CC BY
18
© Яремчук О. З.
УДК 612.015.11-02:616-005.6]-092.9 Яремчук О. З.
ПАТОБ1ОХ1М1ЧН1 МЕХАН1ЗМИ УРАЖЕННЯ НИРОК ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ АНТИФОСФОЛ1П1ДНОМУ СИНДРОМ1
ДВНЗ «Тернопшьський державний медичний ушверситет iM. I. Я. Горбачевського MiHicTepcTBa охорони здоров'я УкраГни» (м. Тернопшь)
Дане дослiдження виконано в рамках комплексно! науково-дослщно! роботи кафедри фармакологи з ключною фармаколопею ДВНЗ «Тернопiльський державний медичний уыверситет iм. I. Я. Горбачевського МОЗ Укра!ни» «Встановлення ефективностi препара^в метаболiчного типу дИ та ентеросорбцп при патологiчних станах рiзноI етюлоги» (№ державно! реестрацiI 0113и001246).
Вступ. Антифосфолiпiдний синдром (АФС) - ав-тоiмунне захворювання, що характеризуемся на-явнiстю в кровi антитт до негативно заряджених фосфолiпiдiв мембран та зв'язаних з ними глко-проте!ыв (бета-2-глiкопротеIну-1, анексину V про-тромбiну). АФС супроводжуеться тромбозом судин рiзного розмiру i локалiзацiI, серцево-судинною патологiею, iнсультом, ускладненнями ваптност [15,16,18,19,5].
За даними дослiджень останнього десятил^тя, нирки е одним iз основних органiв-мiшеней при всiх кл^чних формах АФС (первинному, вторин-ному, катастрофiчному). Частота ураження нирок становить 25-68% при первинному i вторинному АФС, також зростае ктьюсть хворих з ознаками по-шкодження мiкроциркуляторного русла нирок при цiй патологи [8,16].
Вщомо, що оксидативний стрес е важливим моментом патогенезу АФС, в тому чи^ при системному червоному вовчаку [18]. Також доведено, що оксидативний стрес при системному червоному вовчаку i виникаючм нирковм недостатностi е по-казником високо! активностi процесу [20].
Активы форми кисню (АФК), як беруть участь у патогенезi АФС, мають виражений токсичний i пря-мий пошкоджуючий вплив [15]. Вщомо, що у результат окисно-вщновних реакцiй в органiзмi постмно проходить генерацiя активних форм кисню (АФК: О2, ОН-, ЯО2, ОН2, Н2О2 та iн.), якi вщграють важливу роль у багатьох фiзiологiчних i бiохiмiчних процесах: регуляцп тонусу судин, клмтиннм пролiферацi!, син-тезi простагландинiв, передачi сигналiв вiд мiжкJli-тинних сигнальних молекул на регуляторы системи, як контролюють експресiю геыв [1]. При оксида-тивному стрес вiдбуваеться зниження рiвня АТФ, п-перпродукцiя АФК - супероксидних, пероксидних та гщропероксидних радикалiв, оксиду азоту (N0) [20]. Пошкоджуючм дм АФК протисто!ть антиоксидантна система, яка попереджуе утворення, забезпечуе зв'язування та модифка^ю вiльних радикалiв, руй-
нування пероксищв, екранування функцiональних груп бшюв i iнших молекул [18,1].
Незважаючи на iснування ряду наукових до-слщжень, присвячених вивченню значення окси-дативного стресу у механiзмах розвитку АФС [15,16,18,19,20,21], його роль у патобiохiмiчних ме-ханiзмах ураження нирок при цм патологiI, залиша-еться недостатньо з'ясованою.
Мета дослiдження - дослщити стан окремих показникiв прооксиданто-антиоксидантно! системи та тканинного дихання у нирках при експеримен-тальному антифосфолтщному синдромi.
Об'ект i методи дослщження. Дослiдження проводили на мишах лiнiI BALB/с, яких утримували на стандартному рацюы вiварiю. Експерименти проводили вщповщно до «Загальних етичних принцитв експериментiв на тваринах», ухвалених на Першому Нацiональному конгресi з бюетики (Ки!в, 2000) та узгоджених з положеннями «бвропейсько! конвенцiI про захист хребетних тварин, що використовуються для дослщних та iнших наукових цтей» (Страсбург, 1986). АФС моделювали за допомогою кардюло-ну (Sigma, США), який вводили внутршньом'язово, чотири рази (30 мкг на 1 ш'екщю, промiжки мiж iн'eкцiями становили 14 дiб) [12]. Для пiдвищення ефективност iмунноI вiдповiдi кардiолiпiн емульгу-вали в 75 мкл повного ад'юванту Фрейнда (перша iн'eкцiя), наступнi ш'екци проводили з неповним ад'ювантом Фрейнда. АФС формувався через 2 тижн пюля останньо! iн'eкцiI кардiолiпiну.
