CC BY-ND
8
42
ЗНиСО
лпрель IM (277)
УДК 579.843.1:577.15:577.1
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА АКТИВНОСТЬ ^АЦЕТИЛ-р-О-ГЛЮКОЗАМИНИДАЗЫ У ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ
О.В. Дуванова, Б.Н., Мишанькин, В.М. Сорокин, С.В. Титова
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону, Россия
Выявлено увеличение активности №ацетил-@^-глюкозаминидазы при понижении температуры культивирования у штаммов Vibrio cholerae eltor O1- и О139-серогрупп, изолированных из воды, что позволило предположить участие этого фермента в выживаемости/сохраняемости холерных вибрионов во внешней среде в условиях контакта с хитинсодержащими объектами. Обнаружено литическое действие N-ацетил-в-D-глюкозаминидазы на гетерологичные микроорганизмы, что позволило рассматривать его как фермент, наделяющий холерные вибрионы конкурентными преимуществами при их циркуляции в разнообразных природных условиях. Ключевые слова: V. cholerae, N-ацетил-В^-глюкозаминидазная активность, 4-метилумбелли-ферил^-ацетил-/3-глюкозаминида (4-MUf. GlcNAc).
O.V. Duvanova, B.N. Mishan'kin, V.M. Sorokin, S.V.Titova □ INFLUENCE CULTIVATION TEMPERATURE ON THE ACTIVITY OF N-ACETYL-P-D-GLUCOSAMINIDASE OF VIBRIO CHOLERAE □ Rostov-on-Don Anti-Plague Scientific Research Institute of Rospotrebnadzor, Rostov-on-Don, Russia.
It is showed increase activity of N-acetyl-ft-D-glucosaminidase at low cultivate temperature strains Vibrio cholerae eltor O1 and O139 serogroups isolated from water, suggesting the involvement of this enzyme in the survival/persistence of V. cholerae in the environment in contact with the chitin-containing objects. The lytic action of N-acetyl-ft-D-glucosaminidase at heterologous microorganisms, allowed to consider it as an enzyme conferring a competitive advantage V. cholerae when circulating in various environmental conditions.
Key words: V. cholerae, N-acetyl-ft-D-glucosaminidase activity, 4-metilumbelliferyl-N-acetyl-p-D-glucosaminide.
Холерный вибрион уникален по своей способности вызывать мировые пандемии среди диареегенных патогенов бактериальной природы. Он может пребывать в воде как в планктонной форме, так и в агрегированном состоянии, прикрепленном к хитиновым поверхностям водных организмов или абиотическим частичкам хитина, что определяет их особую роль в сохранении и эволюции вибриона. Два стиля жизни - водное окружение и кишечник человека - составляют суть его жизненного цикла (lifestyle), что связано с высокой адаптационной пластичностью возбудителя, эволюционно выгодной для патогена. Интерес к выяснению механизмов, лежащих в основе персистенции, пластичности и реализации истинного биологического потенциала холерных вибрионов, с изучением роли бактериальных ферментов в этих процессах остается непреходящим. И хотя к началу XXI века уточнена биологическая функция многих бактериальных ферментов, ряд из них, включая N-ацетил-Р-О-глюкозаминида-зу (хитобиазу) (КФ 3.2.1.30) V. cholerae, изучены слабо. Согласно основанной на гомологии аминокислотных последовательностей классификации [3], N-ацетил-Р-В-глюкозаминидаза является гликозилгидролазой семейства 20 и относится к классу PR-3 (pathogenesis-related proteins) белков. Она отщепляет по экзо-типу крайне расположенные с невосстанавливающего конца остатки N-ацетилглюкозамина у образующихся из полимеров хитина под действием хитиназы (эндо-тип) высших олигосахаридов (GlcNAc)n>2,
а также атакует димерное звено хитобиозы (Р-01сКЛс1-401сКЛс) с последующим превращением ее в К-ацетилглюкозамин. Свободный К-ацетилглюкозамин утилизируется микробной клеткой через специфические фосфоенолпиру-ват-углевод-фосфотрансферазные системы с последующим деацилированием и дезаминирова-нием до ацетата, аммония и фруктозо-6-фосфа-та или прямого включения в биосинтез пепти-догликана клеточной стенки. Это обстоятельство может иметь важное физиологическое значение для представителей семейства УгЪггопа-сеае [4]. Учитывая факт существования у холерного вибриона мощного хитинолитического комплекса [2], включающего хитиназы, хитин-связывающие белки, хитопорины и др., а также роль этих компонентов в сохранении возбудителя в окружающей среде, представляется важным оценка активности К-ацетил-Р-О-глюкоза-минидазы у штаммов для выяснения ее значимости в экологии вибрионов.
Цель исследования - изучение влияния температуры культивирования на уровень активности К-ацетил-Р-О-глюкозаминидазы у штаммов У. ско1егае разных серогрупп, эпидемиологической значимости и выделенных из различных источников.
