CC BY
55
УДК 636. 082. 12
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ CSN3, LGB И PRL У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, РАЗВОДИМОГО В РЕСПУБЛИКЕ САХА
(ЯКУТИЯ)
Н.И. ПАВЛОВА12, научный сотрудник (e-mail: [email protected])
Н.П. ФИЛИППОВА1, кандидат биологических наук, доцент
A.В. ЧУГУНОВ1, доктор сельскохозяйственных наук, профессор
B.В. ДОДОХОВ1, старший научный сотрудник
1Якутская государственная сельскохозяйственная
академия, ул. Красильникова, 15, Якутск, 677007, Российская Федерация
2Якутский научный центр комплексных медицинских проблем, Сергеляхское ш., 4, Якутск, 677007, Российская Федерация
Резюме. Изучены образцы ДНК коров симментальской породы местной селекции (n=86) СХПК «Усть-Алдан» Усть-Алданского района; холмогорской породы (n=38) ООО «Кладовая Олекмы» Олекминского района; симментальской породы австрийской селекции (n=75) и калмыцкой породы (n=12) ООО «Агрофирма Немюгю» Хангаласского района Республики Саха (Якутия). Экспериментальные исследования проводили в лаборатории селекции и генетики на базе ФГБОУ ВО Якутская ГСХА. Выявлены две аллели гена каппа-казеина - CSN3А и CSN3B и три генотипа - CSN3AA, CSN3AB и CSN3BB, с превышающей частотой аллели CSN3A над аллелью CSN3B, которая варьировала в зависимости от породы от 0,50 до 0,79. Наибольшая частота аллели CSN3A отмечена у коров симментальской породы австрийской селекции. У крупного рогатого скота холмогорской, калмыцкой и симментальской пород местной и австрийской селекций частота встречаемости аллели LGBA варьировала от 0,17 до 0,47. Выявлены две аллели гена пролактина - PRLA и PRLВ и три генотипа PRLM, PRLAlВ и PRL1111. Частота встречаемости аллели PRLA (0,79-0,84) достоверно превышала частоту аллели PRL1! (0,16-0,20) у всех исследованных пород (р<0,001). Симментальская порода местной селекции обладала наибольшей полиморфностью по трём изученным генам (1,691) и самой высокой степенью гетерозиготности (0,400). В исследованных породах крупного рогатого скота выявлен избыток гетерозигот, о чем свидетельствуют отрицательные значения коэффициента инбридинга по указанным генам в калмыцкой (-0,154) и симментальской породах австрийской (-0,122) и местной (-0,065) селекций, а также низкое положительное значение в холмогорской (0,035). Ключевые слова: ген, каппа-казеин, бета-лактоглобулин, пролактин, аллель, генотипы, полиморфизм, крупный рогатый скот.
Для цитирования: Полиморфизм генов CSN3, LGB и PRL у крупного рогатого скота, разводимого в Республике Саха (Якутия)/Н.И.Павлова, Н.П.Филиппова, А.В.Чугунов, В.В. Додохов // Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. № 11. С. 103-106.
Эффективность селекционной работы в молочном скотоводстве зависит от комплексного использова-
Таблица 1. Характеристика праймеров
ния зоотехнических методов и современных ДНК-технологий. Вопросы селекции животных с использованием молекулярно-генетических методов в разные годы изучали многие зарубежные и отечественные исследователи [1-6]. К наиболее распространённым потенциальным ДНК-маркерам признаков продуктивности крупного рогатого скота относятся гены каппа-казеина (CSN3), бета-лактоглобулина (bLGB) и пролактина (bPRL).
На сегодняшний день в Якутии отсутствует характеристика генофонда разводимых пород крупного рогатого скота по генам, участвующим в формировании и реализации хозяйственно-полезных признаков.
Цель исследования - сравнительный анализ генетического разнообразия крупного рогатого скота Якутии по генам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и пролактина.
