CC BY
35
ПЕРСПЕКТИВА КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ КСЕНОГЕННЫХ
ТИРОЦИТОВ
З.С. КАИТОВА
Кафедра оперативной хирургии и клинической анатомии , 117198, ул. Миклухо-Маклая,
д. 8. Медицинский факультет
Разработан принципиально новый метод культивирования клеток щитовидной железы- ротационный, технический легко выполнимый и обеспечивающий получение качественной культуры за короткий промежуток времени (3-4 дня).
Несмотря на достижения современной эндокринологии, проблема борьбы с послеоперационным гипотиреозом по-прежнему остается весьма актуальной.
Заместительная терапия с использованием современного арсенала гормональных средств имеет ряд существенных недостатков, связанных с трудностью поддержания стойкого гомеостаза адекватными дозами соответствующих препаратов, а также с частыми побочными явлениями и осложнениями при их длительном применении.
В последнее время активно изучаются трансплантационные методы: алло- или ксено-генная пересадка клеток щитовидной железы.
Одним из основных условий успешного приживления трансплантатов является сходство доноров и реципиентов по антигенам главного комплекса гистосовместимости. Это условие соблюдается при аллогенной трансплантации, особенно, при пересадке клеток эндокринных желез плодов человека поздних сроков развития [ 1,5], обладающих значительным терапевтическим потенциалом, быстрой пролиферацией роста, адаптацией к новым условиям и легкостью образования связей с тканями реципиента [6].
Применение эмбрионального материала связано с этическими, юридическими и медицинскими проблемами. В поздний эмбриональный период аллогенный донорский материал может быть получен только в результате прерывания беременности больших сроков по медицинским или социальным показаниям. Прерывание беременности по медицинским показаниям эндокринные и нейроэндокринные органы плода не могут быть использованы для пересадки. Прерывание беременности поздних сроков по социальным показаниям проводится крайне редко, что удлиняет время ожидания материала.
При неправильном подборе возраста эмбриональной эндокринной ткани для пересадки в клетках трансплантата могут произойти неконтролируемые процессы. Так, Маь 1ашТ. е1 а1. (1993), пересадив недифференцированные яичники кенгуру под кожу сумки самцу кенгуру, обнаружили изменение гонадного пола: все зародышевые клетки исчезли, и яичники содержали семявыносящие канальцы.
Возможно поэтому многие авторы предлагают использовать в качестве трансплантационного материала аутохтонную ткань щитовидной железы. Удаленную во время операции ткань щитовидной железы после тщательного макроскопического и цитологического исследования измельчают на кусочки объемом от 0,12 до 1,0 см и массой до 5-6 гр. и полученные фрагменты вводят между волокнами мышц шеи [2]. Однако данная методика не лишена своих противников, утверждающих, что визуально и цитологически неизмененная аутохтонная ткань щитовидной железы после пересадки в привычные условия (в тот же организм) обязательно подвергнется патологическим процессам.
Весьма перспективной сегодня считается трансплантация ткани эндокринных органов новорожденных поросят [3, 4]. Это послужило тому, что предметом нашего исследования было изучение морфофункциональных свойств тироцитов новорожденных поросят в условиях культивирования ротационным способом с целью определения возможности их применения в клинике.
Материал и методы
Сотрудниками кафедры оперативной хирургии и клинической анатомии Российского университета дружбы народов разработан принципиально новый метод культивирова-
ния клеток эндокринных органов (Кирпатовский И. Д и др., 1997), ротационный, обеспечивающий получение культуры гормонсекретирующих клеток за довольно короткий промежуток времени и не требующий больших технологических затрат.
Источником культуры служили щитовидные железы однодневных поросят. Выделенные железы помещали в солевой раствор Симмса и отмывали от сгустков крови. Острым лезвием ткань измельчали на фрагменты диаметром до 0,8 - 1,0 мм, промывали раствором Хенкса с антибиотиками и несколько раз раствором МСИ без антибиотиков. Отмытые кусочки еще раз измельчали до диаметра 0,1 мм и полученные микрофрагменты щитовидной железы пастеровской пипеткой переносили в специальные флаконы, заполненные ростовой средой. Флаконы помещали в горизонтальном положении в ми-ни-роллерную установку в термостат при температуре 34°С и культивировали в течение 7 суток, производя замену ростовой среды на 50 % каждые 24 часа культивирования.
Ежедневно световой микроскопией изучали гистологические изменения в культуре, а в сливах среды радиоиммунологическим методом определяли концентрацию гормонов.
Ростовая среда для культивирования состояла из 70% минимальной среды Игла, 10% сыворотки крупного рогатого скота, 20% сбалансированного солевого раствора Симмса, 10 % глюкозы, 0,2 ЕМ/мл инсулина и 10-12 М органического буфера Нерез.
Результаты и их обсуждение
Результаты гистологического исследования показали, что при культивировании тироцитов клеточный состав культуры в существенно не меняется и он представлен практически всеми типами клеток, характерными для нативного материала.
