CC BY
44
УДК 541.15:615.40:54
ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЕЧЕННОГО ТЕХНЕЦИЕМ-99М ПРОТИВОМИКРОБНОГО ПРЕПАРАТА НОРФЛОКСАЦИНА ГИДРОХЛОРИДА
В.С. Скуридин, Н.В. Варламова, Л.А. Ларионова
Томский политехнический университет E-mail: [email protected]
Проведены исследования по созданию стандартного реагента для получения меченного 99шТс норфлоксацина гидрохлорида (НФГ). Оценку влияния компонентов реакционной смеси на радиохимическую чистоту получаемого препарата проводили методом тонкослойной хроматографии. На экспериментальных животных (кроликах) с моделью воспаления различной локализации показана функциональная пригодность меченого антибиотика для диагностики воспалительных процессов.
Ключевые слова:
Реагент, антибиотик, изотоп 99шТс, хроматография.
Key words:
Reagent, antibiotic, 99шТс isotope, chromatography. Введение
Диагностика инфекционно-воспалительных заболеваний остается одной из наиболее актуальных проблем современной медицины и требует разработки новых подходов, поскольку даже такие современные лучевые методы исследования как компьютерная, магнитнорезонансная томография не позволяют выявить воспалительный процесс до появления анатомических изменений в ткани, то есть на ранней стадии развития процесса. С использованием этих методов не может быть решена и другая, не менее важная проблема, связанная с трудностью в разграничении бактериальной и асептической форм воспаления. Это обусловлено тем, что патофизиологические различия в том и другом случаях незначительны (увеличивается проницаемость капилляров, высвобождаются медиаторы воспаления, происходит миграция клеток воспаления (как гранулоцитов, так и лимфоцитов)). При этом единственным достоверным дифференциальным признаком был и остаётся факт наличия патогенных микроорганизмов в воспалительном очаге.
Решением этой проблемы может служить использование радионуклидных методов индикации, которые во многих случаях позволяют сделать оценку патофизиологических изменений в поврежденных органах и тканях методом гамма-сцинтиграфии.
Возможность использования фторхинолонов (ФХ) в ядерной медицине была впервые продемонстрирована на ципрофлоксацине гидрохлориде (ЦФГ). Введение изотопной метки (99шТс) в его структуру явилось новым подходом к проблеме визуализации воспалительных очагов [1]. Кроме того, ФХ связывают и ингибируют фермент ДНК-гиразу, присутствующий в делящихся бактериях. Вследствие этого нарушается репликация ДНК и синтез клеточных белков микроорганизмов [2]. Считается, что ФХ не связываются с мёртвыми бактериями и не накапливаются в участках асептического воспаления [3], за счёт этого обеспечивается высокая специфичность радиофармпрепарата (РФП) к воспалительным очагам. Первые испытания
Скуридин Виктор Сергеевич,
д-р техн. наук, профессор, зав. лабораторией № 31 Физикотехнического института ТПУ. E-mail: [email protected]
Область научных интересов: ядерная физика, радиохимия. Варламова Наталья
Валерьевна, канд. биол. наук, научный сотрудник
лаборатории № 31 Физико-
технического института ТПУ. E-mail: [email protected]
Область научных интересов: радиохимия, фармакология. Ларионова Людмила
Александровна, ст. научн. сотрудник лаборатории № 31 Физико-технического института ТПУ.
E-mail: [email protected]
Область научных интересов: радиохимия.
показали высокую точность сцинтиграфии с ЦФГ, меченным 99mTc (99тТс-ЦФГ) в диагностике септических процессов. Так в исследовании A.V. Hall и соавт. [4] чувствительность сцинтиграфии с данным РФП составила 70 %, а специфичность - 93 %. Особенности физиологического распределения 99тТс-ЦФГ, в частности низкая аккумуляция его костным мозгом, определяют спектр его клинического применения: наиболее успешно РФП
используется для диагностики воспалительных заболеваний костей [5, 6] и септических осложнений после ортопедического протезирования [3]. Существуют также отдельные публикации, свидетельствующие о возможности использования данного РФП для диагностики бактериального эндокардита [9], которая обусловлена низкой физиологической аккумуляцией 99тТс-ЦФГ в грудине и лёгких.
Наряду с этим, следует также отметить, что в литературе отсутствуют какие-либо сведения о попытках получения норфлоксацина гидрохлорида (НФГ), меченного 99тТс (99тТс-НФГ), который по своим характеристикам близок с 99тТс-ЦФГ и тоже имеет все предпосылки для использования в диагностике воспалительных процессов.