Условия, материалы и методы. Экспериментальные исследования проводили в лаборатории селекции и генетики на базе ФГБОУ ВО Якутская ГСХА с 2014 по 2016 гг. В работе изучали образцы ДНК коров симментальской породы местной селекции (n=86) СХПК «Усть-Алдан» Усть-Алданского района; холмогорской породы (n=38) ООО «Кладовая Олекмы» Олекминского района; симментальской породы австрийской селекции (n=75) и калмыцкой породы (n=12) ООО «Агрофирма Немюгю» Хангаласского района Республики Саха (Якутия).
Кровь для выделения ДНК отбирали из ярёмной вены в объёме 6 мл в вакуумные пробирки с сухим ЭДТА К3. Геномную ДНК выделяли общепринятым стандартным фенол-хлороформным методом [1]. Для проведения ПЦР использовали специфичные праймеры производства ЗАО «Синтол» (табл. 1).
Амплификацию генов CSN3, bLGB, bPRL методом ПЦР (табл. 2) проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объёме 20 мкл, содержащем буфер (60 мМ Трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэтанол; 0,1 мМ тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкл Taq ДНК полимеразы, 0,5 мкМ каждого праймера, 1 мкл исследуемого образца ДНК.
Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5 %-ного агарозного геля, содержащего 0,5 мкг/мл этидия бромида, и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1 хТВЕ-буфере. После электрофореза гель просматривали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм. Генотипы идентифицировали по количественным и качественным признакам ПЦР-ПДРФ.
Ген Праймер Рестрик таза Сайт узна-ва ния Литература
CSN3 F: 5'-ATAGCCAAATATATCCCAATTCAGT-3' R: 5'-TTTATTAATAAGTCCATGAATCTTG-3' НЫШ A/AGCTT [8]
bLGB F: 5'- GTCCTTGTGCTGGACACCGACTACA -3' R: 5'- CAGGACACCGGCTCCCGGTATATGA -3' НаеШ GG/CC [9]
PRL F: 5'-CGAGTCCTTATGAGCTrGATTCTT-3' R: 5'-GCCTTCCAGAAGTCGTTTGIIIIC-3' Rsal GT/AC [10]
Таблица 2. Условия проведения ПЦР
Ген Амплификат Длина фрагмента рестрикции Условия проведения ПЦР
CSN3 530 АА: 530 АВ: 530, 400, 130 ВВ: 400, 130 1. 95 °С - 5 мин 2. (95 °С-1 мин; 58 °С-1 мин; 72°С-1 мин)*35 - циклов 3. 72 °С - 5 мин
bLGB 262 АА: 153, 109 АВ: 153, 109, 79+74 ВВ: 109, 79+74 1. 94 °С - 4 мин 2. (94 °С-1 мин; 55°С-1 мин; 72°С-1 мин)*30 -циклов 3. 72 °С - 5 мин
PRL 156 GG: 156 АG: 156, 82, 74 AA: 82, 74 1. 94 °С - 3 мин 2. (94 °С-1 мин; 59°С-1 мин; 72°С-1 мин)*35 -циклов 3. 72 °С - 10 мин
Для определения основных показателей внутри-популяционной изменчивости использовали надстройку для MS Excel - GenAlEx (Peakall and Smouse, 2012) [7].
Частоту встречаемости генотипов каппа-казеина, бета-лактоглобулина и пролактина рассчитывали по формуле:
P=n/N, (1)
где р - частота определения генотипа, n - количество особей, имеющих этот генотип, N - общее число особей.
