CC BY
20
© Волкова Н. О., Юхта М. С., Юрчук Т. О., Ревенко О. Б., Степанюк Л. В. УДК 618. 11-002. 2-085:611. 018. 46
Волкова Н. О., Юхта М. С., Юрчук Т. О., Ревенко О. Б., Степанюк Л. В.
ПОКАЗНИКИ КРОВ1 ТВАРИН 3 ХРОН1ЧНИМ ЗАПАЛЕННЯМ ЯСЧНИК1В ТА
ВВЕДЕННЯМ МУЛЬТИПОТЕНТНИХ МЕ3ЕНХ1МАЛЬНИХ СТРОМАЛЬНИХ
КЛ1ТИН К1СТКОВОГО МОЗКУ
1нститут проблем крюбюлогм i кргомедицини НАНУ (м. Харкгв)
Робота виконана в рамках НДР «Оптим1зац1я репродуктивно! функци тварин i людини за допо-могою крiоконcервованих клiтинних препара^в та фiзико-хiмiчних факторiв», № держ. реecтрацiI 0111U001197.
Вступ. Жiноче безплщдя запального ^енезу за-лишаеться одыею з актуальних проблем сучасно! ri-некологiI [4]. Слiд зазначити, що хронiчне запалення яeчникiв (ХЗЯ) у велиюй мiрi зумовлено наявнicтю первинного iмунодефiциту, який сприяе переходу гострого запального процесу в хроычну стадю. У той же час тривалий запальний процес призводить до зниження iмунологiчноI реактивност органiзму. На ефекторному рiвнi хронiзацiя запалення, насам-перед, пов'язана з недостатнютю системи кров^ що розвиваеться при перcиcтенцiI флогогена [6]. Доогмдження гематологiчних маркерiв запалення е одним з ключових момен^в при вивченнi протiкання запальних процеЫв i !х корекцп.
Eфективнicть лкування ХЗЯ як правило не ви-сока, у зв'язку з чим Ытенсивно проводяться досл^ дження альтернатив них методiв лiкування. Aналiз лiтератури вказуе на доцiльнicть проведення досл^ джень, в яких вивчаеться оптимiзацiя гормонально! та репродуктивно! дисфункцм за допомогою пре-паратiв, до складу яких входять як бюлопчно актив-н сполуки, так i cтовбуровi кJliтини. Так, наприклад, крiоекcтракти плаценти використовуються як сти-мулятори гормонально! i репродуктивно! функцм в органiзмi [3], а мультипотентним мезенхiмальним стромальним клггинам (ММСК) властива iмуномо-дулююча дiя [10]. Застосування сучасних технологiй культивування та крюконсервування дозволяе ви-користовувати cтовбуровi клiтин в cучаcнiй терапи гiнекологiчних захворювань.
Метою роботи було доотдження динамiки по-казникiв запалення у кровi тварин з хроычним за-паленням яeчникiв за умов внутршньовенного введення культивованих та крюконсервованих муль-типотентних мезенхiмальних стромальних кл™н кicткового мозку.
Об'ект i методи дослгдження. В роботi вико-ристовували ММСК юсткового мозку мишей (n = 5), якi отримували зi стегнових кicток методом, що за-безпечуе адгезiю стромально! фракци до культу-рального пластику з подальшим видаленням фракц^ клiтин, що не адгезували. У робо^ були використаы
cтандартнi умови культивування при 37°С в атмос-ферi 5 % СО2.
Крiоконcервування культур ММСК здмснювали пiд захистом 10 % дiметiлcульфокcиду («PAA», Ав-cтрiя) з додаванням 20 % ембрюнально! сироватки велико! рогато! худоби на середови!^ IMDM («РАА»). Отриману cуcпензiю вмiщували по 1 мл у крiопробiр-ки («Nunc», США), охолоджували зi швидюстю 1°С/ хв до -80°С з подальшим зануренням у рщкий азот [1]. Вiдiгрiвали зразки на водянм банi при 37°С та вщмивали вiд крiозахиcного середовища шляхом центрифугування.
