CC BY
31
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 57.083.3
Получение и исследование свойств рекомбинантного иммуноглобулина А, специфичного к гемагглютининам вируса гриппа
Т. К. Алиев1*, И. Г. Дементьева2, В. А. Топорова3, В. В. Аргентова4, Л. П. Позднякова2, М. Н. Боков2, Ю. А. Вотчицева4, Д. А. Долгих3,4, С. Д. Варфоломеев1, П. Г. Свешников2, М. П. Кирпичников3,4
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3
2Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения, 117149, Москва, Симферопольский бульвар, 8
3Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
4Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 13.06.2017
Принята к печати 16.04.2018
РЕФЕРАТ Получены рекомбинантные варианты человеческого антитела FI6, проявляющие широкую специфичность к гемагглютининам вируса гриппа А. На основе бипромоторного вектора (CMV, hEF1-HTLV) получены генетические конструкции, экспрессирующие тяжелую и легкую цепи иммуноглобулинов IgA1-, IgA2m1- и IgG-изотипов. В результате трансфекции и селекции клеток СНО яичников китайского хомячка получены клеточные линии, стабильно экспрессирующие указанные антитела. Иммуноглобулины изоти-пов IgA1, IgA2m1 и IgG выделены из культуральной жидкости. Определены иммунохимические характеристики антител, изучено взаимодействие рекомбинантных иммуноглобулинов со штаммами вируса гриппа А подтипов H1N1 и H3N2. Показано, что рекомбинантные варианты FI6 IgA-изотипа проявляют, как и исходное антитело, специфичность в отношении всех исследуемых штаммов. При этом наибольший уровень связывания достигается для подтипа H1N1, относящегося к гемагглютининам филогенетической группы I. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА вирус гриппа А, широко нейтрализующие антитела, иммуноглобулин А, IgA1, IgA2m1, рекомбинантные антитела.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВГА - вирус гриппа А; MES - 2-^-морфолино)этансульфоновая кислота; ИФА -иммуноферментный анализ; Kd - константа диссоциации.
ВВЕДЕНИЕ
Пассивная иммунотерапия с использованием антител к компонентам вирусного капсида является перспективным направлением разработки новых лекарственных средств для борьбы с гриппом [1, 2]. Этот подход приобретает особое значение в связи с высокой изменчивостью поверхностных антигенов вируса гриппа А (ВГА), приводящей к уменьшению эффективности вакцин и низкомолекулярных терапевтических средств. С целью создания универсальных препаратов широкой специфичности на протяжении последних лет ведется активный поиск нейтрализующих моноклональных антител (мАТ), проявляю-
щих перекрестную реактивность в отношении различных серотипов ВГА [3-7]. Наибольший успех был достигнут в результате масштабного скрининга более 100000 отдельных культивированных антите-лопродуцирующих В-клеток нескольких доноров, у которых наблюдали значительную гетеротипич-ность иммунного ответа в отношении ряда подтипов ВГА [8]. Найдено уникальное антитело FI6, обладающее способностью связывать рекомбинантные и природные гемагглютинины филогенетических групп I и II. Широкая специфичность данного антитела, по-видимому, обусловлена тем, что оно взаимодействует с консервативным эпитопом в субдомене F молекулы
гемагглютинина, менее подверженном мутагенезу, чем домен НА1. На мышах и хорьках, инфицированных штаммами ВГА H1N1 и H5N1 в летальной дозе, показано, что полная защита достигается при введении данного антитела в дозе 2-20 мг/кг веса. Открытие подобного универсального антитела открывает широкие возможности для создания на его основе различных рекомбинантных вариантов иммуноглобулинов.
Дыхательные пути представляют основной путь проникновения ВГА в организм, поэтому интрана-зальное введение нейтрализующих антител может значительно способствовать повышению эффективности пассивной иммунотерапии [9, 10]. В случае интраназального введения препаратов значительный интерес вызывает возможность использования рекомбинантного иммуноглобулина А, наиболее представительного класса антител на слизистых оболочках человека [11]. Иммуноглобулины класса А присутствуют в различных изоформах (мономер, димер, секреторная форма), в зависимости от структуры они способны задействовать различные механизмы нейтрализации вируса. Антитела IgA-изотипа способны блокировать взаимодействие вирусов с поверхностью клеток человека, осуществлять внутриклеточную нейтрализацию вирусных частиц, посредством привлечения и активации нейтрофилов способствовать уничтожению зараженных клеток [12].