^ддослщних тварин роздiлили на 2 групи: 1-ша -iнтактнi; 2-га - мишм з АФС. Через 10 дiб з моменту пiдтвердження АФС по 10 тварин кожно! групи в умо-вах тiопентал-натрieвого наркозу виводили з екс-перименту. Для дослщження використовували 10% гомогенати нирок. Ниркову тканину охолоджували у середови!^ видiлення, яке мiстило 0,25 М сахарози, 1 мМ ЕДТА та 10 мМ трис-НС1-буфер (рН 7,4) [7].
Активнють супероксиддисмутази (СОД, КФ 1.15.1.1) визначали за ступенем зниження вщнов-лення ытротетразолт синього у присутност НАДН2 i феназинметасульфату [13]. Активнють каталази (КАТ, КФ 1.11.1.6) визначали згщно методу [11], фк-суючи змiну оптично! щiльностi в результат реакцiI пероксиду водню з молiбдатом амонiю. Вмiст вщ-новленого глутатюну (G-SH) визначали за здатнютю його вiльних SH-груп взаeмодiяти з 5,5п-дитю-бю-2-нiтробензойною кислотою з утворенням тюытрофе-
н1льного анюну, к1льк1сть якого прямопропорц1ина вм1сту G-SH [17]. Р1вень продукт1в вшьнорадикаль-ного окиснення лтщв визначали за вмютом гщро-пероксид1в л1п1д1в (ГПЛ) [4], (фунтуеться на здат-ност1 екстрагованих гептанчзопропшовою сум1шшю ГПЛ 1нтенсивно поглинати св1тло при довжин1 хвил1 ^=232 нм) та ТБК-активних продукт1в (ТБК-АП) [2] (визначали в реакци з 2-тюбарб!туровою кислотою). Стан енергозабезпечувальних процеЫв м1тохондр1И досл1джували за активн1стю сукцинатдегщрогенази (СДГ, КФ 1.3.99.1) та цитохромоксидази (ЦХО, КФ 1.9.3.1). Активн1сть СДГ визначали за вщновленням ферриц1ан1ду кал1ю до ферроц1ан1ду кал1ю сукцина-том пщ д1ею СДГ [6]. Принцип методу визначення ЦХО фунтуеться на здатност1 останньоУ окиснювати диметил-пара-фен1лендиам1н i а-нафтол з утворен-ням ¡ндофенолового синього [9].
Статистичну обробку даних здмснювали за до-помогою програми STATISTICA 10. Пор1вняння отриманих величин проводили з використанням и-критер1ю Манна-У1тн1. Зм1ни вважали достов1рни-ми при p<0,05.
Результати дослiдження та Ух обговорення. У результат! проведених дослщжень встановлено змши вм1сту продукт1в лтщноУ пероксидаци у нир-ках мишей л1н1У BALB/с за умов АФС. Так, вмют ГПЛ зростав на 27%, ТБК-АП - на 57%, вщносно контролю (рис.).
За даними л1тератури, ¡нтенсифкащя вшьно-радикального окиснення поеднуеться 1з зм1нами антирадикального захисту, що проявляеться диско-ординац1ею в систем! прооксиданти-антиоксиданти [1]. У наших дослщах активн!сть СОД у нирках при АФС зростала на 23%, пор!вняно ¡з показниками ¡н-тактних тварин. Отриман1 результати узгоджуються 1з даними C. Perez-Sanchez та ствавт. [18]. В той же час вщбувалось зниження активност1 КАТ на 13% (рис.). Встановлено також ви-снаження пулу G-SH у нирках, кшькють якого зменшувалась на 14%, пор1вняно з контрольною групою. G-SH бере без-посередню участь у знешко-джены вшьних радикал1в та ix токсичних продуючв, а також у вщновленш сульфгщрильних груп ензим!в [3]. На початкових етапах оксидативного стресу збшьшення АФК, зокрема, супероксидного анюн-радикалу, може ¡ндукувати зростання ак-тивност1 СОД, яка знешкоджуе останшй. Водночас персисту-юча активащя даного патоло-г1чного процесу призводить до виснаження резерв1в анти-оксидантноУ системи [18], що у
наших дослщах пщтверджувалось зменшенням ак-тивност1 КАТ та вмюту О-БИ.