Таблица 3. Частота встречаемости генотипов и того скота, разводимого в Якутии
Харди-Вайнберга. Достоверность различий средних величин между сравниваемыми группами оценивали по критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение. В изученных популяциях крупного рогатого скота выявлены две аллели гена каппа-казеина - CSN3А и CSN3B и три генотипа - CSN3AA, CSN3AB и CSN3BB. Аллель CSN3А достоверно чаще (р<0,001) отмечали у коров симментальской породы австрийской селекции (0,79), холмогорской (0,71), а также местных симменталов (0,66), что совпадает с результатами изучения полелей гена каппа-казеина (CSN3) у крупного рога-
Порода n Распределение * Частота генотипа, % Частота аллелей, ед. г2
АА 1 АВ | ВВ А В
Холмогорская 38 Н 50,0 42,0 8,0 0,71±0,05 0,29±0,05 0,02
О 50,5 41,0 8,5
Симментальская 86 Н 41,0 51,0 8,0 0,66±0,04 0,34±0,03 1,77
местной селекции О 43,6 44,9 11,5
Симментальская 75 Н 60,0 36,0 4,0 0,79±0,03 0,21±0,03 0,30
австрийской селек- О 62,7 33,3 4,0
ции
Калмыцкая 12 Н 25,0 50,0 25,0 0,50±0,10 0,50±0,10 0,00
О 25,0 50,0 25,0
* Распределение генотипов: Н - наблюдаемое, О - ожидаемое.
Частоту отдельных аллелей определяли по формулам:
РА = (2пАА+пАВ) : 2N (2)
ис7В = (2пВВ+пАВ) : 2N, (3)
где РА- частота аллели А, qB - частота аллели В, N - общее число аллелей.
Ожидаемые результаты частот генотипов в исследуемой популяции рассчитывали по закону
месей симментальско-голштинского скота Словакии [5]. У животных калмыцкой породы частоты аллелей CSN3Аи CSN3В были одинаковыми.
Согласно литературным сведениям, для сельхозпроизводителей наиболее предпочтителен генотип CSN3BB, ассоциированный с белковомолочностью и желательными технологическими свойствами молока [1, 2-5]. С большей частотой среди обследованного
Таблица 4. Частота встречаемости генотипов и аллелей по локусу гена бета-лактоглобулина (LGB) у крупного рогатого скота, разводимого в Якутии
Порода n Распределение * Частота генотипа, % Частота аллелей, ед. X2
АА 1 АВ | ВВ А | В
Холмогорская 38 Н 18,0 42,0 40,0 0,40±0,05 0,60±0,05 0,52
О 16,0 47,9 36,1
Симментальская 86 Н 13,0 44,0 43,0 0,35±0,04 0,65±0,04 0,06
местной селекции О 12,2 45,5 42,3
Симментальская ав- 75 Н 13,0 60,0 27,0 0,47±0,04 0,53±0,04 4,50
стрийской селекции О 22,1 49,9 28,0
Калмыцкая 12 Н - 33,0 67,0 0,17±0,08 0,83±0,08 0,40
О 2,9 28,3 68,8
*Н - наблюдаемое распределение генотипов, О - ожидаемое распределение генотипов. 104 _ Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. № 11
Таблица 5. Частота встречаемости генотипов и аллелей гена пролактина (PRL) у крупного рогатого скота, разводимого в Якутии
Порода П Распределение * Частота генотипа % Частота аллелей, ед. г2
АА АВ | ВВ А В
Холмогорская 38 Н 71,0 26,0 3,0 0,84±0,04 0,16±0,04 0,01
О 70,5 26,8 2,7
Симментальская 86 Н 65,0 33,0 2,0 0,82±0,03 0,18±0,03 0,56
местной селекции О 67,2 29,5 3,3
Симментальская ав- 75 Н 64,0 35,0 1,0 0,81±0,03 0,19±0,03 2,09
стрийской селекции О 65,6 30,8 3,6
Калмыцкая 12 Н 58,0 52,0 — 0,79±0,08 0,21±0,08 0,81
О 62,5 33,2 4,3
*Н - наблюдаемое распределение генотипов, О - ожидаемое распределение генотипов.
поголовья он был представлен у калмыцкой породы (0,25), с наименьшей - у симменталов австрийской селекции (0,04). У коров холмогорской породы и симментальской австрийской селекции преобладал генотип CSN3АА (50 и 60 %, соответственно). Среди симменталов местной селекции и калмыцкой породы чаще встречались животные с генотипом CSN3АВ (51 и 50 %).
Вычисленный показатель хи-квадрат свидетельствует о недостатке гетерозигот и гомозигот по аллели CSN3В в исследованной группе коров симментальской породы местной селекции, в других изученных группах генное равновесие по локусу каппа-казеина сохраняется (табл. 3).
