CC BY
18
нологической перестройки в организме привитых мышей, коррелирующей с уровнем протективности антигена.
Методика импульсной проточной цитометрии отличается информативностью, достоверностью и высокой производительностью. Для отдельного анализа требуется не более 0,1 мл цельной крови, выделенной от каждого лабораторного животного, и не более 10 мин времени. Исследование достаточного числа клеток перитонеального экссудата (макрофагов) не требует создания асептического воспаления, изменяющего исходный клеточный состав (соотношение лимфоцитов и макрофагов) в брюшной полости лабораторных животных и увеличивающего сроки сравнительного анализа. При этом используется только раствор относительно недорогого красителя акридинового оранжевого.
В целом сравнительная оценка биологической активности препаратов капсульного антигена с использованием метода проточной цитофлуориметрии открывает, на наш взгляд, новые возможности для определения их качества и стандартизации.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Дальвадянц С.М., Дятлов И.А., Еремин С.А., Кутырев В.В. // Пробл. особо опасных инф. - 2003. - Вып. 85. - С. 127-136. - 2. Ермакова Г.В., Тараненко Т.М., Наумов А.В. и др. //. Микробиол., биохим. и специфич. про-филакт. карантин. инф. - Саратов, 1990. - С. 84-89. -3. Киреев М.Н., Тараненко Т.М., Веренков М.С. и др. // Пробл. особо опасных инф. - 2001. - Вып. 1 (81). - С. 114119. - 4. Кирилличева Г.Б., Наумов А.В., Стукова
Н.Ю. и др. // Бюл. эксп. биол. и мед. - 1993. - № 5. - С. 494497. - 5. Кравцов А.Л. Микрофлуориметрическое исследование в потоке гетерогенных популяций бактерий У. резйз и клеток иммунной системы инфицированных чумой лабораторных животных. Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - Саратов. -1997. - 57 с. - 6. Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология чумы. - Саратов. - 1992. - 172 с. -7. Руководство по профилактике чумы / Под ред. А.В.Нау-мова, Л.В.Самойловой. - Саратов, 1992. - 218 с. - 8. Сердо-бинцев Л. Н. , Тараненко Т. М. , Веренков М. С. , Наумов А.В. // Вопр. профилакт. природно-очаговых инф. -
Саратов, 1983. - С. 3l-41. - 9. Сероглазов B.B., Дальвадянц ^M., Bейнблат B.^ и др. // Пробл. биотехнол., микробиол. и иммунол. особо опасных инф. - Саратов, 1984. -С. 31-34. - І0. Щуковская ^Н., Назарова Л.С., Tара-ненко T.M. // Пробл. особо опасных инф. - 1999. - Bbm. 79. -С. 131-13l. - ІІ. Abrams W.R., Dramond L.W., Kane A.B. // J. Histochem. and Cytochem. - 1983. - Vol. 31, N б. - P. l3l-l44. - І2. Baker E.E., Sommer H.L., Foster L.B. et al. // J. Immunol. - 1952. - Vol. б8, N 2. - P. 131-145. -ІЗ. Melamed M.R., Adams L.R., Traganos F., Kamensky L.A. // J. Histochem. Cytochem. - 19і4. - Vol. 22, N 1. - P. 526-53Q. - І4. Perry R.D., Fetherston J.D. // Clin. Microbiol. Rev. - 199l. - Vol. 1Q, N 1. - P. 35-бб. - І5. Shields R., Burnett W. // Anal. Chem. - 196Q. - Vol. 32, N l. - P. 885-88б.
M.N.Kireev, A.L.Kravtsov, T.M.Taranenko, T.A.Chramchenkova, S.I.Klyueva, N.P.Gooseva, T.P.Shmelkova
Comparative Evaluation of the Degree of Activation of Immunophagocytic System Cells in Mice Immunized with Different Preparations of the Plague Agent Capsular Antigen, by Means of the Flow Cytometry
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov
The degree of activation of immunophagocytic system cells in white mice immunized with different preparations of the plague agent capsular antigen F1 was evaluated by means of the flow cytometry. Comparison of the effect of two finely purified serologically identical antigenic F1 preparations differing in their chemical content isolated from Y. pestis vaccine strain EV NIIEG, carbohydrate-containing protein F1A and pure protein F1B was carried out. Cytometric analysis showed that F1A preparation isolated from the agar culture had more pronounced effect on the metabolism of immuno-phagocytic system cells than that of F1B isolated from the broth culture, and caused intensive activation of the nucleus chromatin not only of the blood leucocytes, but the peritoneal exudate macrophages as well, this activation being the index of the immunological reorganization of the organism correlating with the antigen protectivity level. The obtained cytometric characteristics of the immunobiological properties of the plague agent capsular antigen F1 would be useful when choosing the most effective preparation to become the component of plague chemical vaccine.