В1домо, що при активаци процес1в переокис-нення мембранних лтщв, в тому числ1, знижуеться енергозабезпечення кл1тин внасл1док роз'еднання транспорту електрошв I окисного фосфорилюван-ня в м1тохондр1ях та розвитку Тх дисфункци [18]. У результат! наших досл1джень при АФС виявлено порушення функц1онування м1тохондр1й, про що свщчило зменшення активност1 СДГ I ЦХО вщносно контролю. Зниження активност1 ЦХО у м1тохондр1-ях нирок при АФС, яке спостер1гаеться, може бути пов'язане з порушенням надходження електрошв вщ субстратно! ланки дихального ланцюга через ци-тохроми Ь-с. Встановлеш зм1ни активност1 ензим1в дихального ланцюга свщчать про пригн1чення функ-ци м1тохондр1й, що може супроводжуватись знижен-ням вм1сту макроерг1чних сполук [10], та негативно позначаеться на переб1гу б1ох1м1чних процес1в у нир-ках при АФС.
Висновки. За умов експериментального анти-фосфолтщного синдрому у тканин1 нирок мишей вщбуваеться активац1я оксидативного стресу, порушення р1вноваги у систем! прооксиданти-антиокси-данти, що супроводжуеться накопиченням продукт1в в1льнорадикального окиснення, дискоординац1ею активност1 та вмюту компонент1в антиоксидантного захисту та електронно-транспортного ланцюга м1то-хондр1й.
Перспективи подальших дослiджень. Зважа-ючи на те, що у патогенез! ураження нирок при ан-тифосфол!п!дному синдром! ключову роль в!д!грае активац!я оксидативного стресу, в подальшому пла-нуеться з'ясувати доцшьнють пошуку способ!в ко-рекц1У ц1е! патолог!! серед речовин з антиоксидант-ними властивостями.
%
■ контроль Н АФС
ГПЛ ТБК-АП СОД КАТ G-SH
Рис. Показники системи прооксиданти-антиоксиданти у мишей BALB/c за умов антифосфолтщного синдрому (n= 10). Прим1тка. * - достов1рн1сть р1зниц1 вщносно показниюв групи 1нтактних тварин.
Л^ература
1. Дктивн1 форми кисню та !х роль у метабол1зм1 кл1тин / М. I. Кол1сник, Г. В. Колюник, 6. Н1дзюлка [та ш.] // Б1олог1я тварин. -
2009. - № 1-2, Т. 11. - С. 59-70.
2. Андреева Л. И. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой / Л. И. Андрее-
ва, Л. А. Кожемякин, А. А. Кишкун // Лаб. дело. - 1988. - № 11. - С. 41-43.
3. Антиоксидантна система захисту органiзму (огляд) / I. Ф. Белешчев, Е. Л. Левицький, Ю. I. Губський [та ¡н.] // Соврем. пробл.
токсикол. - 2002. - № 2. - С. 14-23.
4. Гаврилов В. Б. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови / В. Б. Гаври-
лов, М. И. Мишкорудная // Лаб. дело. - 1983. - № 3. - С. 33-35.
5. Горницкая О. В. Антифосфолипидный синдром / О. В. Горницкая // Експериментальна та клЫчна фЫолопя та бюхЫя. -
2008. - № 1(4). - С. - 61-70.
6. Ещенко Н. Д. Определение количества янтарной кислоты и активности сукцинатдегидрогеназы / Н. Д. Ещенко, Г. Г. Воль-
ский // Методы биохимических исследований. - Л.: Изд-во Ленинградского университета, 1982. - С. 207-210.
7. Камышников В. С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике / В. С. Камышни-
ков - М.: МЕДпресс-информ, 2004. - 920 с.
8. Козловская Н. Л. Сосудистое поражение почек при антифосфолипидном синдроме (Обзор литературы) / Н. Л. Козловская //
Нефрология и диализ.- 2006. - Т.8, № 3. - С. 206-216.
