CC BY
98
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК ЭНДОКРИННЫХ ОРГАНОВ З.С. КАИТОВА
Кафедра оперативной хирургии и клинической анатомии РУДН. 117198, Москва, ул.
Миклухо-Маклая, д.8, медицинский факультет
Разработан ротационный метод культивирования клеток эндокринных органов. Проведен сравнительный анализ изолированной и сочетанной культуры эндокриноцитов.
К настоящему времени накоплен многолетний научный опыт по культивированию клеток и тканей эндокринных органов. Особую роль для развития методов культивирования сыграла необходимость лечения больных сахарным диабетом. Практически на поджелудочной железе, как модели гормонпродуцирующего органа, можно проследить исторический путь развития методов выделения, обработки и культивирования эндокринных клеток [1,2,3,4].
Выделить гормонпродуцирующие клетки можно ферментной обработкой либо кол-лагеназой [5,6,7], либо коллалитином [8]. Иногда проводят комбинированную обработку эндокринной ткани растворами коллагеназы и трипсина [8,9], после чего тканевую взвесь центрифугируют [10], либо сразу помещают в ростовую среду.
Можно также получить культуру без использования ферментных препаратов. В таких случаях эндокринную ткань подвергают механическому измельчению и полученную клеточную смесь переносят в питательную среду [11]. Некоторые авторы предлагают выделять клетки с помощью центрифугирования в градиенте плотности Фиколла и Пер-колла или в градиенте плотности метризамида [12].
Обычно культивирование осуществляется в чашках Петри, хотя отдельные авторы предлагают выращивать культуру эндокринных органов на искусственных капиллярах, перфузируемых ростовой средой, либо на поверхности положительно заряженных дек-страновых бус, взвешенных в среде, либо в пластиковых микроцилиндрах с тонкой сеткой [10,12]. Однако, следует отметить, что применение изоляции эндокринных клеток для получения культур представляется кропотливым и весьма малопродуктивным методом.
Таким образом, в зависимости от способа обработки эндокринной ткани и условий ее выращивания получают либо цитотипические, либо органотипические культуры. Способ выращивания монослойных цитотипических культур позволяет получить высо-коочишенные гормональноактивные клетки, хотя в процессе культивирования происходит значительная потеря этих клеток. В связи с этим стали разрабатываться методы получения гормосекретирующих культур, не требующие тщательного очищения исходного материала. Такими условиями представляются методы органного культивирования. В качестве источника органотипических культур используется, как правило, ткань эмбриональных эндокринных органов, так как она содержит значительно большую долю эндокринных клеток по сравнению с постнатальной и обладает более высокой способностью к пролиферации [13,14]. В то же время выявлено, что при длительном выращивании органных культур происходит гибель клеток в результате дефицита кислорода в центральной части эксплантата. Как выход из этой ситуации было предложено уменьшить размеры эксплантатов и увеличить в небольших концентрациях содержание кислорода в газовой фазе, или же проводить культивирование в роллерных установках [4,7]. С целью улучшения функциональной активности и роста культуры в ростовую среду также рекомендуют добавлять 10-20% сыворотку крупного рогатого скота, инсулина в относительно высокой концентрации (5-20 мкг/мл) и стероидных гормонов.
Особую роль при культивировании тканей играет наличие твердого субстрата или «твердой опоры». Наиболее часто применяемым для этой цели материалом является полистирол, хотя также можно использовать поликарбон, тефлон, полиэтилен и другие
[4,11]. Кроме того, с целью улучшения прикрепления культивируемых клеток к субстрату рекомендуют различные биоматриксы: поли-Д-лизин, коллаген, фиброкинетин.
