CC BY
37
УДК 578.74
ПОЛУЧЕНИЕ ГУМАНИЗИРОВАННОГО Fab-ФРАГМЕНТА НЕЙТРАЛИЗУЮЩЕГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ ВИРУСА БЕШЕНСТВА
П.Г. Свешников1, Т.А. Ягудин2, Е.В. Морозкина2, Е.В.Клячко2, С.С. Зацепин2, С.В. Беневоленский2, О.Б. Шемчукова3, Л.П. Позднякова3, О.Н. Солопова3
('кафедра биоинженерии биологического факультета МГУ; 2Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН; ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения»; e-mail: [email protected])
Получен функциональный гуманизированный Fab-фрагмент нейтрализующего антитела против вируса бешенства - прототип терапевтического средства, способного заменить лошадиный или донорский антирабический иммуноглобулин. Проведено клонирование и секве-нирование вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепей высокоаффинного нейтрализующего антитела против вируса бешенства. Проведены замена константных мышиных участков на человеческие, наработка гуманизированных Fab-фрагментов в дрожжевой системе экспрессии. Исследованы иммунохимические свойства полученных Fab-фрагментов методами ИФА, электрофореза в ПААГ и вестерн-блота. Получен гуманизированный Fab-фрагмент антитела против вируса бешенства, по аффинности превосходящий исходное антитело. Высокая степень гуманизации подтверждена при помощи сывороток, специфичных по отношению к человеческим иммуноглобулинам. Выход гуманизированного Fab-фрагмента составил 21 мг из 1 л культуральной среды, в препарате отсутствуют изолированные легкие и тяжелые цепи гуманизированного Fab-фрагмента.
Ключевые слова: вирус бешенства, Fab-фрагмент, гуманизация.
Введение
По данным Всемирной организации здравоохранения более 55 тыс. человек в мире ежегодно умирают от бешенства, более половины из них - дети до 15 лет [1]. Переносчиками вируса бешенства являются зараженные животные, главным образом собаки. Только в Москве ежегодно фиксируется более 30 тысяч укусов собаками, при этом в большинстве случаев нельзя исключать инфицирование вирусом бешенства, поскольку досимптомной диагностики бешенства не существует. В случае развития симптомов болезнь становится практически неизлечимой и приводит к быстрой смерти [2].
Основным способом борьбы с бешенством на сегодняшний день является иммунизация человека и домашних животных. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует поголовную профилактическую вакцинацию домашних животных (кошек и собак) и антирабическую вакцинацию людей в случае их контакта с животным, у которого подозревается бешенство. После контактов третьей категории, к которым относятся укусы, а также для людей с ослабленной иммунной системой ВОЗ рекомендует пассив-
ную иммунизацию, т.е. введение антирабического иммуноглобулина [1]. В качестве такого иммуноглобулина применяют лошадиную сыворотку, содержащую антитела против вируса бешенства. Серьезные побочные эффекты вплоть до анафилактического шока, а также быстрый клиренс заметно ограничивают применение сывороток животного происхождения. Энзи-матическое расщепление иммуноглобулинов лошадиной сыворотки до РаЬ'2-фрагментов лишь частично снижает иммунногенность, приводя к существенному удорожанию препарата [3]. Человеческий иммуноглобулин от вакцинированных добровольцев не может удовлетворить всех потребностей в нем. Кроме того, препараты, полученные с использованием человеческого материала, несут в себе опасность ятрогенного инфицирования.
Заменой человеческого иммуноглобулина, предохраняющего от заболевания бешенством, могут стать гуманизированные моноклональные антитела, способные нейтрализовать вирус. Ранее в нашей лаборатории была получена панель мышиных моноклональных антител к вакцинному штамму вируса бешенства (ВБ)
"Внуково-32" [4]. В результате детального изучения свойств антител [4, 5] было отобрано антитело 1С5, имеющее следующие свойства:
1) взаимодействует с гликопротеидом ВБ;
2) взаимодействует со всеми исследованными штаммами ВБ (всего было исследовано 33 штамма, среди которых все основные штаммы ВБ, встречающиеся на территории России, а также штаммы из Центральной Европы, Украины, США и Африки);
3) обладает вируснейтрализующей активностью порядка 10 LD50 как по отношению к вакцинному штамму "Внуково-32", так и по отношению к диким штаммам ВБ, тогда как аналогичный показатель для коммерческого лошадиного иммуноглобулина составляет 6,6 102 LD50;
4) обладает 100%-м лечебным действием: мыши, зараженные сверхлетальными дозами ВБ (8-10 LD50), выживали без развития симптомов бешенства, если в течение 2-48 ч после заражения им был введен препарат на основе антитела 1С5. Коммерческий лошадиный иммуноглобулин защищал только 16% зараженных животных.
