной и жидкой фаз представлена жидкостным термоблоком с потребляемой мощностью не более 2,2 кВт, питание термостата осуществляется от сети переменного тока напряжением 220 В, частотой 50 Гц. В камере перемешивания экспериментального биореактора для перемешивания компонентов среды нами применено устройство подачи воздушной смеси.
В данном решении имеют место, с одной стороны, наиболее простые и дешевые условия перемешивания компонентов питательной среды с образованием практически однородной концентрации жидкой фазы, а с
другой - достаточно хорошо отработанные способы теоретического расчета режима автономного автоматизированного функционирования: объем и количество элементов питательной жидкости для перемешивания, время перемешивания, скорость подачи питательной среды в камеру роста и другие режимы.
Параметры, необходимые для роста биомассы, учитывающие требования, связанные с необходимостью заселения ММСК КРС, их адгезии, размножения, дифференцировки и роста биообъектов в питательной среде, создаются в камере роста. Процесс перемешивания в камере роста отсутствует, но при необходимости имеется возможность создания «ламинарного течения» питательной среды, чтобы тем самым способствовать обширному контакту матриксов с клетками, которые находятся в толще культуральной среды. Контроль рН среды в экспериментальном образце предусмотрен визуально: норма рН среды 7,2-7,4 - цвет темно-красный, в случае закисления - желтый, защела-чивания - фиолетовый. Контроль рН среды может быть обеспечен при необходимости автоматически.
Компоненты питательной среды и воздушной смеси для перемешивания поступают через соответствующие каналы верхней крышки. Имеется также устройство для про-боотбора.
По технологии процесса в камеру перемешивания смесь атмосферного воздуха с 5% углекислого газа поступает при помощи компрессора JAS1211 с адаптером 220/ 12В. Углекислый газ поступает из углекислотного баллона с регулируемым вентилем и редуктором УР-6-6. Другим компрессором такого же типа осуществляется циркуляция воздушной фазы камеры роста в контуре измерителя концентрации углекислого газа.
В камере перемешивания питательная жидкость одновременно нагревается при помощи жидкостного термоблока на ~220 В, 50 Гц, 2,2 кВт до необходимой температуры 37,0±0,5°С. Замена истощенной питательной жидкости в камере роста по технологии осуществляется каждые четыре дня.
Лоигпа! оГ VNIIMZH №1(25)-2017
85
Полученные продукты метаболизма выводятся через соответствующий порт. В целом, общая схема технологического процес-
са выращивания ММСК КРС состоит из двух основных циркуляционных схем: движения газов и жидкости (рис. 2).
Рис. 2. Схема технологического процесса получения мяса in vitro как полноценного белка
Схема движения газов. Подготовка газовой смеси осуществляется следующим образом. При помощи одностороннего вакуумного или любого другого насоса закачивается в систему атмосферный воздух, в который добавляется 5% углекислого газа (СО2). Углекислый газ поступает в систему из баллона с регулирующим клапаном. Газы смешиваются, прогреваются до необходимой температуры, проходят через фильтр (защита от инфекций), затем разделяются на два потока и поступают в камеру перемешивания и камеру роста. В камере роста в воздушной фазе осуществляется контроль и поддержание в газовой смеси уровня СО2 5%.
Схема движения жидкости. Жидкие компоненты среды - элементы питательной жидкости поступают через вход «жидкие компоненты среды» в камеру перемешивания, где прогреваются до необходимой температуры, перемешиваются с помощью газовой смеси, образуя культуральную среду. Далее среда подается в камеру роста двухсторонним насосом или иным способом.
Движение культуральной среды может происходить в двухстороннем движении - из камеры перемешивания в камеру роста и наоборот. Жидкие продукты метаболизма выводятся через выход «Отходы» из камеры роста.
Ввод/вывод биообъектов. Биообъекты поступают/выводятся через предусмотренный в камере роста вход/выход.
Вывод. В результате проведенных исследований разработаны экспериментальный образец биореактора для получения мяса in vitro как полноценного белка и экспериментальный образец системы управления им, создана система для управления технологическим процессом получения мяса in vitro как полноценного белка в биореакторе.