Однако, несмотря на многолетний экспериментальный опыт по культивированию, все вышеперечисленные методы не лишены недостатков. Метод получения монослой-ных цитотипических культур эндокринных клеток включает в себя многоэтапную обработку исходного материала на центрифуге, магнитном размешивателе, что приводит к уменьшению выхода необходимых клеток. Органотипическая культура эндокринных органов характеризуется небольшой продолжительностью жизни и в дальнейшем подвергается некротическим изменениям. Исходя из вышеизложенного, поиски в разработке новых методов культивирования ткани и клеток эндокринных органов не потеряли свою актуальность на сегодняшний день.
Нами разработан принципиально новый метод выращивания клеток нейроэндокринных органов - ротационный, технически простой и обеспечивающий получение культуры гормональноактивных клеток за короткий промежуток времени. За основу метода был взят способ получения культур эмбриональных нервных клеток мозга в рол-лерной установке [4].
Техника культивирования.
Проведено 105 экспериментов. Источником культуры служили нейроэндокринные органы (гипоталамус, гипофиз, щитовидная железа, надпочечники и гонады) взрослых и неонатальных животных: быков, крыс и однодневных поросят.
Выделенные эндокринные органы помещали в солевой раствор Симмса, отмывали от сгустков крови. Острым лезвием ткань измельчали на фрагменты диаметром до 0,8-1,0 мм, промывали раствором Хенкса с антибиотиками, затем несколько раз раствором МСИ без антибиотиков. Отмытые кусочки еще раз измельчали до диаметра 0,1 мм, и полученные микрофрагменты пастеровской пипеткой переносили в специальные флаконы, заполненные ростовой средой. Флаконы помещали в горизонтальном положении в мини-роллерную установку в термостат при температуре 30-36°С. Температурные показатели подбирались в зависимости от вида эндокринной ткани. Максимальный срок культивирования - 7 суток. Ежедневно с помощью световой микроскопии изучали гистологические изменения в культуре, а в сливах среды радиоиммунологическим методом определяли концентрацию гормонов.
Обсуждение результатов.
Клетки аденогипофиза взрослых крыс хорошо переживают в культуре в течение 24-48 часов. Начиная с 3-х суток, происходит гибель аденоцитов, клетки уменьшаются в размерах, ядра их становятся гиперхромными. К 5-7 суткам появляются довольно обширные очаги центральных некрозов, а клетки с нормохромными ядрами сохраняются практически только на периферии микрофрагментов. Гормональные исследования таких культур показали нарастание концентрации ЛГ, ФСГ и пролактина в среде на 3-и сутки культивирования, а затем наблюдалось ее снижение (табл.1). Более того, в 5 суточной культуре взрослой ткани аденогипофиза не был обнаружен ФСГ в питательной среде, возможно, к этому сроку клетки, секретирующие данный гормон, погибли.
Таблица 1.
Гормональный состав культуры аденогипофиза взрослых крыс. Ротационный
метод культивирования.
ГОРМОНЫ СРОКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
1 сут. 3 сут. 5 сут. 7 сут.
ЛГ(ЮЛ) 12,5+0,2 15,4±0,2 4,0±0,2 0
ФСГ(ШИ) 10,0+0,2 11,5±0,2 0 0
Пропактин(МшИ) 57,8+0,5 89,9+0,5 80,1+0,5 59,8±0,5
Аналогичным колебаниям подверглось морфологическое состояние клеток других эндокринных органов(щитовидная железа, надпочечники и гонады), выделенных у взрослых животных.
Совершенно иная гистологическая картина была прослежена на протяжении всего периода наблюдения при культивировании клеток эндокринных органов неонатального срока развития.
Например, при культивировании неонатальной тестикулярной ткани, начиная со 2-х суток, интерстициальные эндокриноциты (клетки Лейдига) образовывали большие скопления в межканальцевых пространствах. Вокруг микрофрагмента происходило формирование отграничительного слоя из вновь появившихся клеток. К 5-м суткам встречались клетки Лейдига как в стадии митоза, так и в стадии распада, хотя обширных очагов некроза клеток, характерных для взрослой ткани, не наблюдалось. Содержание тестостерона (табл. 2) в ростовой среде было прямо пропорционально функциональной активности интерстициальных эндокриноцитов в условиях культивирования, о чем свидетельствовали относительно высокие цифры данного гормона в течение первых 3-х суток культивирования и снижение этих цифр в дальнейшем.