В якос^ експериментальних тварин були вико-риcтанi 60 безпорiдних cтатевозрiлих бтих мишей-самок з масою тта 18-20 г. ХЗЯ моделювали шляхом одноразового внутршньочеревинного введення по-близу знаходження яeчникiв iнактивовано! вакцини Staphylococcus aureus штам 209 у дозi 50х106 мiкро-бних тiл [2]. На 22 добу з моменту введення Ыакти-вовано! вакцини тваринам проводили введення у бокову хвостову вену: контрольна група (n = 15) - ф^ зюлопчний розчин (0,2 мл); дослщна група 1 (n = 15) - культивоваы ММСК (КММСК) кicткового мозку; дослщна група 2 (n = 15) - крюконсервоваы ММСК (КрММСК) юсткового мозку. Об'ем введено! рiдини у вЫх доcлiдних групах складав 0,2 мл на тварину, який мютив 0,5х105 клiтин. Також була сформована група штактних тварин (n = 15) аналопчно! маси та в^ без будь-яких втручань.
На 5, 10 i 20 добу з моменту введення ММСК ви-значали загальну юльюсть лейкоци^в периферiйно! кровi [7], швидкicть оciдання еритроцитiв (ШОЕ) та робили мазок кровi для визначення лейкоцитарно! формули [5]. ^м того визначали вмicт загально-го бтка у cироватцi кровi (СпайнЛаб, Укра!на) та С-реактивного бiлка (ЗАО «бКОлаб», Pоciя). Óci ма-ыпуляци з тваринами здiйcнювали вiдповiдно до вимог [8].
Утримання тварин та експерименти проводили-ся вщповщно до положень «бвропейсько! конвенцi! про захист хребетних тварин, яю використовуються для експеримен^в та iнших наукових цтей» (Страсбург 1985), «Загальних етичних принцитв експери-ментiв на тваринах», ухвалених Першим нацiональ-ним конгресом з бюетики (Ки!в, 2001).
При статистичнм обробцi результатiв викорис-товували однофакторний диcперciйний аналiз i
Taблиця
^^инний cклaд кpoвi мишвй з ХЗЯ тa тepaпieю MMCK
(M ± m, n = 5)
Гpyпa твapин Cтpoк ^oCTe-peжeння Зaгaльнa кiлькicть лeйкoцитiв Пoкaзники о^гаду кpoвi, %
Heйтpo-фiли Еозино-фiли Moнo-цити Лiмфo-цити
Koнтpoль 1C дoбa 17,3 t 2,45# 26,4 t 7,1 1,2tC,B# 15,6 t 4,9# 56,8 t 9,6
2C дoбa 17,75 t 3,73# 19,7 t 6,9 1,8 tC,4 16,9t6,8# 61,6 t 11,3
KMMCK 1C дoбa 7,65 t 2,59* 21,7 t 8,3 2,7 t C,5 15,2t5,5# 6C,4 t 12,3
2C дoбa 7,5 t 3,25* 31,4 t 9,1 2,4 t C,5 6,8t3,2* 59,4 t 11,5
KpMMCK 1C дoбa 6,35 t 1,9В* 3C,3 t 5,9 3,8 t1,5 16,5 t 6,9# 49,4 t 12,9
2C дoбa 6,2 t 1,67* 35,8 t 5,9 2,C t 1,C 5,1 t 2,C* 57,1 t 14,3
Iнтaкт 6,9t3,29 3C,2 t 5,9 3C,2 t 5,9 2,4t1,2 64,2 t 9,7
Пpимiткa: * - piзниця cтaтиcтичнo знaчyщa з гpyпoю кoнтpoлю (P < C,C5; n = 5); # - p^Mö^ cтaтиcтичнo знaчyщa з iнтaктними твapинaми (P < C,C5; n = 5).
t-кpитepiй Cтьюдeнтa з викopиcтaнням пpoгpaми Statistica В.
Peзyльтaти дocлiджeнь тa ïx oбгoвopeння. Pe-
зyльтaти пoпepeднix нaшиx дocлiджeнь [9] евщчили, що нa 2Ü до6у y твapин з тepaпieю KpMMCK нa фoнi згacaння зaпaльниx пpoявiв вiдбyвaлacь aктивiзaцiя peпapaтивнoгo пpoцecy з тeндeнцieю до нopмaлiзa-ци мopфoлoгiчниx пapaмeтpiв oвapiaльнoÏ ткaнини.
