CC BY
13
данные по биоразнообразию вибрионов, их генетике, эпидемиологии, экологии и различным прикладным аспектам, а также наметить дальнейшие наиболее перспективные направления исследований. Была отмечена высокая пластичность геномов Vibrio и высокая скорость адаптации вибрионов к условиям внешней среды. Исследования вибрионов с применением современных молекулярно-биологических и компьютерных технологий обеспечат в дальнейшем лучшее понимание особенностей биологии этой большой и важной группы морских бактерий.
Работа поддержана грантом РФФИ № 05-0448727.
список ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bartlett D. // Materials of second conference on the biology of vibrios «Vibrio 2007» Paris, 28 Nov. - 1 Dec. 2007, Absr. Book, Institut Pasteur, Centre d'information Scientific. - Paris, 2007. - P. 6. - 2. Cervino J.M., Lorence E.A., Thompson
F.L. et al. // Там же. - P. 34. - 3. Dziejman M., Serutto D., Tam V.S. et al. // PNAS. - 2005. - Vol. 102, N 9. - P. 34653470. - 4. Gonzalez-Escalona N., Martinez-Urtaza J., Romero J. et al. // Materials of second conference on the biology of vibrios «Vibrio 2007» Paris, 28 Nov. - 1 Dec. 2007, Absr. Book, Institut Pasteur, Centre d'information Scientific. - Paris, 2007. -P. 7. - 5. Hammer B.K., Bassier B.L. // Там же. - P. 14. -
6. Hjerde E., Lorentzen M.S., Holden M.T.G. et al. // Там же. - P. 13. - 7. Iida T. // Там же. - P. 10. - 8. Kashi Y. // Там же. - P. 8. - 9. Kim Y.R., Lee S.E., Kook H.E. et al. // Там же. - P. 29. - 10. Mazel D. // Там же. - P. 17. - 11. Nair
G.B., Bhuiyam N.A., Nusrin S. et al. // Там же. - P. 26. -12. Nakhamchik A, Wilde K., Rowe-Magnus D.A. // Там же. - P. 20. - 13. Oliver J.O. Bogard R., Warner E. et al. // Там же. - P. 30. - 14. Rosenberg E., Zilber-Rosenberg I. // Там же. - P. 32. - 15. Saeed A., Abd H., Edvinsson B. et al. // Там же. - P. 22. - 16. Thompson F.L., Sawabe T., Thompson C.C. et al. // Там же. - P. 4. - 17. Ussery D.W. // Там же. - P 3. -18. Val M.-E., Barre F.-X. // Там же. - P. 12. - 19. Yamaichi Y., Fogel M.A., Waldor M.K. // Там же. - P. 11.
G. A.Yeroshenko
Main Trends of the Up-to-Date Research of Cholera Vibrios Biology
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe", Saratov
The review presents the data covered during the Second International Conference on the Biology of Vibrios “Vibrio 2007” (Paris, from November, 28th to December, 1st, 2007). Set forth are main trends of state-of-the-art vibrios research concerning their biodiversity, the peculiarities of genome arrangement, pathogenicity, epidemiology and ecology.
Key words: Vibrios, biodiversity, genome arrangement, pathogenicity, epidemiology, ecology.
Поступила 26.02.08.
УДК 616.981.452+576.858:616-097
Т.А.Малюкова, Т.А.Костюкова, Е.М.Головко, М.Н.Ляпин, С.А.Щербакова, Е.А.Плотникова,
Е.В.Найденова
подготовка материала, отобранного в сопряженных очагах чумы и арбовирусных инфекций, к проведению иммунологического исследования. Сообщение 2
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Представлены результаты второго этапа исследований по использованию Р-пропиолактона для обеззараживания возбудителя чумы. Показано, что препарат в концентрации 0,1 % при экспозиции 18-24 ч в условиях холодильника, а также не менее 6 ч при температуре 37 °С обеззараживает Yersinia pestis 231 как во взвесях, так и в суспензиях из внутренних органов. Предложены оптимальные режимы подготовки материала, отобранного в сопряженных очагах чумы и арбовирусных инфекций, к проведению иммунологического исследования.