Цель настоящего исследования заключалась в получении рекомбинантных аналогов антитела FI6 в формате иммуноглобулина А и сравнение его им-мунохимических свойств со свойствами аналогичного антителам IgG-изотипа.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Конструирование бипромоторной плазмиды для экспрессии рекомбинантного антитела FI6 ^01-изотипа
Ранее мы синтезировали [13] нуклеотидные последовательности кДНК вариабельных доменов FI6VHv3 тяжелой и FI6VKv2 легкой цепей антитела FI6 [8].
К 5'-концевой области полученной ранее кДНК вариабельного домена тяжелой цепи антитела FI6VHv3 методом полимеразной цепной реакции с использованием набора олигонуклеотидных праймеров с попарно перекрывающимися концевыми частями (SOE-PCR) присоединяли фрагмент, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую ли-дерный пептид MAWVWTLLFLMAAAQSAQA и не-транслируемую регуляторную область. Для создания бипромоторной системы экспрессии полученный в результате SOE-PCR фрагмент ДНК обрабатывали рестриктазами NheI и Bsp120I и клонировали в пред-
обработанную теми же рестриктазами плазмиду pSK+/hEF1-HTLV-BGH [14], содержащую гибридный промотор hEF1-HTLV, полноразмерную константную область IgG1 и сайт полиаденилирования BGH, все вместе фланкированные сайтами узнавания рестриктазы MluI. Таким образом была получена плазмида pSK+/hEF1-HTLV-FI6HG1-BGH.
По аналогии с тяжелой цепью получали кДНК легкой цепи антитела человека, адаптированную к экспрессии в клетках эукариот. Методом SOE-PCR объединяли кДНК лидерного пептида MKSQTQVFVFLLLCVSGAHG, полученную ранее кДНК вариабельного домена легкой цепи антитела FI6VKv2 и кДНК константного домена каппа-изоти-па человека. Полученный фрагмент ДНК обрабатывали рестриктазами NheI и Sfr274I и клонировали в предобработанную теми же рестриктазами плаз-миду pOptiVEC (Invitrogen, США) с предварительно введенным рядом с 5'-концом промотора сайтом узнавания рестриктазы MluI. Таким способом была получена плазмида pOpti-FI6L, содержащая ген легкой цепи антитела FI6 под контролем цитомегалови-русного промотора (CMV).
На заключительном этапе получения бипромотор-ной плазмиды pBiPr-ABIgG1FI6 фрагмент MluI-MluI (2500 п.н.) из плазмиды pSK+/hEF1-HTLV-FI6HG1-BGH встраивали в предобработанный рестриктазой MluI и дефосфорилированный вектор pOpti-FI6L.
Конструирование бипромоторных плазмид
для экспрессии рекомбинантных антител FI6 IgÄ1-
и IgА2m1-изотипов
Константные домены тяжелой цепи IgA1- и IgA2m1-изотипов получали следующим образом. Экзоны соответствующих генов амплифицировали с использованием хромосомной ДНК человека в качестве матрицы и специфических олигонуклеотидных праймеров и клонировали в промежуточный вектор pAL-TA («Евроген», Россия). Экзоны, принадлежащие константным доменам одинаковых изо-типов, объединяли с помощью метода SOE-PCR. Полученные фрагменты обрабатывали рестрикта-зами SacI и Sfr274I, и каждый из них клонировали совместно с фрагментом NheI-SacI из pSK+/hEF1-HTLV-FI6HG1-BGH, содержащим кДНК лидерного пептида MAWVWTLLFLMAAAQSAQA и вариабельной области тяжелой цепи антитела FI6, в пред-обработанный рестриктазами NheI и Sfr274I вектор pSK+/hEF1-HTLV-BGH. Таким образом были получены плазмиды pSK+/hEF1-HTLV-FI6HA1-BGH и pSK+/hEF1-HTLV-FI6HA2m1-BGH, содержащие промотор hEF1-HTLV, кДНК лидерного пептида MAWVWTLLFLMAAAQSAQA, вариабельную область тяжелой цепи антитела FI6, кДНК констант-
ного домена IgAl- или ^А2т1-изотипа человека (соответственно) и нетранслируемой области, включающей сайт полиаденилирования BGH, фланкированные сайтами узнавания рестриказы MluI.