В этой связи цель работы состояла в проведении исследований, направленных на разработку радиофармпрепарата «Норфлоксацин, 99тТс», проведение экспериментальных исследований его безопасности и эффективности использования для сцинтиграфической диагностики очагов бактериального воспаления.
Материалы и методы
Поскольку сам по себе 99тТс^П), содержащийся в элюате, не склонен к комплексообразованию, в состав стандартных наборов, как правило, входит восстановитель для перевода радионуклида в более низкую степень окисления (+IV или +V), что способствует получению его различных агрегированных структур [7]. Чаще всего для восстановления пертехнетата в таких наборах употребляется двухвалентное олово (SnCl2). Процесс получения 99тТс-ФХ в присутствии ионов Sn2+ можно приближенно охарактеризовать схемой [8]:
99тТсО- + Sn(n^X ФХ,Н2° >99т Tc - Sn - ФХ + Snavyre .
ФХ - используемый фторхинолон.
Для проведения исследований в работе использовался НФГ, синтезированный в Институте органического синтеза УрО РАН, олово двухлористое, производитель ICN Biornedicals’Inc; аммиак водный, этилацетат, изопропиловый спирт, ацетон. Раствор натрия пертехнетата ,99тТс с РХЧ > 99 % получали из хроматографического генератора технеция «99тТс-ГТ-ТОМ» производства Томского политехнического университета.
Хроматографирование полученных смесей реагентов проводили на пластинах силикагеля для тонкослойной хроматографии «Sorbfil», ПТСХ-А-АФ-УФ с подложкой из алюминиевой фольги, сорбент содержал флуоресцентный индикатор (X = 254 нм).
Исходные реагенты для получения препарата готовились в виде смесей НФГ и восстановителя SnCl2. Флаконы укупоривали резиновой пробкой с алюминиевым колпачком и стерилизовали в автоклаве. В полученные таким образом реагенты вводили раствор натрия пертехнетата, 99тТс с активностью 2...3 ГБк с последующей инкубацией смесей при комнатной температуре в течение 20 мин до полного растворения смесей.
Для оценки влияния компонентов набора на радиохимическую чистоту (РХЧ) получаемых препаратов использовался метод тонкослойной хроматографии в различных средах. Методика хроматографирования состояла в следующем. На полоску пластины силикагеля, предварительно очищенную концентрированным раствором аммиака, размером 20^100 мм, отступив от одного из краев на 10 мм, наносили испытуемый раствор объемом 5 мкл. После подсушивания на воздухе в течение 1 мин полоски помещали в камеру, предварительно насыщенную парами соответствующего растворителя. Продолжительность хроматографирования составляла 10.40 мин в зависимости от используемой смеси. Полученные радиохроматограммы после просушивания на воздухе и обклеивания с обеих сторон полиэтиленовой лентой с липким слоем разрезали, начиная от линии старта, на полоски длиной 10 мм и измеряли их радиоактивность (скорость счета) на одноканальном анализаторе импульсов - радиометре 20046.
Для определения местоположения на хроматограммах немеченого НФГ использовали раствор Драгендорфа. После обработки хроматограмм этим раствором определяли местоположение пятна аминогруппы.
В биологических испытаниях было использовано 10 кроликов-самцов породы «Шиншилла серебристая» массой 2,9...3,5 кг, 120 белых крыс линии «Вистар» массой 140...180 г обоего пола и 10 беспородных собаках обоего пола массой 12,2.14,6 кг. Экспериментальные животные были получены из вивария НИИ фармакологии СО РАМН (г. Томск). Содержание и участие в эксперименте животных осуществляли в соответствии с правилами, принятыми «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 1986). Вещества вводили животным в виде водных растворов.
Возможность специфичной визуализации очагов бактериального воспаления с помощью полученного РФП изучали на кроликах. Основная группы включала 5 кроликов, у которых в области правой лопатки моделировали стафилококковый абсцесс по методу Л.А. Мамедова с соавт. [9]. Процесс формирования подкожного инфильтрата оценивали методом клинического наблюдения. К 7 суткам эксперимента в месте инъекции флогогенного агента формируется характерный абсцесс. Группа сравнения была представлена 5 кроликами, у которых вызывали асептическое воспаление той же локализации путём подкожной инъекции 4 мл скипидара [10]. В соответствии с используемой методикой, раствор РФП кроликам вводили в краевую вену уха в дозе 5,3 МБк/кг. Кинетику распределения «Норфлоксацин, 99mTo> в организме животного фиксировали покадровой записью каждые 15 мин в течение 4 ч (16 кадров по 1 мин). Сцинтиграфию тела кроликов выполняли на гамма-камере «ГСК-301Т» («ВНИИМП», Россия). Обработку сцинтиграфических данных проводили с помощью автоматизированной системы «Сцинти» (ООО «Гелмос», Россия).