9. Кривченкова Р. С. Определение активности цитохромоксидазы в суспензии митохондрий // Современные методы в био-
химии / Р. С. Кривченкова Под ред. В. Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 47-49.
10. Лукьянова Л. Д. Молекулярные механизмы тканевой гипоксии и адаптация организма / Л. Д. Лукьянова // ФЫолопчний журнал. - 2003. - Т. 49, № 3. - С. 17-35.
11. Метод определения активности каталазы / М. А. Королюк, Л. И. Иванова, И. Г. Майорова [та ¡н.] // Лаб. дело. - 1988. -№ 1. - С. 16-19.
12. Морфолопчний стан матки та плаценти при експериментальному моделюванш гестацмного антифосфолодного синдрому на мишах / Зайченко Г. В., Лар'яновська Ю. Б., Деева Т. В. [та ¡н.] // УкраУнський медичний альманах. - 2011. - Т. 14 , № 4. - С. 136-141.
13. Чевари С. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах клетки и метод определения её в биологических материалах / С. Чевари, И. Чаба, И. Секей // Лаб. дело. - 1985. - № 11. - С. 678-681.
14. Analisis of nitrate, nitrite and [15N] nitrate in biological fluids / I. C. Green, A. W. Davie, J. Golawski [et al.] // Anal. biochem. -1982. - Vol. 126, № 1. - Р. 131-138.
15. Antiphospholipid antibodies are associated with enhanced oxidative stress, decreased plasma nitric oxide and paraoxonase activity in an experimental mouse model / J. Delgado Alves, L. J. Mason, P. R. J. Ames [et al.] // Rheumatology. - 2005. - Vol. 44. - P. 12381244.
16. "Black swan in the kidney": Renal involvement in the antiphospholipid antibody syndrome / C. M. Nzerue, K. Hewan-Lowe, S. Pierangeli [et al.] // Kidney International. - 2002. - Vol. 62. - P. 733-744.
17. Ellman G. L. Tissue sulfhydryl groups / G. L. Ellman // Arch. Biochem. Biophys. - 1959. - Vol. 82. - Р. 70-77.
18. Mitochondrial dysfunction in antiphospholipid syndrome: implications in the pathogenesis of the disease and effects of coenzyme Q10 treatment / C. Perez-Sanchez, P. Ruiz-Limon, M. Angeles Aguirre [et al.] // Blood. - 2012. - Vol. 119, № 24. - P. 5859-5870.
19. Giannakopoulos B. The pathogenesis of the antiphospholipid syndrome / B. Giannakopoulos, S. A. Krilis // The New England Journal of Medicine. - 2013. - Vol. 368. - Р. 1033-1044.
20. Oxidative stress and human health / T. Rahman, I. Hosen, M. M. T. Islam [et al.] // Advances in Bioscience and Biotechnology. -2012. - Vol. 3. - P. 997-1019.
21. Rand J. H. Molecular pathogenesis of the antiphospholipid syndrome / J. H. Rand // Circulation Research. - 2002. - Vol. 90. -Р. 29-37.
УДК 612.015.11-02:616-005.6]-092.9
ПАТОБЮХ1М1ЧН1 МЕХАН1ЗМИ УРАЖЕННЯ НИРОК ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ АНТИФОСФОЛ1-П1ДНОМУ СИНДРОМ1
Яремчук О. З.
Резюме. При експериментальному антифосфолтщному синдромi вiдмiчено зростання вмюту про-дукпв втьнорадикального окиснення в нирках, зокрема, збтьшення концентраци гiдропероксидiв лтщв i ТБК-активних продукпв, що супроводжуеться дискоордина^ею активной антиоксидантних фермен^в (супероксиддисмутази i каталази) i виснаженням пулу О-БИ в нирках мишей лЫп ВА1_В/с. Також встановле-но порушення функцюнування мтохондрм, що проявляеться зниженням активной сукцинатдегщрогенази i цитохромоксидази. Встановлен змши свщчать, що при експериментальному антифосфолтщному синдро-мi вщбуваеться ураження нирок, що проявляеться актива^ею оксидативного стресу, порушенням рiвноваги прооксидантно-антиоксидантно! системи i електронно-транспортно! системи.
Ключовi слова: експериментальний антифосфолтщний синдром, нирки, оксидативний стрес, антиоксидантна система.