На 2-е сутки культивирования утратившая большую часть стромы железистая ткань щитовидной железы состоит из тироцитов, единичных фолликулов и их фрагментов. Начиная с 3-х суток, гистологическая картина меняется (рис.1). Размер фолликулов и образующих их тироцитов варьирует.
В небольших вновь формирующихся фолликулах без коллоида эпителий однослойный призматический. В больших фолликулах - тироциты приобретают кубическую форму с шаровидными ядрами. Встречаются также единичные фибробластоидные элементы. На 5-е сутки культивирования основная масса фолликулов образована тироцита-ми кубической формы (рис. 2), хотя встречаются сильно растянутые фолликулы с плоскими тироцитами. В этих клетках ядра гиперхромные, мелкие и вытянутые пара-лелльно поверхности фолликулов. Каких-либо грубых структурных деформаций и некроза тироцитов в течение всего периода культивирования не наблюдалось.
Результаты гормональных исследований показали, что на 3-е сутки культивировния происходит увеличение концентрации гормонов в ростовой среде и в последующем отмечается их снижение (табл.1). Так, уровень тироксина в питательной среде на третьи сутки поднимался до 21,5 Л/то// т1, а к пятым суткам падал до 14,5 ЫтоО т1. Такие же изменения наблюдались и с концентрацией других гормонов.
Таблица 1
Содержание тиреоидных гормонов в питательной среде (п=8)
Сроки культивирования : 1 Г ормоны i i Изолированное Культивирование 1
2-е сутки Тироксин (Nmol/ ml) Тртодткронин(Ито1/т1) 1 19,5 + 0,1 ' 0,16 + 0,02
3-и сутки Т ироксин(Л7ио// ml) \ ; Трийодтиронин{Nmol/ml) ] 21,5 + 0,1 0,2 + 0,002
5-е сутки Тироксин (Nmol/ml) | Трийодтиронин (Nmol/ml) '■ 14,5 + 0,1 : 0,1 +0,002 |
Рис 1. Трехсуточная культура щитовидной железы неонатальных поросят. Ротационный метод культивирования
Рис.2 Пятисуточная культура щитовидной железы неонатальных поросят. Ротационный метод культивирования
Сравнительным критерием оценки влияния процесса культивирования на функциональную активность тироцитов в искусственных условиях служили не абсолютные показатели концентрации гормонов в суммарных баллах, а тенденция их изменения.
Оказалось, что при культивировании тироцитов данным способом максимальная концентрация гормонов в ростовой среде наблюдается на 3-и сутки культивирования, а затем происходит снижение гормонсекретирующей активности. Однако содержание гормонов в питательной среде может увеличиваться не только за счет их секреции, но и за счет выхода гормонов в среду в результате гибели эндокриноцитов.
Исходя из этого, и сопоставив гистологическую картину с цифрами концентрации гормонов, можно предположить, что при данном методе культивирования клетки не подвергаются «стрессовым» факторам, а снижение содержания гормонов в среде вероятнее всего соответствует функциональной активности и жизнеспособности тироцитов in vitro.
В то же время хорошо известно, что для поддержания оптимальной жизнедеятельности клеток щитовидной железы важным является наличие в культуре различных тирео-идных стимуляторов, оказывающих позитивное влияние на все процессы в данной ткани.
Итак, разработанный нами ротационный метод культивирования эндокринных клеток можно использовать как один из методов создания «биофизиологических» сред для тироцитов с целью изучения их жизнеспособности и функциональной активности в условиях in vitro под воздействием тех или иных реагентов.
Выводы:
1. Ротационный метод культивирования тироцитов технически легко выполним и обеспечивает получение культуры с минимальным повреждением гормонсекретирую-щих клеток.
2. Максимальный выход гормонов в питательную среду отмечается на 3-и сутки культивирования.
3. Культура тироцитов, полученная ротационным способом, не только переживает в условиях культивирования, но и растет, активно секретируя гормоны в ростовую среду.
4. С целью коррекции послеоперационных гипотиреоидных состояний возможна пересадка 3 суточной ротационной культуры ксеногенных неонатальных тироцитов.
Литература:
1. Веникова Е.А.. Турчин И С. //Пробл. эндокрин,-1991.-№34.-07-19
2. Павловский М П. и d/j.//Вести. Хир.-1990.-№10.-С.29-31.
3. Потиха О.П., Турчин И.С. и др. //Физиол. журнал-1990. -№ 4. -С.80-84.
4. Комиссаренко И.В.. Тронько Н.Д. и др. // Врач. Дело- 1985.- № 12.-С. 77-79.
5. Finsen В., Sorensen Т., GonzahB. el al. //Restor Neurol., Neurosci.-1991.- №2.-P. 271-282.
6. Smith ML. //Cleveland Clin. J.Med.-1990-v.57.-№3.-P.251-254.
C1INICAL APPLICATION OUTLOOK OF CULTURED XENOGEN TYROCITES Z.S. KA1TOVA
Departament of operative surgery clinical anatomy RPFU, 117198, st. M-Maklya, h.8,
Medical faculty
Fundamentaly new method of lliyrocites culturing was worked out. This method called rational is techically easy to appey and provides for obtaining of high guality culture within a short period of time.