Пpи вивчeннi лeйкoцитapнoÏ peaкцiÏ пepифepiй-нoÏ кpoвi 6уло вcтaнoвлeнo (тaбл.), що ввeдeння як кyльтивoвaниx, тaк i кpioкoнcepвoвaниx MMCK знижуе зaгaльнy кiлькicть лeйкoцитiв до погазни-кiв iнтaктниx твapин нa 1C до6у тepaпiÏ, що, мaбyть, пoв'язaнo з iмyнoмoдyлюючим впливом нa пpoцecи зaпaлeння тa гeмoпoeз. У кoнтpoльнiй гpyпi твapин з ввeдeнням фiзioлoгiчнoгo poзчинy нa вcix тepмiнax cпocтepeжeння збepiгaвcя нeзнaчний лeйкoцитoз, що cвiдчилo пpo пepcиcтeнцiю зaпaльниx пpoцeciв.
Зacтocyвaння пpeпapaтiв MMCK в тepaпiÏ ХЗЯ cyпpoвoджyвaлocя тeндeнцieю до нopмaлiзaцiÏ лeй-кoцитapнoÏ фopмyли кpoвi впpoдoвж 2C дiб (тaбл.). Зa cпiввiднoшeнням лeйкoцитiв вcix видiв в кpoвi пiдцocлiдниx твapин пpocтeжyвaлacя oднaкoвa зa-кoнoмipнicть: пpи зaпaлeннi нa xni зacтocyвaння кж-тинниx пpeпapaтiв дocтoвipнo знижyвaлacя кiлькicть мoнoцитiв пepифepiйнoÏ фов^ a вiднocнa кiлькicть нeйтpoфiлiв пpи цьому збiльшyвaлacя у пopiвняннi з кoнтpoлeм нa 2C добу.
Пpи визнaчeннi лeйкoцитapниx iндeкciв вияви-ло^, що нa пpoтязi вcьoгo CTpo^ eкcпepимeнтy вeличинa лiмфoцитapнoгo iндeкcy (cпiввiднoшeння лiмфoцитiв до нeйтpoфiлiв) нa xni клiтиннoÏ тepaпiÏ мaлa тeндeнцiю до знижeння cтocoвнo кoнтpoлю. Ha 2C добу тepaпiÏ KMMCK i KpMMCK цeй iндeкc був вipoгiднo нижчe, нiж у кoнтpoлi нa 4C i 49 % вщпо-вщно. Iндeкc Kpeбca (IK - cпiввiднoшeння нeйтpo-фiлiв до лiмфoцитiв) пocтyпoвo зpocтaв i до кiнця eкcпepимeнтy дocягaв знaчeнь iнтaктниx твapин. У кoнтpoльнiй гpyпi cпocтepiгaлacя змeншeння IK в 1,5 paзiв вiднocнo ^aiay, що мaбyть пoв'язaнo зi зни-жeнням aктивнocтi фaгoцитapниx peaкцiй. Iндeкcи cпiввiднoшeння нeйтpoфiлiв до мoнoцитiв (ICHM) тa
лiмфoцитiв до мoнoцитiв (ICËM) зa умов тepaпiÏ мaли позитивну динaмiкy вiднoвлeння, xoчa до юнця дocлiджeння i нe дocягaли вiдпoвiдниx пoкaзникiв iнтaктниx твapин.
Cлiд зaзнaчити, що дaнi ш-дeкcи у кoнтpoльниx твapин пpo-тягом в^ого тepмiнy ^o^epe-жeння зaлишaлиcя знижeними. Taким чином, ввeдeння як куль-тивoвaниx, тaк i кpioкoнcepвoвa-ниx MMCK cпpиялo нopмaлiзa-цп cпiввiднoшeння aфeктopнoÏ i eфeктopнoÏ лaнoк iмyнoлoгiчнoгo пpoцecy.