Предложенное техническое средство для культивирования стволовых клеток в двухкамерном устройстве обеспечивает оптимальные параметры для их роста в автоматизированном режиме и предназначено для использования в исследовательских лабораториях, ветеринарии, животноводстве, биотехнологической промышленности, а также в медицине.
Литература:
1. Характеристика мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани круп-
ного рогатого скота / И.М. Волкова и др. // Сельскохозяйственная биология. 2012. №2. С. 32-36.
2. Сидорова В.Ю. Классификация устройств для культивации стволовых клеток сельскохозяйственных животных ММСК КРС // Новое слово в науке и практике: Материалы XIX науч.-практ. конф. Новосибирск, 2015.
3. Bell S.L. Genetic engineering of hybridoms glutamine metabolism // Enzyme. Microbiolm. Technol. 1996. №17. p. 98-106.
4. Hiller G. W. A kinetic analysis of hybridoma growth and metabolism in suspension culture on serum free medium // Biotechnol. Bioeng. 1995. №23. p. 167-182.
Literatura:
1. Harakteristika mezenhimnyh stvolovyh kletok, vyde-lennyh iz kostnogo mozga i zhirovoj tkani krupnogo ro-gatogo skota / I.M. Volkova i dr. // Sel'skohozyajstven-naya biologiya. 2012. №2. S. 32-36.
2. Sidorova V.YU. Klassifikaciya ustrojstv dlya kul'tiva-cii stvolovyh kletok sel'skohozyajstvennyh zhivotnyh MMSK KRS // Novoe slovo v nauke i praktike: Materialy XIX nauch.-prakt. konf. Novosibirsk, 2015.
3. Bell S.L. Genetic engineering of hybridoms glutamine metabolism // Enzyme. Microbiolm. Technol. 1996. №17. p. 98-106.
4. Hiller G. W. A kinetic analysis of hybridoma growth and metabolism in suspension culture on serum free medium // Biotechnol. Bioeng. 1995. №23. p. 167-182.
AN EXPERIMENTAL MODEL OF A BIOREACTOR WITH THE CONTROL SYSTEM FOR IN VITRO MEAT
AS A COMPLETE PROTEIN PROMISING SOURCE E.B. Petrov, candidate of agricultural sciences, department head V.Y. Sidorova, doctor of agricultural sciences, leading research worker N.N. Novikov, candidate of technical sciences, laboratory chief All-Russian research institute of animal husbandry mechanization.
Annotation. An experimental two-chambers bioreactor with a control system of management supporting the cattle multipotent mesenchymal stem cells (cattle MMSC) in vitro cultivation to obtain a cultured meat is developed. The research justified development of the reactor's components and control system technical solutions of the device was carried out on the experimental data obtained by FGBNY VIEW after Y.R Kovalenko stem cells' laboratory base. The modular-collapsible reactor blocks in its basis have represented cylinders with a height of 160 mm and a diameter of 100mm (internal) and 130 mm (outer). At the assembly the culture chambers with a volume of1000 ml and shirtcameras of heat transfer fluid in order to maintain a stable temperature are formed. The cylinders are closed by top and bottom caps, on which the ports for the working chamber heat transfer fluid shirt are placed. The reactor blocks are connected with each other and with the heating systems and by the silicone tubes through the input/output fittings. The bioreactor chambers processes' main controlled parameters are following: cultivation's temperature 37,0±0,5 °C; pH at the 7,2-7,4 neutral or slightly alkaline's level to maintenance; air mixture CO2 concentration at 5,0±0,1%; 0,2 bar excess pressure in cultured chambers. To ensure the sterility system it is provided the incoming air and other fluid flows filtering, the bioreactor composite parts' sterilization temperature is 122±1,0°C. The air and liquid phases heated system is provided by liquid thermostat with a 2,2 kWt capacity. The thermostat's power supply is provided by the alternating current network with voltage 220 V, 50 Hz frequency. The experimental device pH control is visually provided and can be provided automatically. The device is intended for research laboratories, biotechnology industry, veterinary medicine, animal husbandry and etc. using.
Keywords: technical tools, control systems, technological schemes, automatic adjustment, bioreactor, experimental model of a bioreactor, in vitro meat getting, stem cells, an protein alternative source, cultured meat, in vitro technology, biomass obtaining.
Journal of VNIIMZH №1(25)-2017
87