На заключительном этапе получения бипромотор-ных плазмид pBiPr-ABIgA1FI6 и pBiPr-ABIgA2m-1FI6 фрагменты MluI-MluI (2500 п.н.) из плазмид pSK+/hEF1-HTLV-FI6HA1-BGH и pSK+/hEF1-HTLV-FI6HA2m1-BGH соответственно встраивали в предобработанный рестриктазой MluI и дефосфо-рилированный вектор pOpti-FI6L.
Получение клеточных линий-продуцентов рекомбинантных антител
Клетки CHO DG44 (Invitrogen, США) трансфи-цировали линеаризованными плазмидами pBiPr-ABIgG1FI6, pBiPr-ABIgA1FI6 и pBiPr-ABIgA2m1FI6 с использованием реагента Lipofectamine 3000 (Invitrogen, США) по стандартному протоколу. Первичную селекцию трансфектантов проводили на среде CD OptiCHO (Invitrogen, США) с добавлением 8 мМ L-глутамина (Gibco, США), 0.1% Pluronic F-68 (Gibco, США) и однократного раствора анти-биотика/антимикотика (Gibco, США). Для получения стабильной клеточной линии проводили флуоресцентный скрининг и отбор клонов-продуцентов. С этой целью клетки высевали на полутвердую среду doneMedia (Molecular Devices, США) с добавлением в зависимости от изотипа получаемых рекомби-нантных антител, меченных FITC, антител мыши к константным доменам человеческих иммуноглобулинов G (Molecular Devices, США) или A (ВНЦМДЛ, Россия). После 14-дневного культивирования клеток проводили отбор отдельных продуцирующих клонов с использованием установки ClonePix FL (Molecular Devices, США) по интенсивности их флуоресценции. Для дальнейшего повышения продуктивности выбранные клоны культивировали в присутствии увеличивающихся концентраций метотрексата в диапазоне от 20 до 500 нM.
Выделение и очистка рекомбинантных антител
Культуру клеток, продуцирующих рекомбинант-ные антитела, выращивали в колбах-спиннерах с рабочим объемом 500 мл. Для этого в среду CD OptiCHO объемом 300 мл высевали 2.5-3.0 х 105 клеток/мл и выращивали в течение 14-18 дней в CO2-инкубаторе при 37°С, 8% CO2 при скорости перемешивания спиннера 50-70 об/мин.
Культуральную жидкость центрифугировали при 4000 g, к супернатанту добавляли 2-^-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES) до концентрации 50 мМ и NaCl до концентрации 150 мМ, рН 5.7.
Культуральную жидкость, содержащую FI6-IgG, наносили на колонку Protein G-Sepharose 4В Fast Flow (диаметр 2.5 см, высота геля 3.5 см, объем 17 мл), предварительно уравновешенную раствором MES рН 5.7, со скоростью рециркуляции 42 мл/ч (8.6 мл/ч х см2) в течение 21 ч при 4°С. Антитела элю-ировали 0.1 М глициновым буфером рН 2.7, скорость элюции 70 мл/ч. Сразу же после получения элюата доводили pH до ~7.5 при помощи 2 М Трис и концентрировали в ультрафильтрационной ячейке (мембрана 30000 NMWL) до объема » 1.5-2 мл, затем диа-лизовали против фосфатного буфера (200-кратный объем), рН 7.4 в течение ночи.
Для аффинной хроматографии FI6-IgA1 и FI6-IgA2m1 получали иммуносорбент на основе монокло-нальных антител (мАТ) мыши FabH A3 (ВНЦМДЛ, Россия) против каппа-цепи иммуноглобулинов человека. Антитела пришивали к активированной BrCN-сефарозе по методу Каврана [15]. Степень пришивки антител FabH A3 составляет 5 мг на 1 мл сефарозы. рН культуральной жидкости, содержащей антитела FI6-IgA, доводили до 8.0 с помощью 1 М раствора Трис и наносили на колонку рециркуляцией в течение 18 ч со скоростью 15 мл/ч. Для элюции антител FI6-IgA1 и FI6-IgA2m1 последовательно использовали 0.1 М натрий-ацетатный буфер, рН 3.0, 0.5 М NaCl; 0.1 М глициновый буфер, рН 2.5, 0.5 М NaCl; 0.1 М глициновый буфер, рН 2.0, 0.5 М NaCl. Все элюаты нейтрализовали с помощью 1 М раствора Трис.