Oднoчacнo були дocлiджeнi потазники aктивнocтi зaпaльнoгo пpoцecy в cиpoвaтцi кpoвi, a caмe вмicтy зaгaльнoгo бiлкa тa peaкцiÏ нa CPÁ. У кoнтpoльнoÏ гpyпи твapин вмют зaгaльнoгo бiлкy був вipoгiднo вищe нa до^-джeниx cтpoкax нa 1C, 25 тa 14 % ото^вно iнтaктниx твapин. У твapин з тepaпieю cпocтepiгaли нopмaлi-зaцiю вмicтy зaгaльнoгo бiлкa пoчинaючи з 5 доби i до зaвepшeння cпocтepeжeння (pиc. 1 ).
5 10 20
Термш спостереження, доба
□ контроль □ КММСК & КрММСК
Pиc. 1. Динaмiкa вмюту зaгaльнoгo бiлкa в cиpoвaт-цi кpoвi мишeй з ХЗЯ ra тepaпieю MMCK (*- piзниця cтaтиcтичнo знaчyщa з гpyпoю кoнтpoлю (P < 0,05; n = 5); # - piзниця cтaтиcтичнo знaчyщa з iнтaктними твapинaми (P < 0,05; n = 5); пyнктиpнa лiнiя -пoкaзник iнтaктниx твapин).
Дocлiджeння по виявлeнню C-peaктивнoгo бтга в cиpoвaтцi кpoвi cвiдчили, що у вcix твapин з кглтин-ною тepaпieю вжe нa 1C добу peaкцiя нa CPÁ cтaвaлa нeгaтивнoю iз збepeжeнням eфeктy до зaвepшeння eкcпepимeнтy. В гpyпi кoнтpoльниx твapин нa xni нe-знaчнoÏ гiпepпpoтeÏнeмiÏ peaкцiя нa CPÁ пpoтягoм cпocтepeжeння зaлишaлacя cлaбoпoзитивнoю.
Aнaлoгiчнa тeндeнцiя cпocтepiгaлacя i пpи aнaлiзi peзyльтaтiв вимipювaння ШОЕ пicля ввeдeння кгм-тинниx пpeпapaтiв (pиc. 2). Було вcтaнoвлeнo, що нa пpoтязi в^ого cтpoкy дocлiджeння у твapин з тe-paпieю нe вiдзнaчaлocя вipoгiдниx змiн ШОЕ. В гpyпi кoнтpoлю дocлiджeний пoкaзник вipoгiднo пepeви-щyвaв вiдпoвiднi знaчeння у iнтaктниx твapин i твapин з тepaпieю (в 2,3 тa 1,В paзи вщповщно нa 2C добу).
#
запального процесу в яечниках ймов1рно пов'язаний з ¡муномодулюючими властивостями дослщжених препара^в.
Незважаючи на те, що первинний ¡нтерес до ММСК пов'язаний з потенцмною здатнютю до реге-нерацп тканин, вщкриття ïx ¡муномодулюючих влас-тивостей дозволяе розширити напрямки ключного застосування. При активаци сигналами запального м1крооточення, ММСК здатн комплексно впливати на клггини iмунноï системи за допомогою контактних i гуморальних меxанiзмiв, приводячи до зниження клiтинноï реактивностi та стимуляцп лейкоцитiв [10].
Oтриманi результати iмуномодулюючого впливу культивованих та крюконсервованих ММСК на пере-бiг вщновлення показникiв кровi тварин з хроычним запаленням яeчникiв дозволяе зробити висновок про можливють ïx застосування в комплексна тера-пiï гiнекологiчниx захворювань.
Висновки. Генералiзоване введення як культивованих, так i крюконсервованих мультипотент-них мезенxiмальниx стромальних клiтин кюткового мозку тваринам з xронiчним запаленням яечниюв чинить модулюючу дiю на переб^ запалення.
Перспективи подальших дослщжень. Важли-вим питанням, яке потребуе детального вивчення, е вплив терапи ММСК на фертильнiсть тварин з ХЗЯ.
Л^ература
1. Волкова Н. O. До^дження морфофункцiональниx характеристик крюконсервованих культур кштин стромального походження / Н. O. Волкова // Проблемы криобиологии. - 2012. - Т. 22, № 2. - С. 118-125.
2. Волкова Н. O. Моделювання хрошчного запалення яечниюв / Н. O. Волкова, М. С. Юхта, Т. O. Юрчук [и др.] // Патолопя. - 2014. - № 1. - С. 100-104.