Таблица 2
Концентрация тестостерона в культуре семенников неонатальных крыс. Ротационный метод культивирования.
ГОРМОН СРОКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
1 СУТ ЗСУТ 5 СУТ 7 СУТ
TECTOCTEPOH(ngfml) 1,5±0,2 4,4±0,2 2,1+0,2 1,0±0,2
Идентичные изменения морфологического состояния культуры клеток прослеживаются и при культивировании аденогипофиза неонатального возраста. При гистологическом изучении культивируемых клеток было обнаружено, что аденоциты, начиная с 3-х суток, располагаются, образуя трабекулы и розеткообразные соединения: клетки разных форм и размеров, с эксцентричным положением ядер, напоминая собой аденогипофиз in situ.
К 3-м суткам культивирования в микрофрагменте ткани аденогипофиза как 7-дневных крысят, так и однодневных поросят встречаются аденоциты в стадии деления. Вокруг микрофрагмента в обоих случаях происходит формирование отграничительного слоя из вновь образованных клеток, располагающихся в один ряд, плотно примыкающих друг к другу и напоминающих своим расположением «частокол». К 5-м суткам микрофрагменты представлены клетками средних и мелких размеров с гиперхромными ядрами. Количество аденоцитов в состоянии митоза уменьшается, и к 7-м суткам наблюдения появляются участки с разрушенными межклеточными связями.
О том, что в процессе культивирования происходит гибель одних и рост других клеток аденогипофиза, достаточно подробно описано в работе Peilon Francoise (1974). Она культивировала аденогипофизы неонатальных крыс в течение 7 дней при постоянной концентрации кислорода и углекислого газа. Автор приводит таблицу клеточного состава культуры и отмечает, что по сравнению с нативным аденогипофизом в клетках культур происходят значительные изменения, которые порой трудно идентифицировать.
По результатам наших исследований можно предположить, что дольше всех культивируются пролактин - секретирующие клетки, так как в питательной среде уровень про-лактина достаточно высок в течение всего периода культивирования по сравнению с другими определяемыми нами гормонами (табл. 3). Тот факт, что к 7-м суткам культивирования наблюдается снижение гормонов в ростовой среде и увеличение эндокринных клеток в стадии распада, можно объяснить тем, что к 7-м суткам культура «стареет».
Обычно неонатальный период для крыс длится до 14 дней после рождения, а мы использовали крыс 7- дневного возраста. Эндокринные органы (гипофиз, щитовидная железа и гонады) раннего неонатального возраста при культивировании в течение 7 дней
взрослеют, дифференцируются и превращаются во взрослую эндокринную ткань. Видимо, то же самое происходит в процессе культивирования и с эндокринными органами
Таблица 3.
Гормональный состав культуры неонатального аденогипофиза крыс. Ротационный метод культивирования
ГОРМОНЫ СРОКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
1 сут 3 сут 5 сут 7 сут
ЛГ(Ш/Ь) 12,0±0,2 14,0±0,2 10,0±0,2 0,5+0,2
ФСГ(Ш/Ь) 7,0±0,2 8,5±0,2 3,2±0,2 2,0±0,2
Пролактин (тШ/Ь) 40,0±0,5 52,0±0,5 48,0±0,5 25,0±0,5
однодневных поросят, так как морфологическое состояние и гормональные показатели были идентичными. Логично предположить, что если бы в эксперименте были использованы эндокринные органы эмбрионального возраста, то такая культура проходила бы более длительный этап созревания до взрослой ткани. Однако, мы должны помнить о том, что эндокринные клетки эмбрионального возраста отличаются от взрослых клеток и нет уверенности в том, что они созреют до соответствующего взрослого типа, не подвергаясь мутационным процессам.