Иммунохимический анализ рекомбинантных антител
В данной работе использовали набор высокоочищен-ных реликтовых и актуальных штаммов ВГА производства компании Hytest Ltd. (Турку, Финляндия) и НИИ гриппа РАМН (Санкт-Петербург, Россия), полученных из зараженных куриных эмбрионов методом последовательного ультрацентрифугирования с использованием градиента плотности сахарозы с последующей инактивацией мертиолатом в течение 24 ч (табл. 1). Инактивация вирусов подтверждена на культуре клеток MDCK.
Титрование рекомбинантных антител проводили методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА). Инактивированные штаммы ВГА сорбировали в концентрации 5 мкг/мл при температуре 4oC в течение ночи в 0.1 М карбонатном буфере рН 9.2-9.4 объемом 50 мкл в лунках 96-луночных планшетов с высокой связывающей способностью (Corning-Costar, Нидерланды). В качестве вторичного антитела для детекции использовали конъюгат мАТ FabH A3 с пероксидазой хрена.
Для проведения иммуноблотинга проводили электрофоретическое разделение вируса гриппа
Таблица 1. Характеристика использованных вирусных препаратов
Поставщик Серотип Штамм/год выделения
Hytest Ltd 8IN73 Influenza A (HlNl) A/Taiwan/l/86
Hytest Ltd 8IN73-2 Influenza A (HlNl) A/Beijing/262/95
Hytest Ltd 8IN73-3 Influenza A (HlNl) A/New Caledonia/20/99
Hytest Ltd 8IN73-4 Influenza A (HlNl) A/Solomon Islands/03/06
НИИ гриппа Influenza A (HlNl) A/California/07/09
Hytest Ltd 8IN74 Influenza A (H3N2) A/Samara/222/99=A/ Shangdong/9/93
Hytest Ltd 8IN74-1 Influenza A (H3N2) A/Panama/2007/99
Hytest Ltd 8IN74-2 Influenza A (H3N2) A/Kiev/30l/94
Hytest Ltd 8IN74-3 Influenza A (H3N2) A/Wisconsin/67/05
Hytest Ltd 8IN74-4 Influenza A (H3N2) A/Brisbane/l0/07
НИИ гриппа Influenza A (H3N2) A/Sydney/5/97
Hytest Ltd 8IN75-2 Influenza B B/Tokio/53/99
А штамм A/Solomon Islands/03/06 в 10% полиакри-ламидном геле в невосстанавливающих условиях. Затем осуществляли электрофоретический перенос (электроблот) белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану S045A330R (Advantec MFS, Inc., США). Перенесенные белки выявляли на нитроцеллюлозной мембране с помощью непрямого ИФА. Для этого мембрану блокировали раствором 5% казеина в течение 1 ч при компнатной температуре на шейкере и трижды промывали PBS-T (10 мМ K2HPO4, pH 7.5, 0.145 M NaCl, 0.1% Tween 20). Инкубировали в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре. После трехкратной промывки мембрану инкубировали с раствором соответствующих рекомбинантных антител в концентрации 1 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере в течение 1 ч при 37оС. После трехкратной промывки PBS-T мембрану инкубировали с конъю-гатом мАТ FabH A3 с пероксидазой хрена в течение 1 ч при 37оС. Иммуноблот окрашивали, добавляя субстрат (3,3-диаминобензидин, 4-хлор-1-нафтол и пе-роксид водорода).