Все перечисленные выше свойства антитела 1С5 дают ему явные преимущества по сравнению с лошадиным иммуноглобулином. К этому нужно добавить простоту стандартизации препаратов на основе моноклональных антител по сравнению с поликло-нальными сыворотками. Однако антитело мышиного происхождения не может считаться идеальным терапевтическим средством, поскольку имеет иммунно-генные свойства. Для устранения иммунногенности константные области мышиного антитела должны быть заменены на человеческие.
Материалы и методы
Для амплификации плазмид мы использовали штамм E. coli Top10F' (Invitrogen), для дрожжевой трансформации - штамм Pichia pastoris GS115 (Invitrogen). Вектор pPICZaA (Invitrogen) использовали для создания дрожжевых экспрессионных векторов.
Для построения пространственной модели Fv-фрагмента антитела 1С5 по его аминокислотной последовательности использовали Интернет-программу WAM [6].
ДНК-фрагменты, кодирующие тяжелую и легкую цепи гуманизированного Fab-фрагмента антитела 1С5, были синтезированы из перекрывающихся олигонук-леотидов [7] и клонированы по сайтам XhoI-XbaI в вектора pPICZaA и pPICZaA-APmeI соответственно. В результате были получены плазмиды pPICZaA-AR-H и pPICZaA-APmeI-AR-L. Плазмида pPICZaA-
AR-HL, содержащая обе цепи Fab-фрагмента в составе вектора, была получена путем клонирования Д^П-ДатШ-фрагмента вектора pPICZaA-ÂPmeI-AR-L в Д^П-сайт вектора pPICZaA-AR-H.
Плазмида была линеаризована по PmeI и введена в клетки штамма GS115 с помощью электропорации [8]. Трансформанты были отобраны на полной среде с глюкозой (YPD), содержащей Zeocin™ в концентрации 100 мкг/мл.
Интеграция линеаризованного вектора в геном ре-комбинантных клонов P. pastoris подтверждена с помощью ПЦР с использованием праймеров, специфичных к генам антител и геномной ДНК трансформантов в качестве матрицы [9].
Отобранные трансформанты выращивали аналогично методике, приведенной в [10]. Культу ральные жидкости трансформантов проанализированы с помощью непрямого ИФА. Определение констант связывания антител проводили, как описано в методике [11], с модификациями [12].
Специфичность моноклонального антитела определяли методом вестерн-блот [13], используя гликопротеид ВБ. Степень чистоты рекомбинантного человеческого Fab' контролировали при помощи электрофореза в 10%-м полиакриламидном геле в присутствии SDS в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях в ступенчатой буферной системе Лэмлли [14].
Результаты
Гены, кодирующие мышиное моноклональное антитело (мАт) 1С5, были клонированы из соответствующей гибридомы и секвенированы, как описано в работе [10]. Полученную аминокислотную последовательность вариабельных доменов мАт 1С5 и молекулярное моделирование использовали для конструирования гуманизированного варианта мАт 1С5 аналогично тому, как это было описано для мАт F19 [15].
Сначала были определены границы каркасных областей (Framework), согласно работе [16]. Для каждой каркасной области мы нашли 50 ближайших гомологов в базах данных мышиных и человеческих антительных последовательностей гаметной ДНК. Несколько систематических различий было найдено при сравнении мышиной и человеческих выборок. Аминокислоты в таких позициях рассматривались в качестве кандидатов на гуманизацию [17].
При анализе последовательностей вариабельных доменов мышиного антитела 1С5 мы идентифицировали возможные ключевые аминокислотные остатки, определяющие связывание с антигеном, а именно определили аминокислотные остатки, которые являются
частью канонических структур конформаций СЭЯ, предложенных в работе [18] (эти остатки потенциально участвуют в укладке VL-VH [18]). Были также найдены аминокислоты, редко встречающиеся в последовательностях мышиных антител [19]. При анализе пространственной модели Бу-фрагмента мышиного антитела против вируса бешенства (рис. 1) были определены аминокислотные остатки, которые находятся в радиусе 5 А от СЭЯ и могут участвовать в связывании с антигеном.