Key words: immunophagocytic system cells, Yersinia pestis capsular antigen F1, flow cytometric studies, immunochemical and immunobiological properties.
Поступила 05.03.07.
УДК 616.981.452:576.895.2
Т.А.Малюкова, Е.М.Г оловко, Т.А.Костюкова, С.А.Щербакова, Е.А.Плотникова, М.Н.Ляпин
ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА, ОТОБРАННОГО В СОПРЯЖЕННЫХ ОЧАГАХ ЧУМЫ И АРБОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ, К ПРОВЕДЕНИЮ СЕРОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ.
Сообщение 1
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Предложен способ обработки взвесей вакцинного штамма чумного микроба p-пропиолактоном (БПЛ). Показано, что БПЛ оказывает обеззараживающее действие при температуре 4 °С в конечных концентрациях 0,1 % при экспозиции 6 и более часов и 0,05 % при экспозиции не менее 24 ч. В ходе изучения влияния способа обеззараживания материала на чувствительность и специфичность ИФА продемонстрировано, что обработка бактериальных образцов БПЛ не снижает названные показатели, т.е. не отражается на качестве иммунологического анализа.
Ключевые слова: Yersinia pestis, арбовирусы, обеззараживание, Р-пропиолактон, ИФА.
С начала 90-х годов прошлого века отмечается ных инфекций как в мире, так и на территории Рос-активизация природных очагов чумы и арбовирус- сии. К этому времени в нашей стране наиболее
сложная эпизоотологическая ситуация по чуме сложилась в Астраханской области и Республике Калмыкия [4, 11]. При этом зарегистрированы вспышки Крымской геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила в Ставропольском крае с последующей активизацией эпизоотического и эпидемического процесса и расширением ареала очагов на территории Астраханской, Волгоградской областей, Республик Калмыкия, Дагестан, Краснодарского края [4, 5, 9, 11]. Сопоставление данных по территориальной приуроченности очагов чумы [10] и ар-бовирусов [5] свидетельствует о существовании сопряженных очагов этих инфекций. Серологическое исследование материала, отобранного на данных территориях, - одно из основных мероприятий эпидемиологического надзора. Необходимость обеспечения биологической безопасности при проведении манипуляций, снижения риска инфицирования персонала обусловливают актуальность разработки способов предварительной обработки (обеззараживания) проб. При проведении обследования территорий на наличие возбудителей чумы и арбо-вирусных инфекций в качестве образцов обычно берут внутренние органы грызунов. Действующими санитарными правилами [2] регламентирована предварительная обработка материала при проведении серологических исследований, включающая обеззараживание взвесей чумного микроба и суспензий органов грызунов добавлением проверенного на бактерицидное действие формалина, и не указаны способы обработки вируссодержащих образцов. Методические рекомендации по работе с арбовирусами [3] предлагают проводить инактивацию их инфекционной активности путем обработки Р-пропиолактоном (БПЛ), что дает более надежные результаты, чем добавление трис-буфера, формалина, метиленового синего или прогревание.
Как известно, в 60-х гг. XX в. БПЛ широко использовали в качестве средства дезинфекции, что было обусловлено бактерицидными, спороцидны-ми, вирулицидными и фунгицидными свойствами и сохранением активности как при положительной, так и при отрицательной температурах [1, 6, 7]. Вместе с тем не обнаружено данных о бактерицидной активности БПЛ в отношении чумного микроба и других возбудителей особо опасных инфекций.
Цель настоящей работы состояла в оценке бактерицидного действия БПЛ на чумной микроб и выяснении влияния данного способа обеззараживания на результаты серологических исследований.
Материалы и методы
В экспериментах использовали вакцинный штамм Yersinia pestis ЕВ линии НИИЭГ из коллекции Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб». Культивирование проводили на агаре LB при 28 и 37 °С в течение 2 сут, взвеси культур (109 КОЕ/мл) готовили на стерильном 0,9 % растворе NaCl.
Для обеззараживания взвесей использовали БПЛ, синтезированный ООО «Даймонд Тим» (Москва) и любезно предоставленный для проведения исследований. В пробы со взвесями чумного мик-
роба вносили БПЛ до конечной концентрации 0,1, 0,05, 0,025, 0,01, 0,001 %. Контролем служили взвеси чумного микроба без добавления БПЛ. Материал помещали в холодильник при 4 °С. Экспозиция составляла 3, 6, 24, 48, 96 ч. Из каждой пробирки делали высев на плотные (агар ЬБ) и жидкие (бульон LB) питательные среды [8] и выдерживали их при 28 °С в течение 5 сут, ежедневно просматривая посевы. Эксперимент повторяли 3 раза.