3. Грищенко Н. Г. Влияние криоэкстракта плаценты на течение хронического воспаления яичников у мышей / Н. Г. Гри-щенко, Н. А. Клименко, Н. И. Горголь [и др.] // Медицина сьогодш i завтра. - 2010. - № 2-3. - С. 47-48.
4. Дубоссарская З. М. Хронические воспалительные процессы внутренних женских половых органов / З. М. Дубоссар-ская, А. И. Миляновский, В Г. Коляденко - К. : Здоровье, 2003. - С. 115-118.
5. Западнюк И. П. Лабораторные животные : разведение, содержание, использование в эксперименте / И. П. Запад-нюк, В. И. Западнюк, Е. А. Захария. - К. : «Вища школа», 1983. - 305 с.
6. Клименко Н. А. Костномозговое кроветворение и лейкоцитарная реакция периферической крови при хроническом воспалении на фоне локального удаления тканевых базофилов / Н. А. Клименко, М. В. Лупырь // Буковинський ме-дичний вюник. - 2008. - Т. 12, № 3. - С. 81-86.
7. Лабораторные методы исследования в клинике : Справочник / Под ред. В. В. Меньшикова. - М. : Медицина, 1987. -368 с.
8. Directive 2010/63/eu of the European parliament and of the council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes // Journal of the European Union. - 2010. - L 276/33.
9. Volkova N. А. Multipotent mesenchymal stromal cells of bone marrow in therapy of chronic inflammation of the murine ovaries / N. А. Volkova, M. S. Yukhta, Т. А. Yurchuk [et al.] // Biotechnologia Acta. - 2014. - Т. 7, № 5. - С. 35-42.
10. Weina L. Effect of mesenchymal stem cell transplantation on immunological injury of the ovary in mice / L. Weina, x . Qi x uan, Q. Junwen [et al.] // J. South Med. Univ. - 2011. - Vol. 31, № 5. - P. 825-829.
УДК 618. 11-002. 2-085:611. 018. 46
ПОКАЗНИКИ КРОВ1 ТВАРИН 3 ХРОН1ЧНИМ ЗАПАЛЕННЯМ Я6ЧНИК1В ТА ВВЕДЕННЯМ МУЛЬТИПО-ТЕНТНИХ МЕ3ЕНХ1МАЛЬНИХ СТРОМАЛЬНИХ КЛ1ТИН КЮТКОВОГО МОЗКУ
Волкова Н. О., Юхта М. С., Юрчук Т. О., Ревенко О. Б., Степанюк Л. В.
Резюме. Встановлено, що як культивоваы, так i крюконсервоваы мультипотентн мезенxiмальнi стро-мальн кгмтини кюткового мозку за умов генералiзованого введення чинять модулюючу дю на перебк запалення, що характеризуемся вщновленням загально'| ктькост лейкоци^в, формули кров^ реакци на С-реактивний бток, вмюту загального бтка та швидкост осщання еритроци^в у кровi тварин з хроычним запаленням яечниюв.
Ключов1 слова: мультипотенты мезенxiмальнi стромальы кттини кюткового мозку, культивування, крю-консервування, хроычне запалення яечниюв.
7 6
О 5
's 4
s
« 3 О
а 2 i 0
□ Контроль
10
Доба лкування
□ КММСК □ КрММСК
Рис. 2. ШОЕ в динамщ1 у мишей з ХЗЯ та терашею ММСК (* - р1зниця статистично значуща з групою контролю (Р < 0,05; n = 5); # - р1зниця статистично значуща з ¡нтактними тваринами (Р < 0,05; n = 5); пунктирна лЫя - показник ¡нтактних тварин).
За сукупнютю проаналiзованиx маркерiв запалення в кровi експериментальних тварин можна стверджувати про наявнють позитивно'! тенденцп в переб^ ХЗЯ пюля введення кл^инних препара^в -КММСК i КрММСК кюткового мозку, - без вiрогiдноï рiзницi мiж ними. Корегуючий вплив генералiзова-ного введення ММСК кюткового мозку на проткання
УДК 618. 11-002. 2-085:611. 018. 46
ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ ЖИВОТНЫХ С ХРОНИЧЕСКИМ ВОСПАЛЕНИЕМ ЯИЧНИКОВ И ВВЕДЕНИЕМ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА
Волкова Н. А., Юхта М. С., Юрчук Т. А., Ревенко О. Б., Степанюк Л. В.