УДК 612.015.11-02:616-005.6]-092.9
ПАТОБИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ПОРАЖЕНИЯ ПОЧЕК ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АНТИ-ФОСФОЛИПИДНОМ СИНДРОМЕ
Яремчук О. З.
Резюме. При экспериментальном антифосфолипидном синдроме отмечено возрастание содержания продуктов свободнорадикального окисления в почках, в частности, увеличение концентрации гидроперекисей липидов и ТБК-активных продуктов, что сопровождается дискоординацией активности антиок-сидантных ферментов супероксиддисмутазы и каталазы и истощением пула О-БИ в почках мышей линии ВА_В/с. Также установлено нарушение функционирования митохондрий, что проявляется снижением активности сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы. Зарегистрированные изменения свидетельствуют, что при экспериментальном антифосфолипидном синдроме происходит поражение почек, что проявляется
активацией оксидативного стресса, нарушением равновесия в прооксидантно-антиоксидантной и мито-хондриальной электронно-транспортной системах.
Ключевые слова: экспериментальный антифосфолипидный синдром, почки, оксидативный стресс, антиоксидантная система.
UDC 612.015.11-02:616-005.6]-092.9
PATHOBIOCHEMICAL MECHANISMS OF KIDNEY DAMAGE IN EXPERIMENTAL ANTIPHOSPHOLIPID SYNDROME
Yaremchuk О. Z.
Abstract. Antiphospholipid syndrome is a topical multidisciplinary issue of current medicine. Antiphospholipid syndrome is followed by thrombosis of different size and location, cardiovascular disorders, stroke. Antiphospholipid syndrome is one of the main causes of habitual miscarriage. We know that kidneys are the main target organs for all clinical antiphospholipid syndrome types (primary, secondary, catastrophic). Oxidative stress is directly involved in antiphospholipid syndrome pathogenesis. Despite the number of researches on oxidative stress in antiphospholipid syndrome pathogenesis, the state of kidney prooxidatn-antioxidant system in this pathology is still studied insufficiently.
To study the state of specific findings of prooxidant-antioxidant system and kidney mitochondria electron-transport chain in experimental antiphospholipid syndrome was the aim of the research.
The study was carried out on BALB/c mice kept on a standard vivarium diet. Test animals were divided into 2 groups: in the 1st there were intact ones; in the 2nd there were mice with APS. APS was simulated with cardiolipin administered intramuscularly four times (30 mcg per 1 injection, injections in every 14 days). To increase the immune response, cardiolipin was emulsified in 75 mcl of complete Freund's adjuvant (first injection), the other injections were of incomplete adjuvant. APS was developed in 2 weeks after the last cardiolipin injection. Control group animals were administered identical volume injections of sodium chloride intraperitoneally. In 10 days after the APS confirmation 10 animals of each group were removed from the experiment. Kidney homogenates were used for this research.
The activity of antioxidant enzymes (superoxide dismutase and catalase) and reduces glutathione content were determined. The level of lipid peroxidation was defined by the content of lipid hydroperoxides and Thiobarbituric Acid Reactive Substances. Energy generating processes in mitochondria were studied by succinate dehydrogenase and cytochrome oxidase activity.
As a result of our research, lipid peroxidation products increase in the kidney antiphospholipid syndrome, lipid hydroperoxides and Thiobarbituric Acid Reactive Substances in particular, was found as compared to control group.
The decrease of antioxidant system activity and components content in BALB/c mice's kidneys with antiphospholipid syndrome was proven. Superoxide dismutase and catalase activity was decreased. Pool G-SH exhaustion also was present, its amount decreased as compared to the control group.
As a result of our research, mitochondria functioning disorders in antiphospholipid syndrome were discovered. Succinate dehydrogenase and cytochrome oxidase activity decrease as compared to control group was the evidence of it.
So, prooxidant-antioxidant system imbalance in BALB/c mice's kidney tissue with experimental antiphospholipid syndrome was found. It is followed by accumulation of free radical oxidation products, decrease of antioxidant enzymes activity and mitochondrial respiratory chain.
These results evidence the expediency of prooxidant-antioxidant system disorders treatment search among antioxidant substances in cases of antiphospholipid syndrome.
Keywords: experimental antiphospholipid syndrome, kidneys, oxidative stress, antioxidant system.
Рецензент - проф. Непорада К. С.
Стаття надшшла 08.10.2015 р.