По локусу гена бета-лактоглобулина у коров исследованных пород обнаружены две аллели - LGBA и LGBB. Наиболее распространены у животных симментальской породы австрийской селекции аллель LGBA(0,47) и генотип LGBAВ(60 %), у симментальской породы местной селекции - аллель LGBВ(0,65), генотипы LGBAВ (44 %) и LGBВВ (43 %). Крупный рогатый скот симментальской породы разной селекции достоверно (р<0,001) отличался по частотам аллелей и генотипов по локусу гена бета-лактоглобулина. У холмогорской породы скота преобладали аллель LGBВ (0,60), генотипы LGBAВ (42 %) и LGBВВ (40 %). У животных калмыцкой породы частота аллели LGBВ составила 0,83, генотипа LGBВВ - 67 %, при полном отсутствии генотипа LGBAА. Полученные результаты согласуются со сведениями Г.А. Звягельского [6],
который также отметил отсутствие гомозигот LGBAА у калмыцкого скота.
Величина показателя х2 указывает на отсутствие статистически достоверного сдвига генетического равновесия в популяции симментальского скота местной селекции по трём изученным генотипам. При сравнительном анализе распространения аллелей гена бета-лактоглобулина выявлены достоверные различия (р<0,001) между всеми изученными породами крупного рогатого скота. Исследования ряда авторов [2, 3, 6] показывают, что высокими удоями обладают животные с генотипами LGBAА и LGBAВ, которые с наибольшей частотой в изученных выборках имелись у коров симментальской породы австрийской селекции. Высокое содержание жира в молоке отмечено у КРС с генотипом LGBВВ [2, 3, 6]. Этот генотип чаще встречали у животных калмыцкой породы и симменталов местной селекции (табл. 4).
Анализ результатов ДНК-тестирования крупного рогатого скота по локусу пролактина выявил наличие аллелей PRLAи PRLB. Частота встречаемости аллели PRLA (0,79-0,84) была достоверно (р<0,001) выше частоты аллели PRLB (0,16-0,21) у всех исследованных пород. При анализе распространения аллелей гена пролактина достоверных различий между породами не выявлено. Преобладали особи с гомозиготным генотипом PRLАА (58-70 %). Животных с генотипом PRLВ В не обнаружено среди исследованных коров калмыцкой породы (табл. 5).
Таблица 6. Значение основных показателей генетической изменчивости крупного рогатого скота Якутии по генам молочности
Порода Локус А * е H o H e F
Холмогорская Каппа-казеин 1,699 0,421 0,411 -0,024
(п=38) Бета-лактоглобулин 1,915 0,421 0,478 0,119
Пролактин 1,362 0,263 0,266 0,010
М±т 1,659±0,161 0,368±0,053 0,385±0,063 0,035±0,043
Симменталь- Каппа-казеин 1,821 0,523 0,451 -0,161
ская местной Бета-лактоглобулин 1,833 0,442 0,454 0,027
селекции Пролактин 1,419 0,314 0,295 -0,062
(п=86) М±т 1,691±0,136 0,426±0,061 0,400±0,052 -0,065±0,054
Симменталь- Каппа-казеин 1,505 0,347 0,336 -0,033
ская австрий- Бета-лактоглобулин 1,991 0,587 0,498 -0,179
ской селекции Пролактин 1,453 0,360 0,312 -0,154
(п=75) М±т 1,650±0,171 0,431±0,078 0,382±0,058 -0,122±0,045
Калмыцкая Каппа-казеин 2,000 0,500 0,500 0,000
(п=12) Бета-лактоглобулин 1,385 0,333 0,278 -0,200
Пролактин 1,492 0,417 0,330 -0,263
М±т 1,626±0,190 0,417±0,048 0,369±0,067 -0,154±0,079
*Ae - эффективное число аллелей; Но - средняя наблюдаемая гетерозиготность; Не - средняя ожидаемая гетерозиготность; Г - коэффициент инбридинга; М±т - величина полиморфности по трём генам.