Резюме. Установлено, что как культивированные, так и криоконсервированные мультипотентные ме-зенхимальные стромальные клетки костного мозга в условиях генерализованного введения оказывают модулирующее действие на течение воспаления, которое характеризуется восстановлением общего количества лейкоцитов, формулы крови, реакции на С-реактивный белок, содержания общего белка и скорости оседания эритроцитов в крови животных с хроническим воспалением яичников.
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга, культивирование, криоконсервирование, хроническое воспаление яичников.
UDC 618. 11-002. 2-085: 611. 018. 46
Haematological Parameters of Animals with Chronic Inflammation of the Ovaries and Bone Marrow Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Administration
Volkova N. О., Yukhta M. S., Yurchuk T. О., Revenko O. B., Stepanjuk L. V.
Abstract. Female infertility of inflammatory genesis remains one of the most urgent problems of modern gynecology. In this case an alternative method to optimize the hormonal and reproductive dysfunctions is the use of medicines contained biologically active compounds or stem cells.
The aim of the study was to determine the haematological parameters in the animals with chronic inflammation of the ovaries after generalized administration of cultured and cryopreserved bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells (CMMSCs and CrMMSCs respectively).
Materials and methods. All manipulations with animals were carried out according to "European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for E x perimental and other Scientific Purposes" (Strasbourg, 1986).
MMSCs were isolated from resected femur of mice (n = 5) and cultured under standard conditions (37°C, 5 % CO2, 95 % humidity) according to the method providing an adhesion of stromal fraction to the culture plastic with following removal of the non-adhered cells.
MMSCs' suspension was cryopreserved in cryovials under protection of 10 % DMSO and 20 % fetal bovine serum on the base of nutritive medium with rate 1 deg/min to -800C and following plunging in liquid nitrogen. Samples were stored in a low temperature bank for 3 months and then were thawed on water bath (400C) with following removal of cryoprotectant by centrifugation.
Chronic inflammation of the ovaries was modeled by a single intraperitoneal administration of inactivated vaccine of Staphylococcus aureus strain 209 in the dose 50*106 microbial bodies. At the 21st day the mice of the control group (n = 5) were intravenously administrated by saline solution (0.2 mL), and the animals of e x perimental groups 1 (n = 5) and 2 (n = 5) were treated with 0.5*106 CMMSCs and CrMMSCs respectively. Nontreated animals (n = 5) served as intact control. Evaluation of the MMSCs' therapy efficiency was performed using haematological (leukocyte number of peripheral blood, leukogramm, erythrocyte sedimentation rate) and biochemical (serum protein content, response to C-reactive protein) methods at the 5th, 10th and 20th days after cell administration.
Results. It was found that in the control group of animals with saline administration on all terms of observation slight leukocytosis remained indicating the persistence of inflammation. The total serum protein content in this group of animals remained significantly higher too with respect to intact mice (on 10, 25 and 14 % at the 5th, 10th and 20th days respectively). Together with hyperproteinemia e x istence a response to C-reactive protein remained weakly positive during all observation in case of the saline administration. The same applied to the erythrocyte sedimentation rate: in the control group it was significantly higher than the values in intact animals and animals with therapy (2.3 and 1.8 times respectively at the 20th day).
At the same time CMMSCs and CrMMSCs in generalized administration had a modulating effect on the course of inflammation which was characterized by decrease of the total leukocyte number and normalization of leukogramm, total protein level, C-reactive protein and erythrocyte sedimentation rate to the 20th day of observation. It should be noted that the significant difference of studied parameters between cultured and cryopreserved MMSCs was not found.
Jointly analyzing of inflammation markers in the blood of e x perimental animals it can be argued about the presence of a positive trend in the course of inflammation after CMMSCs and CrMMSCs administration. Correction effect of generalized MMSC administration on the chronic inflammation of the ovaries probably associated with immunomodulatory properties of investigated objects.
Keywords: bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells, culturing, cryopreservation, chronic inflammation of the ovaries.
Рецензент - проф. Шеп/тько В. I.
Стаття надшшла 02. 03. 2015 р.