Kd комплекса антиген-антитело определяли по методу Фриге [16]. На первом этапе мАТ в постоянной концентрации 1 нМ (150 нг/мл) инкубировали с антигеном, инактивированным штаммом ВГА А(НШ1)/ Solomon Islands/03/06, в диапазоне концентраций 0.1-10 нМ (10-1000 нг/мл) в течение 2 ч при комнатной температуре с постоянным перемешиванием на шейкере для достижения термодинамического равновесия в трехкомпонентной системе: свободный антиген, свободное антитело и комплекс антиген-антитело. На втором этапе измеряли концентрации свободных антител методом твердофазного ИФА с иммобилизованным на планшет антигеном. На заключительном этапе рассчитывали величину
Kd по уравнению Клотца [17] с использованием значений общей концентрации антигена и концентрации свободных рекомбинантных антител.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Рекомбинантные иммуноглобулины получали с использованием нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельные домены FI6VHv3 тяжелой и FI6VKv2 легкой цепей нейтрализующего антитела FI6 широкой специфичности [8]. Такие модифицированные последовательности отличаются от последовательностей, кодирующих тяжелую и легкую цепи иммуноглобулина FI6 тем, что содержат меньше соматических мутаций и в большей степени соответствуют последовательностям вариабельных доменов зародышевых линий иммуноглобулинов человека.
Для изучения способности антитела FI6 взаимодействовать с ВГА в формате иммуноглобулина А было решено получить рекомбинантные антитела IgAl- и ^А2т1-изотипов. В качестве положительного контроля получено антитело FI6 IgGl-изотипа.
Иммуноглобулин А человека представлен двумя изотипами - IgAl и IgA2. IgAl превалирует в сыворотке, в то время как в секреторных выделениях выше процентная доля IgA2 [18]. Наиболее существенные структурные отличия между данными изотипами антител связаны с шарнирным участком. Шарнирный участок IgAl на 13 аминокислотных остатков длиннее, чем у IgA2. Вследствие этого антитела IgAl-изотипа обладают большей подвижностью антигенсвязывающих участков. Такое преимущество IgAl сопряжено с большей по сравнению с IgA2 уязвимостью к протеолизу в области шарнирных участков [l2]. Антитело IgA2-изотипа встречается
Л
Ч
н
hEF1-HTLV VH CH(IgG1) BGH CMV
VL
CL EMCV IRES
DHFR
TK pA
4
h
hEF1-HTLV VH CH(IgA1) BGH CMV
VL
CL EMCV IRES
DHFR
TK pA
В
4
h
hEF1-HTLV VH CH(IgA2m1) BGH CMV
VL
CL EMCV IRES
DHFR
TK pA
Рис. 1. Схема экспрессионных кассет бипромоторных плазмид для получения антител FI6 различных изотипов. Л - плазмида pBiPr-ABIgG1FI6. Б - плазмида pBiPr-ABIgAI FI6. В - плазмида pBiPr-ABIgA2m1FI6. hEF1-HTLV -гибридный промотор из плазмиды pMG, состоящий из промотора фактора элонгации EF-1 a и 5'-нетранслиру-емой области вируса Т-клеточного лейкоза человека HTLV; VH - вариабельный домен тяжелой цепи антител; CH(IgG1), CH(IgA1), CH(IgA2m1) - константные домены тяжелой цепи иммуноглобулинов человека IgG1-, IgA1-, IgA2m1-изотипов соответственно; BGH - сайт полиаденилирования BGH; CMV - промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека; VL - вариабельный домен легкой цепи антител; CL - константный домен легкой цепи антитела; EMCV IRES - внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита, DHFR -ген дигидрофолатредуктазы; TK pA - сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса герпеса
в виде двух аллотипов: IgA2m1 и IgA2m2, которые различаются количеством сайтов гликозилирования и, что весьма существенно, расположением межцепочечных дисульфидных связей [19, 20]. В IgA2m1 отсутствуют типичные для структуры иммуноглобулинов дисульфидные связи между константным доменом легкой и константным доменом тяжелой цепей (CH1). При этом дисульфидная связь образуется между константными доменами легких цепей, а взаимодействие между легкой и тяжелой цепью носит нековалентный характер.
Для экспрессии рекомбинантных антител в клетках СНО предложен бипромоторный вектор, разработанный нами ранее и хорошо зарекомендовавший себя при получении антител. Этот экспрессионный вектор содержит две транскрипционные единицы, промоторы pCMV и hEF1-HTLV, контролирующие транскрипцию тяжелой и легкой цепей антител в одной плазмиде. Плазмида также содержит ген диги-дрофолатредуктазы (DHFR), который транслируется через независимый сайт связывания рибосом. Такой вектор позволяет при амплификации копий гена DHFR в хромосоме линий-продуцентов методом селективного давления метотрексата (MTX) одновременно увеличивать копийность генов легкой и тяжелой цепей антител. Получены три экспрессионные
плазмиды, отличающиеся константными доменами тяжелых цепей иммуноглобулинов (рис. 1).