Сопоставив наши результаты по культивированию эндокринных клеток и многочисленные факторы, подтверждающие наличие тесной взаимосвязи ядер гипоталамуса и гипофиза с другими эндокринными органами, мы провели дополнительную серию экспериментов по сочетанному культивированию клеток функционально взаимосвязанных нейроэндокринных органов (гипоталамо-гипофизарно-гонадный комплекс). Источником культуры служили только неонатальные животные. Культивирование проводили ротационным способом, соблюдая все параметры данного метода.
Сравнительный анализ результатов сочетанного и изолированного культивирования эндокринных клеток показал преимущество первого варианта. При гистологическом изучении культуральных эндокринных клеток явных различий в процессах изменения клеточного состава как в изолированной, так и сочетанной культуре в первые трое суток культивирования мы не наблюдали. Однако в 5-7- суточных сочетанных культурах определялись клетки в стадии митоза, что в большинстве случаев нехарактерно для изолированной культуры. Гормональные исследования сочетанных культур также подтвердили мнение о стимулирующем влиянии гипоталамо-гипофизарного комплекса на функциональную активность гормонпродуцирующих клеток эндокринных органов- мишеней: во всех сроках наблюдения концентрация гормонов в питательной среде при сочетанном культивировании была намного выше, чем при изолированном культивировании тех или иных эндокринных клеток. Общим для изолированного и сочетанного культивирования является то, что максимальный пик концентрации всех гормонов в ростовой среде приходится на 3-и сутки культивирования.
ВЫВОДЫ:
1. Ротационный метод культивирования обеспечивает получение высококачественной культуры эндокринных клеток в сравнительно короткие сроки(3-4 дня), с максимальным содержанием гормонов в питательной среде.
2. Ротационный метод позволяет культивировать эндокринные органы разной биологической принадлежности и качество культивированных клеток зависит только от «возраста» эндокринного органа.
3. При сочетанном культивировании функционально взаимосвязанных нейроэндокринных клеток содержание всех гормонов в питательной среде во все сроки опре-
деления намного выше, чем при изолированном культивировании тех или иных эндокринных клеток.
Литература
1. Бабичев В.Н., Сидиева Л.Н., Самсонова В.М. //Побл. эндокрин., М.-1978.-Т.24.-№1.-С.88-91
2. Басмаджан М.Е., Кирпатовский И.Д., Геворкян В.И.ИАвтор, свидел., М.-1987.
3. Бойко Н.И.//Авторефат. канд. дис., М.,1991.
4. Викторов И.В., Лыжин А.А., Шашкова Н.А. //Блюл, эксперимен. биологии и мед.,1985.-С.632-633.
5. Жарков В.П., Баранов В. И. //Тез. докл., К.,1987.-С. 131-132.
6. Скапецкий Н.И. //Автореф. канд. дис., М.,1987.
7. Турчин И.С. //Автреф. докт. дне., К.,1975.
8. Andersson A et а/.//Acte endocrin., 1976, 82.-S.-2038.
9. Agen A el al.llActe endocrinol., 1978, S.-88. -P.82.
10. Conn P.M. et al.llEndocrin., 1977. V-101. -P. 637-642.
11. Chick W.L. et alJI Endocrin., 1975. - V.96.-P. 637-643.
12. Sutherland D.E.A., Matas A.Jet alJIWorld J Surg., 1977.-V.1-P.185-195.
13. Kerr IB. et aU/Ce 11 tissue Res., 1985. -V.239. -P.408-415.
14. Ikegami T et al.ll Cell struct, and function, 1976.-P.291-297.
15. Peilon Francoise etal./IC. Acad. Sci., 1974. -D.278. -P.75-78
ENDOCRINACITES CULTURING Z.S. KAITOVA
Departament of operative surgery clinical anatomy RPFU. 117198, st. M-Maklya, h.8,
Medical faculty
The rotational method of endocrinacites culturing is developed. The comparative analysis of isolated and joint endocrinacites culturing is made.