Фармакокинетику РФП в организме экспериментальных животных изучали на 70 белых крысах обоего пола линии «Вистар» массой 140.180 г, которым в бедренную вену однократно вводили РФП в диагностической дозе (5,3 МБк/кг). Животных декапитировали группами по 5 особей через 1, 3, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150 и 180 мин после инъекции РФП для последующей радиометрии (содержание РФП в процентах от введённого количества на 1 мл или 1 г органа или ткани). Радиометрию органов и тканей (кровь, сердце, печень, лёгкие, почки, желудок, кишечник) проводили на гамма-спектрометре «Tracor Analytic».
Оценку токсичности РФП «Норфлоксацин, 99mTo> исследовали согласно «Методическим указаниям по изучению общетоксического действия фармакологических средств».
Гематологические исследования включали в себя анализ периферической крови крыс (содержание гемоглобина, эритроцитов, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов) через 1, 3, 7, 15 и 30 суток после однократного внутривенного введения РФП в 10-кратно завышенной диагностической дозе (53 МБк/кг), по сравнению с диагностической дозой.
Определение гемолитического действия «Норфлоксацин, 99mTo> в дозе (« 53 МБк) проводили, используя цитратную кровь трёх доноров. Для этого, кровь стабилизировали трёхзамещённым цитратом натрия в соотношении 9:1 (концентрация цитрата 0,38 %). Фотометрирование проводили с помощью фотоэлектроколориметра по оптической плотности раствора, с использованием зелёного светофильтра в кювете, с расстоянием между рабочими гранями 0,5 см. Степень гемолиза выражали в единицах оптической плотности раствора по сравнению с контролем [11, 12].
Реакцию организма на однократное внутривенное введение РФП изучали на 10 собаках, по 5 в группе. При этом учитывали параметры артериального давления (АД), определяли частоту дыхательных движений (ЧДД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС). АД измеряли прямым способом при помощи электроманометра, соединённого с катетером, введённым в сонную артерию, на отечественном полиграфе «Салют» до введения, и через 1, 5, 20, 60 и 120 мин после инъекций РФП в 10-кратно завышенной диагностической дозе (53 МБк/кг).
Методы статистической обработки результатов
Статистическую обработку результатов, полученных при экспериментальном изучении состава комплексов, образующихся при взаимодействии реагентов с раствором натрия
99т^ 99тгг
пертехнетата, Тс, а также распределение Тс по длине радиохроматограмм проводили с использованием критерия Стьюдента при доверительной вероятности 0,95 и доверительном интервале ± 1 % от среднего значения. Измерения проводили не менее 5 раз с последующим внесением поправки на время распада радионуклида. Статистическую обработку результатов биологических исследований, функциональной пригодности и специфичности РФП «Норфлоксацин, 99тТс» осуществляли с использованием пакетов программ статистической обработки «Атом», «Statistica-6.0», а также методами вариационной статистики с использованием показателя Вилкоксона-Манна-Уитни (непараметрическими критериями Манна-Уитни и Вилкоксона) для оценки отличий количественных признаков между группами [13].
Экспериментальные результаты и их обсуждение
В табл. 1 представлены результаты хроматографирования исходного элюата 99тТс и продуктов его взаимодействия отдельно с НФГ и Бп (II) в объёме элюата 5 мл, а также тройной смеси [НФГ + Бп (II) + КаТс04] в том же объёме элюата. В качестве подвижной фазы использовалась смесь «этилацетат:изопропиловый спирт: концентрированный аммиак».
99т
Из радиохроматограммы «чистого» элюата Тс следует, что пертехнетат-ионам 99тТс (VII) соответствует пик, расположенный на 9 см (Rf = 0,9). В том же месте пик наблюдается и на хроматограммах смеси НФГ с элюатом, что свидетельствует об отсутствии его взаимодействия с 99тТс (VII). При смешивании элюата с Бп (II) пик на хроматограмме смещается в область 2 см = 0,2), что говорит об образовании восстановленного 99тТс (предположительно 99тТс (IV)) или его комплекса с оловом.