Для наработки рекомбинантных иммуноглобулинов на основе клеток СНО DG44 получены стабильные клеточные линии. Рекомбинантные антитела IgG- и ^А-изотипов выделяли из бессывороточной культуральной среды. После проведения аффинной хроматографии рекомбинантные антитела IgG- и ^А-изотипов анализировали с помощью полиакриламид-ного гель-электрофореза в восстанавливающих и не-восстанавливающих условиях (рис. 2).
Размер обнаруживаемых фрагментов белков, как показывает анализ гель-электрофореграмм, отражает особенности расположения межцепочечных дисульфидных связей в каждом из исследуемых изотипов. Так, на электрофореграммах антител IgG- и ^А1-изотипов в восстанавливающих условиях появляются две полосы, соответствующие легкой и тяжелой цепям иммуноглобулинов. У антитела ^А2т1-изотипа выявлено свойственное данному изотипу уникальное расположение межцепочечных дисульфидных связей. Как упоминалось ранее, у антител ^А2т1-изотипа отсутствует характерная для большинства иммуноглобулинов межцепочечная дисульфидная связь между константным доменом легкой и СН1-доменом тяжелой цепи. При этом
Л
200 150 120 100 85 70 60
50 40 30
25 20
M
M
Б
200 150 120
100 85 70 60
50 40
30 25
Рис. 2. Гель-электро-фореграмма антител FI6 в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. А - 1, 3 - антитела IgG; 2, 4 - антитела 1дА1. 1, 2 — в присутствии Р-меркаптоэтанола. 3, 4 - в отсутствие Р-меркаптоэтанола. Б - антитела 1дА2т1 в отсутствие (1) и в присутствии (2) Р-меркаптоэтанола. М - маркеры мол. массы, кДа
/
2
3
4
1
2
константные домены легких цепей соединены между собой дисульфидной связью. В невосстанавливаю-щих условиях на гель-электрофореграмме (рис. 2Б) присутствуют димеры легких (~ 46 кДа) и тяжелых цепей (~ 105 кДа).
Антигенсвязывающую активность рекомбинант-ных белков исследовали методом иммуноблотинга по отношению к инактивированному штамму гриппа A/Solomon Islands/03/06, относящегося к подтипу H1N1 (рис. 3).
Данные иммуноблотинга подтверждают способность полученных рекомбинантных антител узнавать нативный гемагглютинин ВГА. При этом подтверждаются результаты, полученные нами ранее на примере Fab-фрагмента антитела FI6 IgG1-изотипа [13], свидетельствующие о том, что антитело FI6 способно взаимодействовать как с цельным гемагглютини-ном HA0, так и с фрагментами HA1 и HA2, которые
Рис. 3. Иммуноблот ре-комбинантных антител FI6 с белками штамма ВГА A/Solomon Islands/03/06 (H1N1). 1 - результаты электрофореза белков ВГА до переноса на мембрану. 2 - иммуноблот с антителами FI6 IgG1-изотипа. 3 -иммуноблот с антителами FI6 1дА1-изотипа. 4 - им-муноблот с антителами FI6 1дА2т1-изотипа. 5 - контроль вторичного конъюгата (иммуноблот в отсутствие рекомбинантных антител)
образуются в результате гидролиза целого белка при гель-электрофорезе в восстанавливающих условиях [21]. Эти результаты согласуются с данными эпитопного картирования антитела FI6, приведенными в работе [8]. Широкая специфичность FI6 обусловлена тем, что оно взаимодействует с консервативным эпитопом в F-субдомене гемагглютинина, расположенного на стыке доменов Н1 и Н2. При этом тяжелая цепь антитела взаимодействует с доменом Н1, а легкая цепь - с альфа-спиралью из домена Н2.