Все вышеперечисленные позиции были исключены из числа кандидатов на гуманизацию. В итоге мы получили консенсусную последовательность гуманизированного вариабельного домена антитела 1С5, состоящую из аминокислот, наиболее часто встречающихся в человеческих гомологах мышиного антитела 1С5, а также аминокислот мышиного антитела 1С5, определяющих связывание с антигеном. Из полученных последовательностей были удалены любые потенциальные сайты гликозилирования. Кроме того, были сделаны обратные замены на мышиные аминокислоты из-за опасности нарушить конформацию Бу-фрагмента (3 для тяжелой цепи и 1 для легкой). Таким образом мы получили последовательность гуманизированного вариабельного домена антитела 1С5 (рис. 2).
Аминокислотная последовательность цепей гуманизированного БаЬ-фрагмента была получена путем слияния аминокислотной последовательности гуманизированных VH и VL с аминокислотной последовательностью человеческих константных доменов ^01 СН1 и С-каппа соответственно [20]. Нуклеотид-ная последовательность цепей гуманизированного БаЬ-фрагмента была составлена из наиболее часто встречающихся в Р. раъШгъ кодонов.
Гены легкой и тяжелой цепей БаЬ-фрагмента гума-низованного антитела 1С5 были синтезированы из набора перекрывающихся олигонуклеотидов с помощью ПЦР и собраны на экспрессионном векторе рР1С2аЛ.
В результате мы получили плазмиду рР1С2аЛ-ЛЯ-Иитап-^, которой трансформировали клетки штамма Р. ра$1от15 08115. Был отобран штамм 08115/ АЯ-Иитап, продуцирующий гуманизированные БаЬ-фрагменты антитела 1С5 с выходом 21 мг/л.
Аффинно очищенные из супернатанта БаЬ-фраг-менты сравнивали по связыванию с гликопротеидом ВБ с мышиным БаЬ-фрагментом и полноразмерным антителом (таблица). Результаты, представленные в таблице, указывают на то, что гуманизированные БаЬ-фрагменты обладают аффинностью не меньшей, чем у исходного полноразмерного антитела 1С5.
БаЬ-фрагменты при разделении в 8Э8-ПААГ дают одиночную полосу с мобильностью, соответствующей предполагаемой массе БаЬ-фрагмента 50 кДа. Электрофорез в восстанавливающих условиях дает полосы, соответствующие предполагаемым значениям массы свободных тяжелых и легких цепей (рис. 3) [21].
Специфичность и степень гуманизации полученных БаЬ-фрагментов определяли при помощи вестерн-бло-
Значения аффинности (Ка) для полноразмерного мышиного антитела 1С5, рекомбинантного мышиного ЕаЪ-фрагмента и гуманизированного ЕаЪ-фрагмента антитела 1С5
к*
полноразмерное мышиное антитело 1С5 рекомбинантный мышиный БаЬ-фрагмент рекомбинантный гуманизированный БаЬ-фрагмент
1,9х10-9 М 2,7х10-9 М 1,2х10-9 М
а
Mouse
RVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKTSGYIFTSFWMHWAKQRPGQGLEWIGQIHPNS
DYTNYNEKFRGKATLTVDISSSTVYVDLSGLTSEDSAVYYCAREDYDEGFDNWGQ
GTLVTVSA
Cons
....V.S...VK.......V.................R.A...............
...........RV.......T.....E....R...T...................
Human
....V.S...VV.......V.................R.A.
...........RA.......T.....E....T...T.....
6
Mouse
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSRLNWIQQEPDGTIKRLIYATSSLD
SGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVGYYCLQYATSPYTFGGGTKLEIKR
Cons
..............V.D........................KA............
................T......QP............................
Human
..............V.D........................GA............
................T......QP............................
Рис. 2. Сравнение мышиной, консенсусной и гуманизованной аминокислотных последовательностей вариабельного домена
тяжелой (а) и легкой (6) цепей антитела 1С5
та (рис. 4). Полученный БаЬ-фрагмент связывает гли-копротеид ВБ (данные не приведены). На высокую степень гуманизации указывает тот факт, что моно-клональные антитела, специфичные к каппа-цепям иммуноглобулинов человека, узнают гуманизированный БаЬ-фрагмент, тогда как антитела против каппа-цепей иммуноглобулинов мыши гуманизированный БаЬ-фрагмент практически не связывают.