Ключевые слова: Yersinia pestis, арбовирусы, обеззараживание, Р-пропиолактон, ИФА.
При проведении иммунологических исследований материал подвергают предварительной обработке с целью обеззараживания. При подозрении на наличие возбудителя чумы используют формалин
[1], для инактивации арбовирусов - Р-пропиолактон (БПЛ) [2]. Отсутствие регламентированных способов инактивации образцов, одновременно содержащих чумной микроб и арбовирусы, и наличие реальных сопряженных природных очагов данных инфекций определяют актуальность поиска единого способа обеззараживания.
Полученные в ходе первого этапа исследований [3] положительные результаты обеззараживания взвесей из культур вакцинного штамма чумного
микроба с помощью 0,1 % БПЛ (конечная концентрация в пробе) при температуре 4 °С и экспозиции 6 ч позволили сделать предположение о возможности использования препарата для обработки взвесей вирулентных культур чумного микроба, а также суспензий из органов зараженных ими лабораторных животных.
Известно, что для инактивации инфекционной активности арбовирусов с помощью 0,05-0,1 % БПЛ (конечная концентрация в пробе) рекомендовано два режима: при 37 °С в течение 8-10 ч и при 4 °С в течение 96 ч [2]. Способ обработки в заданных режимах обеспечивает надежность инактивации и высокую чувствительность серологических реакций, прово-
димых с подготовленными пробами.
Цель настоящего исследования состояла в разработке оптимального режима обеззараживания ß-пропиолактоном взвесей из культур вирулентного штамма чумного микроба и суспензий из органов лабораторных животных, павших от чумной инфекции, а также выяснение влияния его на эффективность диагностического исследования проб из сопряженных очагов чумы и арбовирусных инфекций (модельные эксперименты).
Для постановки иммуноферментного анализа (ИФА) использовали тест-систему иммунофермент-ную моноклональную для идентификации капсульного антигена F1 чумного микроба (Ставрополь) и тест-систему для выявления антигенов вируса ККГЛ (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, Москва). Анализ проводили в соответствии с инструкциями по применению.
Результаты и обсуждение
Материалы и методы
Эксперименты проводили с использованием эталонного вирулентного штамма Yersinia pestis 231 из коллекции Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб». Штаммы культивировали на агаре LB при 28 и 37 °C. Из агаровых культур, выращенных при 37 °С в течение 2 сут, готовили взвеси концентрацией 109 м.к./мл. Для заражения лабораторных животных (белых мышей) использовали взвеси из культур штамма Y pestis 231, выращенных при 28 оС в течение 2 сут. Биопробных животных заражали подкожно в дозе 500 м.к. в 0,2 мл 0,85 % NaCl, рН 7,2. После гибели животных вскрывали, внутренние органы (печень, селезенка, легкие, кровь) методом отпечатков высевали на пластинки агара LB и использовали для приготовления суспензии в 0,85 % NaCl, рН 7,2. Жидкую фазу отбирали, разливали в равных количествах по пробиркам, доводили объем до 5 мл с помощью 0,85 % NaCl, рН 7,2.
Пробы для модельного эксперимента содержали суспензии из внутренних органов биопробных животных, приготовленных описанным выше способом, и суспензии из клещей, собранных на территориях, эндемичных по Крымской-Конго геморрагической лихорадке (ККГЛ), в которых были выявлены специфические антигены. Для сравнения использовали аналогичные пробы, инактивированные 2 % раствором формалина. Клещей от 1-5 до 10-20 (в зависимости от упитанности, вида, места сбора) помещали в стерильные ступки, растирали, заливали 0,85 % NaCl, рН 7,2. Отбирали жидкую фазу и добавляли в равных количествах к суспензиям из внутренних органов.