Представляла интерес способность антител ^А-изотипа взаимодействовать с различными подтипами ВГА. Антитела и ^А2т1-изотипов сравнива-
ли методом непрямого ИФА с использованием различных инактивированных штаммов ВГА подтипов НШ1 и ^N2, иммобилизованных на твердой фазе.
Проведенный иммунохимический анализ (рис. 4 и 5) свидетельствует о том, что рекомбинантные антитела и ^А2т1-изотипов обладают способностью узнавать штаммы обоих изотипов, относящихся к различным филогенетическим группам. При этом сродство рекомбинантных антител и ^А2т1-изотипов к некоторым штаммам исследованных подтипов отличается. Наибольшее отличие наблюдается в отношении штаммов подтипа ^N2, интенсивность взаимодействия которых с антителами ^А2т1-изотипа значительно ниже, чем с антителами ^А1-изотипа.
Полученные результаты согласуются с данными [8], из которых следует, что антитела FI6, обладая способностью узнавать 16 подтипов ВГА, характеризуются различной силой связывания штаммов разных подтипов.
Для трех полученных рекомбинантных антител определены константы диссоциации комплекса
1 2 3 4 5
HA0 HA1
igAl
IgA2m1
2.0
1.5
Q
О 1.0
0.5
0.0
Мш
Штаммы H1N1 Штаммы H3N2 Вирус гриппа B
1*1
00 о о
\ \ \
— <n о
\ so fN
¡- <N v.
<и
CD
С -О с
£ ™ ° <U -¡2 =
U g
О
E _o
О
1Л
U
\ <
rs rs rs
E
OJ 1Л
\ <
о 1Л IV
о ч О ч о ч О ч
N IV N N IV ч О
О О •О
О m \ \
rs \ С ф
\ > 'w С
nj <и С OJ
Е OJ 0 и .Q w
с \ w
OJ CL < f CD \
\ <
< <
<u с "С
Штаммы H1N1 Штаммы H3N2 Вирус гриппа B
IV
0
B
\ <
JL
IV Ov \ 5
\
TJ
^
1Л
\ <
о
0 1—
\
Рис. 4. Непрямой иммуноферментный анализ взаимодействия штаммов ВГА Н1Ж и Н3№ с рекомбинантны-ми антителами FI6 1дА1-изотипа
антиген-антитело применительно к штамму ВГА A(H1N1)/ Solomon Islands/03/06 в качестве антигена (табл. 2).
Значения Kd рекомбинантных антител IgA1 и IgA2m1 отличаются в 4 раза. При этом у IgA1 значение Kd даже несколько меньше, чем у IgG1, что свидетельствует о большей силе связывания и, возможно, вызвано большей подвижностью анти-генсвязывающих участков вариабельных доменов, обусловленной, в свою очередь, уникальной структурой шарнирного участка IgA1. В целом, проведенные исследования показывают, что получение антитела FI6 в формате IgA не ухудшает его антигенсвязы-вающих свойств. Необходимо отметить, что неизменность антигенсвязывающих и нейтрализующих свойств при изменении изотипа антитела не является само собой разумеющимся, о чем свидетельствуют данные [22]. Показано, что химерное (мышь-человек) антитело 9F4 к гемагглютинину подтипа H5N1 в формате IgA1 характеризуется меньшей нейтрализующей активностью по сравнению с исходным антителом мыши и химерным аналогом IgG-изотипа.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основе вариабельных доменов антитела FI6 к ге-магглютинину вируса гриппа А, проявляющего широкую специфичность, получены рекомбинантные мономерные антитела IgA1- и ^А2т1-изотипов. Эти антитела распознают 10 реликтовых и актуальных
Рис. 5. Непрямой иммуноферментный анализ взаимодействия штаммов ВГА подтипов Н1Ж и Н3№ с реком-бинантными антителами FI6 1дА2т1-изотипа
Таблица 2. Сравнение Кё рекомбинантных антител FI6 IдG- и 1дА-изотипов
Антитело K,, нМ
IgG1 1.2-1.8
IgA1 0.7-1.5
IgA2m1 3.3-3.9
штаммов ВГА в непрямом ИФА и характеризуются значением константы диссоциации комплекса антиген-антитело не выше 4 нМ. Аффинность исследованных образцов антител по отношению к штаммам ВГА подтипа НШ1 выше, чем по отношению к штаммам подтипа ^N2. Данные проведенного исследования показывают, что получение антитела FI6 в формате мономерной формы иммуноглобулина А не приводит к изменению его антигенсвязывающих свойств, что является важной предпосылкой для использования антител ^А-изотипа в терапевтических целях. •
Работа выполнена при финансовой поддержке субсидии (соглашение № 14.607.21.0060), выделяемой Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках реализации Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса
России на 2014-2020 годы» (уникальный идентификатор проекта RFMEFI60714X0060).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gerhard W. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2001. V. 260. P. 171-190.