В исследованных популяциях отмечен избыток гетерозигот, на что указывает величина коэффициента инбридинга по трём генам, имевшего отрицательное значение в калмыцкой породе (-0,154), симментальской породе австрийской (-0,122) и местной селекции (-0,065), а также низкое положительное значение (0,035) в холмогорской породе (табл. 6).
Наибольшая полиморфность по трём генам была характерна для симментальской породы местной селекции (1,691). Степень гетерозиготности по изученным генам варьировала от 0,368 (холмогорская порода скота) до 0,431 (симментальская порода австрийской селекции). Показатель ожидаемой степени гетерозиготности был выше у коров симментальской породы местной селекции (0,400).
Выводы. В популяциях крупного рогатого скота, разводимого в условиях Якутии, выявлено две аллели гена каппа-казеина - CSN3А и CSN3B и три генотипа - CSN3AA, CSN3AB и CSN3BB, с превышающей частотой аллели CSN3A, встречаемость которой варьировала в зависимости от породы от 0,50 до 0,79, над аллелью CSN3B. Наибольшая частота аллели CSN3A отмечена у коров симментальской породы австрийской селекции.
Определены две аллели гена бета-лактогло-булина - LGBA и LGBB и три генотипа LGBAА, LGBAВ и LGBВВ. Установлено, что у крупного рогатого скота холмогорской, калмыцкой и симментальской пород местной селекции частота встречаемости аллели LGBA низкая (от 0,17 до 0,47 в зависимости от породы).
Выявлены две аллели гена пролактина - РЯЦ^и PRLВ и три генотипа PRLAА, РЯЬЛВ и PRLВВ. Частота встречаемости аллели PRLA (0,79-0,84) достоверно преобладала над частотой аллели PRLВ (0,16-0,21) у всех исследованных пород крупного рогатого скота (р<0,001).
Симментальская порода местной селекции обладала наибольшей полиморфностью по трём изученным генам (1,691) и самой высокой степенью гетерозиготности (0,400).
В исследованных породах крупного рогатого скота наблюдали избыток гетерозигот, на что указывает рассчитанный коэффициент инбридинга по трём генам, который имел отрицательное значение в калмыцкой (-0,154), симментальской породе австрийской (-0,122) и местной селекции (-0,065), а также низкое положительное значение в холмогорской породе (0,035).
Литература.
1. Калашникова Л.А. Дунин И.М., Глазко В.И. ДНК-технологии оценки сельскохозяйственных животных. Лесные Поляны: Изд-во ВНИИплем, 1999. 148 с.
2. Характеристика быков-производителей с различными комбинациями генотипов каппа-казеина, бета-лактоглобулина по молочной продуктивности их матерей/ Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов, С.В. Тюлькин, Т.М. Ахметов, Р.Р. Вафин//Ветеринарная практика. 2007. Т. 39. № 4. С. 59-64.
3. Ахметов Т.М., Тюлькин С.В., Валиуллина Э.Ф. Генотипирование коров по локусам каппа казеина, бета-лактоглобулина и BLAD-мутации// Ученые записки кгАВМ. 2011. №5 С. 11-17
4. Polymorphisms in beta and kappa-kasein are not associated with milk productions in two highly technified populations of Holstein cattle in Mexico/ T. Duifhuis-Rivera, C. Lemus-Flores, М.Б. Ayala-Valdovinos, D.R. Sбnchez -Chipms, J. Gal'/ndo-Gar^a, K. Mejнa-Martнnez,E. Gonzбlez-Covarrubias// Journal of Animal & Plant Sciences. 2014. № 24(5). Рр. 1316-1321.
5. Trakovickа A., Moravcikova N., Navratilova A. Kappa-casein gene polymorphism (CSN3) and its effect on milk production traits. Acta fytotechnica et zootechnica 3 Nitra, Slovaca Universitas Agriculturae Nitriae. 2012. №3. Рр. 61-64
6. Звягельский Г.А. Полиморфизм гена В-лактоглобулина у калмыцкого, голштинизированного черно-пестрого и зебу-видного крупного рогатого скота //Актуальные проблемы науки ХХ1 века: сборник статей международной исследовательской организации «Cognitio» по материалам V Международной научно-практической конференции. С-П.: Международная исследовательская организация «Cognitio», 2015. Ч. 1. С. 104-108.