Взвеси и суспензии обрабатывали БПЛ, синтезированным ООО «Даймонд Тим» (Москва) и любезно предоставленным для проведения исследований.
В подготовленные пробы вносили цельный БПЛ до конечной концентрации в пробе 0,1 или 0,05 % , выдерживали 18 и 24 ч в условиях холодильника или 1, 3, 6, 8 и 24 ч в условиях термостата (37 °С). Контролем служили аналогичные суспензии и взвеси из культуры штамма Y pestis 231, но без добавления БПЛ. эффективность инактивации оценивали в соответствии с действующими нормативно-методическими документами [4]. Образцы проверяли на специфическую стерильность посевами на плотные и жидкие питательные среды и заражением лабораторных животных. Эксперименты повторяли 3 раза.
Первоначально изучали инактивирующее действие БПЛ на взвеси из культуры штамма Y pestis 231, выращенной при 37 °С. Предположили, что капсула, образующаяся у чумного микроба в подобных условиях, может препятствовать инактивирующему действию БПЛ. В результате экспериментов установили, что после 1- и 3-часовой экспозиций с БПЛ рост чумного микроба на плотных и жидких питательных средах появлялся на 2-е сутки. После 6-, 8- и 18-часовой экспозиций получены специфически стерильные образцы (табл. 1). Следовательно, БПЛ полностью инактивировал клетки Y pestis 231. Для подтверждения полученных результатов и приближения условий лабораторных исследований к полевым были проведены эксперименты по инактивации суспензий из внутренних органов белых мышей, зараженных Y pestis 231. На плотных и в жидких питательных средах с посевами материала, прошедшего 3-часовую обработку 0,1 % БПЛ, через 2 сут отмечен специфический рост. Увеличение экспозиции до 6, 8 и 24 ч привело к гибели клеток чумного микроба в суспензиях, о чем свидетельствовало отсутствие специфического роста на питательных средах на
Таблица 1
Оценка эффективности инактивации при 37 °С р-пропиолактоном взвесей Y. pestis 231 и суспензий органов белых мышей, зараженных Y. pestis 231
Kонцентрация БПЛ
Q,1 % Q %
зиция, ч Посев на питательные среды Посев внутренних органов биопроб Посев на питательные среды
Взвеси Y pestis 231 (109 м.к./мл)
І 2* 2*
З З* 2*
б Нет роста 2*
S Нет роста 2*
1S Нет роста 2*
З
б
S
24
Суспензии органов белых мышей, зараженных Y. pestis 231 (105 м.к./мл)
2* 1* 2*
Нет роста Нет роста 2*
нет роста нет роста 2*
Нет роста Нет роста 2*
* Время (в сутках) появления роста на средах.
Таблица 2
Влияние способа обеззараживания материала на результаты ИФЛ
Материал
Kонцентрация Y. pestis 231 (м.к./мл) в образцах
109 10S 107 10б 105 104 103
ß-пропиолактон в конечной концентрации 0,1%
Взвеси из культуры Y. pestis 231 +
Пробы из внутренних органов грызунов, содержащие Y. pestis 231 +
Пробы в модельных экспериментах
Результаты исследований с тест-системами для выявления
F1 Y. pestis +
антигенов KKO +
Отрицательный контроль (взвеси из Y. pestis 2З1, выращенные при 2S OC ) -
2% р-р формалина
Взвеси из культуры Y. pestis 231 +
Пробы из внутренних органов грызунов, содержащие Y. pestis 231 +
Пробы в модельных экспериментах
Результаты исследований с тест-системами для выявления
F1 Y. pestis 231 +
антигенов KKO +
Отрицательный контроль (взвеси из Y. pestis 231, выращенные при 2S °C ) -
+/-
+/-
+/-
+
+/-
+/-
+/-
+
протяжении срока наблюдения. Оставались стерильными также пластины агара с отпечатками органов биопробных белых мышей, зараженных инактивированным материалом и забитых на 6-е сутки после заражения. Полученные результаты дают основание считать, что БПЛ в концентрации 0,1 % при температуре 37 °С и экспозиции не менее 6 ч вызывает гибель клеток чумного микроба в суспензиях из органов биопробных животных. Таким образом, режим инактивации материала, содержащего арбовирусы
[2], оптимален для обеззараживания взвесей чумного микроба и суспензий из внутренних органов зараженных ими грызунов. Присутствие в пробе дополнительных компонентов (белков, липидов, ли-пополисахаридов и др.) не снижает эффективности инактивации. Следовательно, данный режим может быть использован для обеззараживания проб из сопряженных очагов чумы и арбовирусных инфекций.