2. Lachmann P. // Emerging Microbes Infections. 2012. V. 1. e11; doi: 10.1038/emi.2012.2
3. Throsby M., van den Brink E., Jongeneelen M., Poon L.L., Alard P., Cornelissen L., Bakker A., Cox F., van Deventer E., Guan Y., et al. // PLoS One. 2008. V. 3. e3942.
4. Sui J., Hwang W.C., Perez S., Wei G., Aird D., Chen L.M., Santelli E., Stec B., Cadwell G., Ali M., et al. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2009. V. 16. P. 265-273.
5. Friesen R.H., Koudstaal W., Koldijk M.H., Weverling G.J., Brakenhoff J.P., Lenting P. J., Stittelaar K.J., Osterhaus A.D., Kompier R., Goudsmit J. // PLoS One. 2010. V. 5. e9106.
6. Wrammert J., Koutsonanos D., Li G.M., Edupuganti S., Sui J., Morrissey M., McCausland M., Skountzou I., Hornig M., Lipkin W.I., et al. // J. Exp. Med. 2011. V. 208. № 1. P. 181-193.
7. Grandea A.G., Olsen O.A., Cox T.C., Renshaw M., Hammond P.W., Chan-Hui P.Y., Mitcham J.L., Cieplak W., Stewart S.M., Grantham M.L., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. № 28. P. 12658-12663.
8. Corti D., Voss J., Gamblin S.J., Codoni G., Macagno A., Jarros-say D., Vachieri S.G., Pinna D., Minola A., Vanzetta F., et al. // Science. 2011. V. 333. № 6044. P. 850-856.
9. Tamura S., Kurata T. // Jpn J. Infect. Dis. 2004. V. 57. № 6. P. 236-247.
10. Weltzin R., Monath T.P. // Clin. Microbiol. Rev. 1999. V. 12. № 3. P. 383-393.
11. Jianqiang Y., Hongxia S., Perez D.R. // Immunotherapy. 2012. V. 4. № 2. P. 175-186.
12. Bakema J.E., van Egmond M. // MAbs. 2011. V. 3. № 4. P. 352-361.
13. Алиев Т.К., Дементьева И.Г., Топорова В.А., Боков М.Н., Позднякова Л.П., Рыбченко В.С., Долгих Д.А., Свешников П.Г., Кирпичников М.П. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 16. Биология. 2016. № 2. C. 25-31.
14. Алиев Т.К., Балабашин Д.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Панина А.А., Топорова В.А. Патент Российской Федерации на изобретение № 2555533. 2015.
15. Kavran J.M., Leahy D.J. // Methods Enzymol. 2014. V. 541. P. 27-34.
16. Friguet B., Chaffotte A.F., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg M.E. // J. Immunol. Methods. 1985. V. 77 (2). P. 305-319.
17. Klotz I.M. // Arch. Вiochem. 1946. V. 9. P. 109-117.
18. Delacroix D.L., Dive C., Rambaud J.C., Vaerman J.P. // Immunology. 1982. V. 47. № 2. P. 383-385.
19. Tomana M., Niedermeier W., Mestecky J., Skvaril F. // Im-munochemistry. 1976. V. 13. № 4. P. 325-328.
20. Chintalacharuvu K.R., Raines M., Morrison S.L. // J. Immunol. 1994. V. 152. № 11. P. 5299-5304.
21. Feshchenko E., Rhodes D.G., Felberbaum R., McPherson C., Rininger J.A., Post P., Cox M.M.J. // BMC Biotechnology. 2012. 12:77 http://www.biomedcentral.com/1472-6750/12/77.
22. Mak T.-M., Hanson B.J., Tan Y.-J. // Antiviral Res. 2014. V. 107. P. 76-83.