7. Peakall R., Smouse P.E. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research - an update // Bioinformatics. 2012. № 28. Рр. 2537-2539.
8. Denicourt D., Sabour M.P., McAllister A.J. Detection of bovine k-casein genomic variants by the polymerase chain reaction method//Animal Genetics. 1990. V.21. Рр. 215-216
9. Medrano J.F., Aguilar-Cordova E. Polimerase chain reaction - amplification of bovine beta-lactoglobulin genomic sequences and identification of genetic variants by RFLP analysis // Animal Biotechnology. 1990. V.1. P. 73.
10. Mitra A., Schlee P., Balakrishnan C.R., Pirchner F. Polymorphism at growth hormone and prolactin loci in Indian cattle and buffalo//J. Anim. Breed. Genet. 1995.V. 112. Рр. 71-74.
POLYMORPHISM OF CSN3, LGB AND PRL GENES OF CATTLE, BRED IN THE SAKHA (YAKUTIA)
REPUBLIC
N.I. Pavlova12, N.P. Filippova1,A.V. Chugunov1, V.V. Dodokhov1
'Yakutsk Agricultural Academy, ul. Krasil'nikova, 15, Yakutsk, 677007, Russian Federation
2Yakut Scientific Center of Complex Medical Problems, Sergelyakhskoe sh., 4, Yakutsk, 677007, Russian Federation Summary. We examined DNA samples from cows of Simmental breed of the local breeding (n = 86) from SKhPK "Ust'-Aldan", Ust-Aldan district; Kholmogory breed (n = 38) from OOO "Kladovaya Olekmy", Olekminsk district; Simmental breed of Austrian breeding (n = 75) and Kalmyk breed (n = 12) from OOO "Agrofirma Nemyugyu", Khangalassky district of the Sakha (Yakutia) Republic. The experiments were carried out in the Laboratory of breeding and genetics at the premises of Yakutsk State Agricultural Academy. It was revealed two alleles of kappa-casein gene: CSN3A and CSN3B, and three genotypes: CSN3AA, CSN3AB and CSN3BB, with greater frequency of CSN3A allele, which varied depending on the breed from 0.50 to 0.79. The highest frequency of CSN3A allele (0.79) was registered in cows of Austrian Simmental breed. In cattle of Kholmogory and Kalmyk breeds and Simmental breed of local and Austrian breeding the frequency of LGBA allele varied from 0.17 to 0.47. It was revealed two alleles of prolactin gene: PRLA and PRLB, and three genotypes: PRLAA, PRLAB and PRLBB. The frequency of PRLA allele (0.79-0.84) significantly prevails over the frequency of PRLB allele (0.160.21) in all investigated cattle breeds (p is less 0.001). Simmental breed of the local breeding possesses the highest polymorphy in the three studied genes (1.691) and the highest degree of heterozygosity (0.400). In the studied cattle breeds there is an excess of heterozygotes, as indicated by the calculated inbreeding coefficient for the three genes, which has a negative value in Kalmyk (-0.154), Austrian Simmental breed (-0.122) and the local Simmental breed (-0.065) and slightly positive value in Kholmogory breed (0.035). Keywords: gene, kappa-casein, beta-lactoglobulin, prolactin, allele, genotypes, polymorphism, cattle.
Author Details: N.I. Pavlova, research fellow (e-mail: [email protected]); N.P. Filippova, Cand. Sc. (Biol.), assoc. prof.; A.V. Chugunov, D. Sc. (Biol.), prof.; V.V. Dodokhov, senior research fellow.
For citation: Pavlova N.I., Filippova N.P., Chugunov A.V., Dodokhov V.V. Polymorphism of CSN3, LGB and PRL Genes of Cattle, Bred in the Sakha (Yakutia) Republic. Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2016. V. 30. No.11. Pp. 103-106 (in Russ.).