Влияние способа обеззараживания материала на чувствительность и специфичность иммунологических реакций оценивали на примере ИФА микробных взвесей Y. pestis штамма ЕУ. Культуру выращивали на агаре ЬБ в течение 24 и 48 ч при температуре 28 и 37 °С соответственно. Взвеси микроорганизмов готовили в стерильном 0,9 % растворе №С1 в концентрациях 109—103 КОЕ/мл. Обеззараживание проводили добавлением проверенного на бактерицидное действие водного нейтрального раствора формалина до конечной концентрации в пробе 4 % с последующей экспозицией при комнатной температуре 1 ч [2] и внесением БПЛ до конечной концентрации в пробе 0,1 % с последующей экспозицией при 4 °С в течение 18 ч [3].
Постановку ИФА осуществляли с помощью тест-систем иммуноферментных моноклональных для идентификации капсульного антигена Ф1 чумного микроба (Алматы) в соответствии с инструкцией по применению.
Результаты и обсуждение
В результате просмотра объектов с посевами было зарегистрировано:
из проб после 3-часовой экспозиции: через 1 сут - отсутствие специфического роста в бульоне и на агаре при высеве из проб с 0,1 % БПЛ, и характерный для чумного микроба рост при высеве из проб с 0,01 и 0,001 % бПЛ; через 2-5 сут - рост чумного микроба на агаровых пластинках и в бульоне при высеве из всех проб (табл. 1);
из проб после 24-часовой экспозиции: отсутствие в течение всего срока наблюдения характерного роста в материале, обработанном 0,1 и 0,05 % БПЛ; отсутствие роста в течение 1 -х суток и наличие на 2-5-е сутки из проб с 0,025 % БПЛ; а также характерный рост на агаре и в бульоне в течение всего
Таблица 1
Результаты обработки Р-пропиолактоном взвесей Y. pestis EB
Экс- по- зиция, ч Концентрация БПЛ, %
0,1 0,05 0,025 0,01 0,001 Положительный контроль
3 4* Не оце- Не оце- 1* 1* 1*
нивали нивали
б Нет роста 2* 1* Не оце- Не оце- 1*
нивали нивали
24 " Нет роста 2* 1* 1* 1*
48 " " 4* Не оце- Не оце- 1*
нивали нивали
9б " Не оце- Не оце- 2* 1* 1*
нивали нивали
* Появление роста на средах, сут.
срока наблюдения для материала, контактировавшего с 0,01 и 0,001 % БПЛ;
из проб после 48-часовой экспозиции: с 0,1 и 0,05 % БПЛ отсутствие роста чумного микроба, с 0,025 % БПЛ специфический рост обнаруживали на 4-е и 5-е сутки;
из проб после 96-часовой экспозиции: отсутствие в течение всего срока наблюдения характерного роста в образцах, контактировавших с 0,1 % БПЛ, рост чумного микроба на плотных и жидких питательных средах через 2 сут в посевах из материала, обработанного 0,01 % БПЛ, и в течение всего срока наблюдения после применения 0,001 % БПЛ.
Полученные различия в эффективности обработки образцов 0,1 и 0,01 % БПЛ определили необходимость детализации эксперимента путем использования 6-часовой экспозиции, а также 0,05 и 0,025 % БПЛ. В результате контроля стерильности обнаружено, что использование 0,1 % БПЛ приводило к отсутствию роста чумного микроба в течение всего срока наблюдения; после воздействия 0,05 % БПЛ специфический рост обнаруживали на 2-е сутки наблюдения, а 0,025 % БПЛ характерный рост наблюдали, начиная с 1 -х суток.
При исследовании методом ИФА взвесей Y. pestis, выращенных при 37 °С и обработанных 4 % раствором формалина, положительные результаты были зафиксированы в пробах с концентрацией 109-105 КОЕ/мл. В образцах с концентрацией микробных клеток 104 КОЕ/мл отмечены сомнительные результаты, а в образцах с концентрацией 103 КОЕ/мл фракция I не выявлена. Аналогичные результаты получены при тестировании микробных взвесей, обработанных БПЛ (табл. 2). При исследовании образцов, содержащих микробные клетки, выращенные при температуре 28 °С и обработанные как формалином, так и БПЛ, были получены отрицательные результаты, что обусловлено отсутствием синтеза фракции I чумного микроба.