Материалы и методы. Использовали 6 штаммов У. ско1етае 01 классического (Сх+ 1:ср+) и эльтор биоваров (сх+ 1ср+; Дс1хД1ср) из различных источников. Кроме того, были изучены 12 штаммов У. ско1етае 0139 серогруппы, из которых 6 (сх+ 1ср+) были выделены из клини-
•Ш, IM (277)
ЗНиСО
43
^зс ческого материала, а 6 (ActxAtcp) - из проб во-г5— ды поверхностных водоемов, 12 штаммов ° V. cholerae nonO1/nonO139: 6 (ctx+ tcp+; Actx tcp+) - из клинического материала и 6 (ActxAtcp) - из органов рыб, выловленных в акватории Азовского моря. Все культуры получены из музея живых культур ФКУЗ «Ростов-ского-на-Дону НИПЧИ», где их хранили в лиофилизированном состоянии.
Анализ ферментативной активности проведен на флюоресцентном спектрофотометре Hitachi F-2500 (Япония) при эмиссии 495.0 и экстинкции 365.0 нм с использованием лицензионного программного обеспечения FL Solutions. Количество (мкг) образовавшегося 4-метилум-беллиферона в результате отщепления от субстрата находили по калибровочной кривой, которую строили с использованием коммерческого препарата 4-метилумбеллиферона (Aldrich). Активность выражали в мкг метилумбеллифе-рона/109м.к./мл/час, отщепленного от субстрата 4-метилумбеллиферил-Ы-ацетил-Р-глюкозами-нида (4-MUF. GlcNAc) клетками холерного вибриона за 1 час инкубации при 28 °С и 37 °С. Ошибка метода (коэффицент вариации) для вероятности 0,95 составила 11,2 %.
Антимикробное действие препарата N-аце-тил-Р-О-глюкозаминидазы, очищенного путем механического разрушения клеток вибрионов, ультрацентрифугирования лизатов при 105000g, концентрирования в системе Amicon с после -дующей колоночной хроматографией (сефадекс G-100 и фрактогель TSK DEAE-650), исследовали в отношении штаммов ряда гетероло-гичных микроорганизмов: Micrococcus luteus, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis EV, Escherihia coli HB101 и Escherihia coli QD5003. Для этого на поверхность чашек с агаром Хоттин-гера (рН 7,2) и эритрит-агаром наносили 109 м.к. по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасе-вича и после распределения культуры шпателем устанавливали металлические колодцы диаметром 5 мм, в которые вносили испытуемый образец в концентрации 0,05-0,7 мкг белка на пробу. Результаты учитывали на 2—3-и сутки роста при 37 °С. Белок определяли по Лоури.
Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием t-критерия Стьюдента [1].
Результаты и обсуждение. Установлено, что все штаммы холерных вибрионов обладали N-ацетил-Р-О-глюкозаминидазной активностью. Удалось не только обнаружить фермент, но и продемонстрировать вариабельность его уровня в зависимости от объекта выделения и набора детерминант вирулентности.
Найдено, что условия выращивания (температура) и индивидуальные особенности штамм-мов вибрионов влияли на величину активности фермента. Так, клетки штаммов V. cholerae O1 биовара эльтор и 0139 серогруппы (ActxAtcp) из объектов окружающей среды (вода поверх-
ностных водоемов), выращенные на агаре Мартена при 28 °С, обладали большей N-ацетил-Р-D-глюкозаминидазной активностью по сравнению с 37-градусными культурами. Для штаммов V. cholerae O1, выращенных при 28 °С, она составила в среднем 5,99 ± 0,65 мкг 4-метилум-беллиферона/109 м.к./мл/час и для штаммов V. cholerae О139 серогруппы - 7,76 ± 5,14 мкг 4-метилумбеллиферона/10 м.к./мл/час. В условиях культивирования при 37 °С ферментативная активность для эльтор вибрионов (ActxAtcp) составила в среднем 3,57 ± 0,92 мкг 4-метил-умбеллиферона/109м.к./мл/час и для штаммов V. cholerae O139 - 4,75 ± 2,73 мкг 4-метилум-беллиферона/109м.к./мл/час соответственно (при р = 0,05). Подобная тенденция отсутствовала у штаммов вибрионов классического биовара (ctx+ tcp+), активность которых составила в среднем 7,81 ± 0,92 при выращивании в условиях 28 °С и 8,92 ± 3,10 мкг 4-метилумбелли-ферона/109м.к./мл/час - при 37 °С, что указывает на большую экологическую пластичность штаммов V. cholerae O1 эльтор и 0139 серо-групп в условиях водного биоценоза. Небезин-тересно отметить, что для штаммов V. cholerae O139 (ctx+ tcp+) из клинического материала, выращенного в условиях 28 °С, выявлено увеличение ферментативной активности, что можно рассматривать как результат выработанного адаптационного механизма низкотемпературной регуляции метаболизма, направленного на реализацию стратегии выживания вибрионов в новых экологических условиях. Исключение составили штаммы Р-16072 (ctx+ tcp+) и Р-17781 (ActxAtcp), у которых отличий обнаружено не было, возможно, из-за индивидуальных особенностей штаммов. Не менее интересным объектом оказалась группа штаммов V. cholerae non O1/non O139, часто выделяемых на различных территориях Российской Федерации. N-ацетил-P-D-глюкозаминидазная активность четко выявлялась у всех исследованных штаммов различного происхождения и с разным набором детерминант вирулентности (ctx+ tcp+, Actx Atcp, Actx tcp ), а также у клинических штаммов Actx tcp+. В ходе анализа полученных результатов выявлено, что активность N-ацетил-P-D-глюкозаминидазы у штаммов V. cholerae non O1/non O139 из органов рыб из акватории Азовского моря составила в среднем 4,39 ± 0,53 мкг метилумбеллиферона/10 м.к./мл/час. Данные оказались близкими показателям этой активности у водных штаммов V. cholerae О139 серогруппы, однако активность ^ацетил-Р^-глюкозаминидазы у штаммов V. cholerae non O1/non O139, выделенных от людей, оказалась выше и составила в среднем 19,7 ± 7,35 мкг метилумбеллиферона/109 м.к./мл/час при р = 0,05, что указывает на необходимость более углубленного изучения роли этого фермента в биологии вибрионов клинического происхождения (таблица).