Заключение
В результате проведенной работы была определена аминокислотная последовательность вариабельных фрагментов мышиного нейтрализующего антитела против вируса бешенства 1С5. Был получен рекомби-нантный Fab-фрагмент этого антитела, не уступающий по аффинности исходному антителу. В результате замены константных областей мышиного Fab-фрагмента на последовательности, наиболее часто
■ "г -чш — . з .ту
97 I ^¿-^«-"«Н*"
бб
45
Щ
шт
ЧЙИКЖ
30 ш
'кЖ
1
97 66
45
30
20
-1
Рис. Электрофорез в 11АА1 гуманизированного ]^аЬ-фрагмента антитела 1С5: 1 - стандарты, 2 - ЭФ в невос-станавливающих условиях, 3 - ЭФ в восстанавливающих условиях
встречающиеся в человеческих иммуноглобулинах, мы получили гуманизированный БаЬ-фрагмент. Выход гуманизированного БаЬ-фрагмента составил 21 мг из 1 л культуральной среды. Примесей изолированных тяжелых и легких цепей, по данным электрофореза и вестерн-блота, обнаружено не было. Специфичность гуманизированного БаЬ-фрагмента была подтверждена при помощи ИФА и вестерн-блота, его аффинность не уступает исходному полноразмерному антителу 1С5. Взаимодействие с антителами против каппа-цепей иммуноглобулинов человека при отсутствии заметного связывания с антителами против иммуно-
Рис. 4. Вестерн-блот гуманизированного РаЬ-фрагмента в невос-станавливающих (дорожки 1-3) или в восстанавливающих (дорожки 4-6) условиях. Мембраны после переноса инкубировали либо с антителами против каппа-цепей иммуноглобулинов человека (дорожки 1 и 4), либо с антителами против гистидин-6 тага (дорожки 2 и 5), либо с антителами против каппа-цепей иммуноглобулинов мыши (дорожки 3 и 6)
манизации БаЬ-фрагмента антитела 1С5, что позволяет ожидать снижения иммуногенности последнего при введении в организм человека. Все вышеперечисленное указывает на то, что гуманизированный БаЬ-фраг-мент нейтрализующего антитела 1С5 может быть использован для разработки препарата, способного заменить антирабический лошадиный или донорский иммуноглобулин для профилактики заболевания бешенством.
глобулинов мыши указывает на высокую степень гу-
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта АФГИР № ЯВ0-11041-М0-04 и Госконтракта
Роснаука № 02, 512, 12,2057.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Всемирная организация здравоохранения, информационный бюллетень № 99. 2008. декабрь.
2. Hildegund C. J. // Negl Trop Dis. 2009. 3. N 9. P. 515.
3. Fernandes A., Kaundinya J.O., Daftary G., Saxena L., Banerjee S. //J. Chromatogr B Analyt. Technol. Biomed Life Sci. 2008. 876. P. 109.
4. Грибенча C.B., Василенко O.B., Фуралев B.A., Клюшник С.Ю., Кузъмицкая Т.М., Свешников П.Г., Баринскии И.Ф. // Вопросы вирусологии. 1991. № 4 С. 318.
5. Грибенча С.В., Василенко O.B., Кузъмицкая Т.М., Фуралев B.A., Свешников П.Г., Татаров А.Г., Колотвина П.В., Баринскии И.Ф. // Вопросы вирусологии. 1991. № 5. С. 399.
6. Whitelegg N.R.J., Rees A.R. II Prot. Eng. 2000. 13. P. 81.
7. Couto J.R., Blank E.W., Peterson J.A., Ceriani R.L. IlCancer Res. 1995 55. N 8. P. 1717.
8. Gasser B., Maurer M., Gach J., Kunert R., Mattanovich D. II Biotechnol. Bioeng. 2006. 94. N 2. P. 353.
9. Ning Ning D., Junjian X., Xunzhang W., Wenyin C., Qing Z., Kuanyuan S., Guirong R., Xiangrong R., Qingxin L., Zhouyao Y. II J. Biochem. 2003. 134. N 6. P. 813.
10. Ягудин T.A., Морозкина E.B., Клячко E.B., Зацепин С.С., Беневоленский С.В., Солопова ОН., Шемчукова О.Б., Городецкая С.Б., Борзилов A.H., Баранова E.B., Бикетов С.Ф., Вейко В.П., Свешников П.Г. II Молекулярная медицина (в печати).
11. KlotzI.M. The Proteins. N.Y., 1953.
12. Friguet B., Chaffotte A.F., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg M. E. //Journal of Immunological Methods. 1985. 77. P. 305.
13. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. 76. N 9. P. 4350.