Предложен способ обработки взвесей чумного микроба для постановки иммуноферментного анализа. Показано, что БПЛ оказывает обеззараживающее действие на культуру вакцинного штамма чумного микроба при температуре 4 °С в конечных концентрациях 0,1 % при экспозиции 6 и более часов и 0,05 % при экспозиции не менее 24 ч, что в полной мере согласуется с методикой инактивации инфекционной активности вирусов, рекомендующей использование БПЛ в конечной концентрации 0,05-0,1 % [3]. Вместе с тем препарат в концентрациях 0,025, 0,01, 0,001 % при добавлении к бактери-
Таблица 2
Влияние способа обеззараживания материала на результаты ИФА
109 + +
1Q8 + +
107 + +
1Q 6 + +
10 5 + +
104 +/- +/-
1Q3 - -
* Y. pestis культивировали при 37 °С.
альной взвеси не оказывал подобного эффекта независимо от экспозиции. В ходе изучения влияния способа обеззараживания материала на чувствительность и специфичность ИФА продемонстрировано, что обработка образцов БПЛ не снижает названные показатели, т.е. не отражается на качестве иммунологического анализа.
Таким образом, полученные в ходе первого этапа исследования положительные результаты по обеззараживанию взвесей чумного микроба и предлагаемые в методических рекомендациях [3] методы инактивации инфекционной активности вирусов позволяют сделать предположение о возможности использования БПЛ при обеззараживании взвесей вирулентных культур чумного микроба, выращенных при различных температурных режимах, а также суспензий органов зараженных вирулентными штаммами чумного микроба лабораторных животных. Ответ на это предположение может быть получен в ходе второго этапа работы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бажинов А.Г., Каморский Н.М. // ЖМЭИ. -1960. - № 7. - С. 26-30. - 2. Безопасность работ с микроорганизмами 1-11 групп патогенности (опасности). Санитарные правила. СП 1.3.1285-03. // Бюл. норм. и метод. докум. Госсанэпиднадзора. - 2003. - № 3 (13). - С. 77-78. - 3. Выявление циркуляции арбовирусов. Методы вирусологических и серологических исследований, клинико-эпидемиологические характеристики малоизученных арбовирусных инфекций, подходы к мониторингу природных очагов арбовирусов: Метод. рекомендации // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Вирусология. -1991. - Т. 25. - С. 30-34. - 4. Ефременко В.И., Ломов Ю.М., Онищенко Г.Г. и др. // Вестн. РАМН. - 2002. -№ 10. - С. 34-39. - 5. Журавлев В.И. Эпидемиологические и экологические аспекты циркуляции арбовирусов на территории Астраханской области: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 2002. - 6. Иоффе И.С., Осипян В.Т. // Военномедицинский журн. - 1961. - № 6. - С. 52-53. - 7. Краткая химическая энциклопедия. - М.: Сов. энциклопедия, 1965. -Т. 4. - С. 358. - 8. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике. - М.: Мир, 1976. - 436 с. - 9. Онищенко Г.Г. // Эпидемиология и инф. бол. - 2000. - № 4. - С. 4-8. - 10. Попов Н.В., Рогаткин А.К., Козлова Т.А. и др. Цикличность эпизоотий чумы в регионе Северного и Северо-Западного Прикаспия и факторы, ее определяющие. - Астрахань, 1999. -
11. Резолюция Межведомственного совещ. по пробл. санитарно-эпидемиологической охраны территории Российской Федерации (Волгоград, 15 сентября 2005) // Пробл. особо опасных инф. - 2005. - Вып. 2 (90). - С. 72-77.
T.A.Maliukova, E.M.Golovko, T.A.Kostiukova, S.A.Shcherbakova, E.A.Plotnikova, M.N.Lyapin
Preparation of Specimens Selected in Conjugated Plague and Arbovirus Infectious Foci for Serologic Investigations. Communication 1
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov
A method is offered to treat Y. pestis vaccine strain suspensions with P-propiolactone (BPL) which was shown to produce decontamination effects at +4 °C and final concentrations of 0.1 % or 0.05 % after >6 hours' and > 24 hours’ exposure intervals, respectively. Studying the influence of these decontamination techniques on the sensitivity and specificity of IFA tests did not reveal any changes in these characteristics as a result of treatment of bacterial samples with BPL, thus demonstrating no negative effect upon the quality of the immunologic analyses.
Key words: Yersinia pestis, arboviruses, decontamination, P-propio-lactone, IFA.
Поступила 27.03.07.
Концентрация Y. pestis*, м.к./мл
0,1 % БПЛ
4 % раствор формалина