Существенным моментом выбора способа подготовки проб к проведению серологического исследования является сохранение чувствительности и специфичности иммунологических реакций. для оценки влияния БПЛ на данные показатели проводили постановку ИФА с инактивированными БПЛ взвесями У pestis 231, суспензиями из внутренних органов биопробных животных, а также с пробами, одновременно содержащими суспензии из внутренних органов биопробных животных и клещей, в которых ранее были выявлены антигены вируса ккгЛ. результаты постановки ИФА, отраженные в табл. 2, свидетельствуют о диагностической точности иммунологической реакции для обнаружения У pestis по наличию антигена FI и вируса ККГЛ по наличию специфических антигенов.
Следующим этапом стало изучение инактиви-
рующего действия БПЛ при пониженных температурах (в условиях холодильника) на взвеси У pestis 231 и суспензии из внутренних органов лабораторных животных, павших от чумы. Показано, что после обработки проб БПЛ в конченой концентрации 0,05 % в течение 18 ч рост чумного микроба отмечен на питательных средах на 2-е сутки, биопробные животные погибали на 4-е. При увеличении экспозиции до 24 ч получали обеззараженные образцы. Полной инактивации У pestis 231 добивались при обработке БПЛ в концентрации 0,1 % как в течение 18, так и 24 ч (табл. 3).
Таким образом, экспериментально подтверждено, что БПЛ в конечной концентрации 0,1 % при экспозиции 18-24 ч в условиях холодильника, а также экспозиции не менее 6 ч при температуре 37 °С обеззараживает У. pestis 231 как во взвесях, так и в суспензиях из внутренних органов. Полученные результаты не выходят за рамки условий инактивации БПЛ арбовирусов. Модельные эксперименты показа-
Таблица З
Оценка эффективности инактивации р-пропиолактоном в условиях холодильника суспензий из органов белых мышей, зараженных Y pestis 231 (105 м.к./мл)
Экспозиция, ч Kонцентрация БПЛ
Q,1 % Q,Q5 % Q %
Посев на питательные среды Посев внутренних органов биопроб Посев на питательные среды Посев внутренних органов биопроб Посев на питательные среды
18 Нет роста Нет роста 3* 4* 2*
24 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста 2*
* Время (в сутках) появления роста на средах.
4З
ли, что использование данного препарата не снижает качества иммунологических реакций для детекции чумного микроба и арбовирусов. ^едовательно, применение БПЛ может быть рекомендовано как способ подготовки для иммунологических исследований проб из сопряженных очагов чумы и арбови-русных инфекций. При этом оптимальными режимами являются обеззараживание Q,1 % БПЛ (конечная концентрация в пробе по объему) в течение S-1Q ч при 37 OC и в течение 96 ч при 4 OC. ^особ применим для проб малых объемов (микролитры). Можно предположить, что данный способ будет эффективен также в отношении субстратов гнезд птиц и млекопитающих, погадок хищных птиц, а также материала от больных людей, или лиц с подозрением на заболевание. Предварительная подготовка повышает уровень безопасности работы персонала с материалом, содержащим одновременно возбудителей чумы и ар-бовирусных инфекций, сохраняя ценность проб для лабораторной диагностики.