В отличие от них, на хроматограмме тройных смесей [НФГ + Бп (II) + КаТс04] проявляются три пика. С учётом того, что в этой подвижной фазе пятно аминогруппы, после обработки хроматограммы реактивом «Драгендорфа», просматривается на 5 см, можно предполагать, что 2 и 3 пики относятся к НФГ, меченному 99тТс, возможно, к двум различным комплексам с 99тТс: [НФГ-Бп (ГУ)-99тТс (IV)] и [НФГ-99тТс (IV)]. При этом 1 пик соответствует комплексу 99тТс (VI) с оловом.
Таблица 1. Результаты хроматографирования смеси [НФГ + Бп(П) + КаТс04] и отдельных её компонентов. Подвижная фаза: этилацетат:изопропиловый спирт:аммиак
Исследуемая смесь Расстояние от линии старта, Ь, см
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Активность, имп/с
Раствор ЫаТс04 59 85 49 121 75 77 78 11 416 187959 82
НФГ + ЫаТс04 318 352 315 321 414 • 600 901 11 546 181213 115
Бп (II) + ЫаТс04 10512 184846 262 497 418 397 556 807 100 89
НФГ + 8п(П) + ЫаТс04 6486 92884 1568 1536 8688 • 1500 1545 3 916 3016 375
(•) - местоположение пятна аминогруппы.
Предварительные испытания РФП на экспериментальных животных показали, что основное накопление изотопной метки происходит в печени, что свойственно препаратам, имеющим коллоидную структуру. При этом с учётом достаточно хорошей растворимости ФХ в водных средах, мы пришли к выводу, что основной причиной образования коллоида является
99т
гидролиз комплекса олова с Тс.
С целью снижения количества коллоида в получаемом РФП были проведены исследования в двух направлениях. Первый путь состоял в смещении величины рН среды при смешивании реагентов с элюатом 99тТс в более кислую область, второй - в изменении общего количества Бп (II) в составе реагента, для нахождения оптимальной концентрации восстановителя.
Количество коллоида в приготавливаемом РФП, помимо хроматографирования, определяли методом фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, с последующим
^ 99Ш'Т'
проведением расчетов его количества по разнице измеренных активностей Тс до и после фильтрации РФП, отнесенной к исходной его активности. Из данных, представленных на рис.
1, следует, что, по мере изменения рН от 4 до 1,9, количество коллоида в РФП снижается от 93 до 0,7 %, соответственно. Следовательно, для получения РФП с предельно низким содержанием коллоида величина его рН не должна превышать 2, что ограничивает возможность его использование для внутривенного введения.
В этом плане предпочтительным оказался путь снижения коллоида за счет уменьшения в составе исходного реагента количества 8п (II).
рН
Рис. 1. Изменение содержания радиоактивного коллоида в РФП «Норфлоксацин, 99тТс» в зависимости от рН среды
После проведения ряда экспериментов выяснили, что при снижении в исходном реагенте концентрации 8п (II) минимальное количество коллоида в РФП составляет около 5 %, что, в принципе, позволяет его использовать без дополнительной фильтрации. Об этом же говорят представленные сцинтиграммы (рис. 2 и 3).
Рис. 2. Сцинтиграмма крысы через 1,5 ч после введения РФП «Норрофлоксацин, 99тТс», приготовленного на основе реагента, содержащего максимально допустимое количество Sn (II). Основное накопление препарата происходит в печени
Рис. 3. Сцинтиграмма крысы через 1,5 ч после введения РФП «Норфлоксацин, 99тТс», приготовленного на основе реагента, содержащего минимально допустимое количество Sn (II). Основное накопление препарата происходит в почках
Кроме приведённых исследований по коллоидообразованию были проведены эксперименты по оптимизации условий, обеспечивающих в РФП минимальную величину радиохимической примеси невосстановленных ионов 99тТс(УП). По существующим нормам, она не должна превышать 1 % от общей активности введённого 99тТс. Также была проведена оптимизация исходного состава реагента по содержанию НФГ. Таким образом, в результате проведённых исследований был определен оптимальный состав исходного реагента для получения НФГ меченного технецием-99м. После введения во флаконы с такими реагентами раствора натрия пертехнетата, 99тТс из генератора и инкубации при комнатной температуре в течение 20 мин получается РФП «Норфлоксацин, 99тТс».