14. Laemmli U.K. // Nature. 1970. 227. P. 680.
15. Ягудт T.A., Марченко A.H., МорозкинаE.B., Клячко Е.В., Зацепин С.С., Беневоленский С.В., Солопова O.H., Шемчу-кова ОБ., Городецкая С.Б., Борзилов А.И., Баранова Е.В., Бикетов С.Ф., Свешников П.Г. // Молекулярная медицина (в печати).
16. Kabat E.A., Wu T.T., Reid-Miller M, Perry H.M., Gottes-man K. S. // U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Bethesda, MD. 1987.
17. Staelens S., Desmet J., Ngo T.H., Vauterin S., Pareyn I., Barbeaux P., Van Rompaey I., Stassen J.M., Deckmyn H., VanhoorelbekeK. //Mol. Immunol. 2006. 43. N 8. P. 1243.
18. Chothia C., Lesk A. M., Tramontano A., LevittM., Smith-Gill S.J., Air G., Sheriff S., Padlan E. A., Davies D., Tulip W. R., Colman P. M., Spinelli S., Alzari P.M., PoljakR. J. // Nature. 1989. 342. P. 877.
19. Kolbinger F., Saldanha J., Hardman N., Bendig M. // Prot. Eng. 1993. 6. P. 971.
20. Tan P., Mitchell D.A., Buss T.N., Holmes M.A., Anasetti C., Foote J. //J. Immunol. 2002. 15. 169(2). P. 1119.
21. Carter P., Presta L., Gorman C.M., Ridgway J.B.B., Henner D., Wong W.L.T., Rowland A.M., Kotts C., Carver M.E., Shepard H.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. 89. P. 4285.
Поступила в редакцию 20.01.10
PRODUCTION OF THE HUMANIZED Fab FRAGMENT OF THE NEUTRALIZING ANTIBODY AGAINST RABIES VIRUS
P.G. Sveshnikov, T.A. Yagudin, E.V. Morozkina, E.V. Klyachko, S.S. Zatsepin, S.V. Benevolensky, O.B. Shemchukova, L.P. Pozdnyakova, O.N. Solopova
(Chair of bioengineering, Department of Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University)
The aim of the investigation is to produce functional humanized Fab fragment of the neutralizing antibody against rabies virus - a prototype of a therapeutic drug, capable of substituting the horse and the donor anti-rabies immunoglobulin. There was performed cloning and sequencing of variable light and heavy chains fragments of a high affinity neutralizing antibody against rabies virus. There was made a substitution of constant mouse fragments for human ones and a production of humanized Fab fragments in the yeast expression system. There were also investigated the immunochemical properties of the obtained Fab fragments by EIA, electrophoresis in PAAG and Western blotting. The humanized Fab fragment of the antibody against rabies virus, which exceeded the initial antibody in terms of affinity, was produced. The high humanization degree was proved with the used of the sera, specific towards human immunoglobulins. The yield of the humanized Fab fragment made up 21 mg per 1 L of the culture medium, the absence of isolated light and heavy chains of the humanized Fab fragment was testified.
Key words: rabies virus, Fab fragment, humanization.
Сведения об авторах: Свешников Петр Георгиевич — профессор кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ, докт. биол. наук ([email protected]); Ягудин Тимур Анверович - мл. науч. сотр. лаборатории оптимизации экспрессии генов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН ([email protected]); Морозкина Елена Владимировна - науч. сотр. лаборатории оптимизации экспрессии генов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, канд. биол. наук ([email protected]); Клячко Елена Витальевна - ст. науч. сотр. лаборатории оптимизации экспрессии генов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, канд. биол. наук ([email protected]); Зацепин Сергей Сергеевич - ст. науч. сотр. лаборатории оптимизации экспрессии генов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, канд. биол. наук ([email protected]); Беневоленский Сергей Владимирович - вед. науч. сотр. лаборатории оптимизации экспрессии генов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, канд. биол. наук ([email protected]); Шемчукова Ольга Борисовна - ст. науч. сотр. отдела биотехнологии ОАО «Всероссийский научный Центр молекулярной диагностики и лечения», канд. биол. наук ([email protected]); Позднякова Любовь Петровна - науч. сотр. отдела биотехнологии ОАО «Всероссийский научный Центр молекулярной диагностики и лечения» (e-mail: [email protected]); Солопова Ольга Николаевна - вед. науч. сотр. отдела биотехнологии ОАО «Всероссийский научный Центр молекулярной диагностики и лечения», канд. биол. наук ([email protected]).