Представленные в статье результаты оформлены в виде заявки о выдаче патента на изобретение ^пособ подготовки проб для серологических исследований из сопряженных очагов чумы и арбо-вирусных инфекций» № 2QQ612S696 (приоритет Q7.QS.2QQ6 г.).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Безопасность работ с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). Санитарные правила. СП 1.3.128503. // Бюлл. норм. и метод. док. Госсанэпиднадзора. - 2003. -№ 3 (13). - С. 77-78. - 2. Выявление циркуляции арбовирусов. Методы вирусологических и серологических исследований, клинико-эпидемиологические характеристики малоизученных арбовирусных инфекций, подходы к мониторингу природных очагов арбовирусов: Метод. рекомендации // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Вирусология. - 1991. - Т. 25. - С. 30-34. -
3. Малюкова Т.А., Головко Е.М., Костюкова Т.А. и др. // Пробл. особо опасных инф. - 2007. - Вып. 2 (94). - С. 64-66. -
4. Инструкция по контролю специфической стерильности экспериментальных препаратов, приготовленных из культур чумного или холерного микробов. - Саратов, 1982. - 8 с.
T.A.Maliukova, T.A.Kostiukova, E.M.Golovko, M.N.Lyapin, S.A.Shcherbakova, E.A.Plotnikova, E.V.Naidenova
Preparation of the Materials, Sampled in Combined Foci of Plague and Arbovirus Infections, for Immunologic Assaying.
Communication 2
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe", Saratov
The results of the second phase of the experiments are presented in the paper, where B-propiolactone was used to decontaminate materials from Yersinia pestis. Both slurries and suspensions of the internal organs were decontaminated of Y. pestis 231 with 0.1 % concentrations of the preparation after 18 to 24 hours’ exposition in the refrigerator, as well as at 37 °C for as long as 6 hours or more. Optimal schedules for immunologic examination are offered to prepare the samples taken in the combined foci of plague and arboviral infections.
Key words: Yersinia pestis, arboviruses, decontamination, B-propiolac-tone, ELISA.
Поступила 30.11.06.
yK 616.9S1.51:616-Q97
Н.Е.Терешкина, З.Л.Девдариани
современное состояние проблемы иммунодетекции возбудителя сибирской язвы
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Авторами представлен анализ отечественной и зарубежной литературы последних лет, посвященной вопросам иммунодиагностики сибирской язвы. Дана краткая характеристика основных достижений в области разработки методов обнаружения Bacillus anthracis и его антигенов с помощью различных иммунодиагностических тестов. Обсуждаются наиболее важные проблемы, связанные с повышением эффективности современных иммунодиаг-ностикумов и их внедрением в практику.
Ключевые слова: Bacillus anthracis, иммунодиагностика, поликлональные антитела, моноклональные антитела, иммунодиагностические препараты.
Сибирская язва - особо опасное инфекционное заболевание, поражающее животных и человека, этиологическим фактором которого является Bacillus anthracis. Особенности биологии сибиреязвенного микроба, обеспечивающие длительное сохранение его в почве с формированием стойких очагов, обусловливая высокий эпизоотический и эпидемический потенциал возбудителя, отсутствие типичных клинических проявлений при генерализованной (септической) форме болезни, а также высокая вероятность использования B. anthracis в качестве бактериологического оружия предопределяют актуальность исследований, направленных на совершенствование диагностики сибире-
язвенной инфекции [9, 18, 19, 20, 22, 34].
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в этой области, создание новых быстрых и достоверных способов детекции сибиреязвенного микроба и его спор в объектах внешней среды и материале от больного остается приоритетной задачей. Бактериологическое исследование, оставаясь «золотым стандартом» диагностики любых бактериальных инфекций, в том числе сибирской язвы, требует значительных временных затрат (до трех суток) [8, 14, 16, 18, 19].
Практическое применение активно разрабатываемых в настоящее время генодиагностических