Изучение биологических свойств РФП «Норфлоксацин, 99тТс» проводилось по следующей программе: изучение диагностической пригодности для специфической
визуализации очагов бактериального воспаления, фармакокинетика РФП в организме экспериментальных животных, оценка степени их безвредности (влияния на состояние периферической крови и функциональное состояния внутренних органов), определение срока годности и срока хранения.
Для изучения диагностической пригодности РФП у экспериментальных животных был смоделирован абсцесс путём введения в область лопатки культуры «St. Aureus». Для сравнения использовали группу животных, у которых вызывали асептическое воспаление той же локализации, путём подкожной инъекции 4 мл скипидара. После инфузии РФП, в первом случае абсцесс наилучшим образом визуализировался через 1,5.2 ч (рис. 4), во втором случае - патологической гиперфиксации зарегистрировано не было (рис. 5).
Рис. 4. Сцинтифото тела кролика с абсцессом, полученное через 1,5 ч после внутривенной инъекции «Норфлоксацин, 99тТс». Накопление РФП в области абсцесса
Это свидетельствует о том, что РФП «Норфлоксацин, 99тТс» способен избирательно накапливаться в очаге бактериального воспаления и, следовательно, является пригодным для диагностики данной патологии.
В результате изучения фармакокинетики РФП на крысах было выявлено, что аккумуляция РФП «Норфлоксацин, 99тТс» в почках начинается сразу же после введения, достигает максимума на 30 мин и составляет 32,7 ± 1,3 % от введенной активности. На 180 мин в почках регистрировалось 25,5 ± 1,2 % от введенной дозы. Выведение тТс-ФХ из сосудистого русла было достаточно быстрым - к 5 мин исследования в 1 мл крови оставалось не более 4 % от активности введенного радионуклида. В ткани печени к 60 мин сохранялось
7.1 ± 1,2 % от введенной дозы РФП «Норфлоксацин, 99тТс», что составило около 50 % максимального содержания, зафиксированного на 10 мин после инъекции. В других внутренних органах на всех сроках опыта отмечен низкий процент аккумуляции РФП: от
1.2 ± 0,3 % в легких до 3,5 ± 1,3 % в тонком кишечнике.
Таким образом, для физиологического распределения исследуемого РФП характерна преимущественная аккумуляция в почках и печени, при малом накоплении в органах средостения и костном мозге.
При изучении влияния РФП «Норфлоксацин, 99тТс» на состояние периферической крови было установлено отсутствие токсического воздействия на клетки крови. В течение всего периода наблюдения (30 суток) однократное внутривенное введение раствора РФП «Норфлоксацин, 99тТс» в дозе, 10-кратно превышающей диагностическую (5,3 МБк/кг), не вызывало существенных изменений со стороны показателей белой крови крыс. Так, общее количество лейкоцитов оставалось в пределах исходных значений на протяжении всего эксперимента, а содержание их отдельных форм не отличалось от контрольного. Абсолютное количество эритроцитов на всех сроках исследования также существенно не изменялось и варьировало в пределах исходных значений.
Рис. 5. Сцинтифото тела кролика с очагом асептического воспаления в области лопатки, полученное через 1,5 ч после внутривенной инъекции «Норфлоксацин, 99тТс». Отсутствие накопления РФП в зоне скипидарного воспаления
Об отсутствии токсического влияния РФП на клетки крови свидетельствует также тот факт, что при его инфузии в периферической крови не наблюдалось появления деструктивно измененных форм лейкоцитов и патологических включений в эритроциты.
Опыты, проведенные по изучению влияния РФП «Норфлоксацин, 99тТс» на осмотическую резистентность эритроцитов здоровых доноров, показали, что РФП не обладает гемолитическим действием.
Функционально-структурные изменения внутренних органов:
На протяжении 30 мин после введения животным 10-кратно завышенной дозы РФП (53 МБк/мл) мы не наблюдали изменения основных физиологических констант дыхания и кровообращения. Так, АД у животных существенно не изменялось. При этом максимальная величина этого показателя была зафиксирована на 1 мин после введения РФП, а минимальные на 20 и 120 мин после инъекции. ЧДД и ЧСС также существенно не изменялись на протяжении всего периода наблюдения. Максимальные показатели ЧДД были зарегистрированы на 5 мин, а минимальные -на 60 мин эксперимента.
Исследование стабильности реагентов в процессе хранения в течение 3 месяцев показало их высокую стабильность, что создает перспективы для последующего
приготовления реагентов в виде лиофилизатов. Установлен срок годности РФП «Норфлоксацин, 99тТс», который составил 3 ч от времени его приготовления.
На основе проведённых исследований разработана схема аналитического контроля качества РФП и спецификация. Представлены результаты анализов 5 серий РФП по основным показателям: описание, подлинность, объёмная активность, радиохимическая примесь,
химические примеси, стерильность, бактериальные эндотоксины в течение срока годности.
Заключение
В результате проведенных исследований по созданию нового РФП «Норфлоксацин, 99тТс» получены следующие результаты:
1. Основным фактором, отрицательно влияющим на качество РФП «Норфлоксацин, 99тТс» является коллоид олова, образующийся в результате гидролиза Sn (II) и Sn (IV) хлоридов, и, поглощающий до 70 % активности 99тТс. Снижение коллоидообразования путём изменения рН среды и за счёт уменьшения концентрации Sn (II) в исходном реагенте повышает биодоступность РФП.
2 Сцинтиграфические исследования на животных, инфицированных «St. Aureus», показали диагностическую пригодность РФП «Норфлоксацин, 99тТс» для обнаружения воспалительных процессов. После внутривенной инъекции РФП селективно накапливается в очаге бактериального воспаления с интенсивностью, достаточной для получения качественных сцинтиграфических изображений.
3. Для физиологического распределения исследуемого РФП характерна преимущественная аккумуляция в почках и печени с последующим элиминированием мочевыводящей системой. РФП в малом количестве накапливается в органах средостения и костном мозге. Эта особенность открывает перспективы его использования в ортопедической, пульмонологической и кардиологической практике.
4. Показано, что на фоне введения 10-кратно завышенных диагностических доз РФП «Норфлоксацин, 99тТс» не выявляется структурных изменений со стороны периферической крови и функциональных нарушений сердечно-сосудистой и дыхательной систем, свидетельствующих о наличии у данного РФП токсического действия.
Работа выполнена по проекту № 11-03-98009-р_сибирь_а «Разработка методов получения меченых технецием-99м фторхинолонов для диагностики воспалительных процессов», финансируемому в 2011 г.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Britton K., Vinjarnuri S., Hall A.V., et al. Clinical evaluation of 99тТс infection for the localization of bacterial infection // Eur. J. Nucl. Med. - 1997. - V. 24. - P. 553-556.
2. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. Справочник. - М: АстраФармСервис, 1996. - С. 791-792.
3. Vinjarnuri S., Hall A.V., Solanki K.K., et al. Cornparison of 99inTc-Infection irnaging with radiolabelled white-cell irnaging in the evaluation of bacterial infection // Lancet. - 1996. -V. 347. - Р. 233-235.
4. Hall A.V., Solanki K.K., Vinjarnuri S. et al. Evaluation of the efficacy of 99inTc-Infecton, a novel agent detecting sites of infection // J. Clin. Pathol. - 1998. - V. 51. - Р. 215-219.
5. Prandini N., Feggi L., Panareo S., et al. The study of bone infections with 99inTc-ciprofloxacin // Eur. J. Nucl. Med. - 2001. - V. 28. - Р. 1217.
6. Soroa V.E., Cabrejas R.C., Alonso C., et al. Five year experience with ciprofloxacin-99mTc (Infecton) in the bone infected patients // Eur. J. Nucl. Med. - 2O01. - V. 28. - Р. 1216.
7. Зайцева Л.Л., Величко А.В., Виноградов И.В. Итоги науки и техники. - М.: ВИНИТИ. -1984. - Т. 9. - С. 180.
8. Кодина Г.Е. Изотопы: свойства, получение, применение / под ред. В.Ю. Баранова. В 2 т. -М.: Физматлит, 2005. - Т. 2. - С. 311-483.
9. Мамедов Л.А., Николаев А.В., Юнусходжаев Э. и др. Способ создания модели абсцесса в эксперименте // Архив патологии. - 1988. - № 8. - С. 82-83.
10. Чернух А.М. Воспаление. - М.: Медицина,1979. - С. 290-376.
11. Алексеева Г.А., Петкевич А.И. К методике определения аллергогенных свойств химических веществ // Санитария и гигиена. - 1972. - № 3. - С. 64-67.
12. Арзамасцев Е.В., Гуськова Т.А., Либерман С.С. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств // Ведомости фармакологического комитета. - 1998. - № 1. - С. 27-32.
13. Гмурман В.Е. Теория вероятностей и математическая статистика. - М.: Высшая школа, 2000. - 479 с.
Поступила 28.11.2011 г.