44
ЗНиСО
•Ш, N04 (277)
Таблица. N-ацетил-Р-Б-глюкозаминидазная активность у штаммов Vibrio cholerae разных серогрупп, выделенных из различных источников
Штаммы, серогруппа Источник выделения Гены ctx AB tcpA Активность фермента (среднее значение мкг 4-метилумбеллиферона/ 10 м.к./мл/ час, р), температура выращивания 37 °С Активность фермента (среднее значение мкг 4-метилумбеллиферона/ 10 9м. к./мл/ час, р), температура выращивания 28 °С
V. cholerae 0139 Клинический материал ctx+tcp+ 1,87 ± 0,948 р = 0,05 4,78 ± 2,13 р = 0,05
V. cholerae 0139 Вода поверхностных водоемов ActxAtcp 4,75 ± 2,73 р=0,05 7,76 ± 5,14 р = 0,05
V. cholerae Ol eltor Вода поверхностных водоемов ActxAtcp 3,57 ± 0,92 р = 0,05 5,99 ± 0,65 р = 0,05
V. cholerae non Ol/non O139 Клинический материал ctx+tcp+ Actxtcp+ ActxAtcp 19,7 ± 7,35 р = 0,05 Не определяли
V. cholerae non Ol/non O139 Вода поверхностных водоемов из органов рыб ActxAtcp 4,39 ± 0,53 р = 0,05 Не определяли
V. cholerae 01 classical Клинический материал ctx+tcp+ 8,92 ± 3,10 р = 0,05 7,81 ± 3,22 р = 0,05
Примечание. Гены ctxAB детерминируют синтез токсина, а tcpA - токсин-корегулируемых пилей
В работе исследовали также влияние очищенного препарата К-ацетил^-О-глюкозами-нидазы на штаммы ряда гетерологичных микроорганизмов. Анализ полученных результатов показал, что испытуемый препарат фермента обладал антибактериальным действием, подавляя в низких концентрациях рост ряда лабораторных штаммов E. coli HB101, E. coli QD5003, M. luteus, S. typhimurium, Y. pestis EV. Диаметр зон ингибирования роста были различными (3— 10 мм), максимально выраженный антибактериальный эффект проявлялся в отношении M. luteus и S. typhimurium. Можно полагать, что препарат К-ацетил^-О-глюкозаминидазы может быть активен в отношении и других микроорганизмов.
Выводы. Полученные данные могут указывать на эволюционную важность синтеза этого энзима для вибрионов различного происхождения. Обнаружено, что условия выращивания (температура) и индивидуальные особенности штаммов вибрионов влияли на уровень активности К-ацетил^-О-глюкозаминидазы. Выявленное увеличение активности фермента при понижении температуры культивирования у штаммов V. cholerae eltor O1 и 0139 серогрупп, изолированных из воды, позволяет предположить участие этого фермента в выживаемости/сохраняемости холерных вибрионов во внешней среде в условиях контакта с хитинсодержащими объектами. Изучение свойств К-ацетил^-О-глю-козаминидазы оказалось информативным. Неожиданно выявленная антибактериальная способность у очищенного фермента из V. cholerae представляется интересной, так как она перекликается с предположением J.B. Kaplan et. al. [5] о возможном участии аналогичного фермента из Actinobacillus sp. в явлении устранения биопленок других бактерий с целью освобождения
поверхностей для собственного укоренения в конкретной экологической нише.
Обнаруженное свойство фермента мы рассматриваем в качестве материальной основы конкурентных возможностей холерных вибрионов в сложных механизмах их циркуляции в разнообразных природных условиях. Таким образом, исследование N-ацетил-Р-О-глюкозами-нидазы - фермента, входящего в состав мощного хитинолитического комплекса холерных вибрионов, расширило наши представления о возможной роли этого фермента в экологии возбудителя.
ЛИТЕРАТУРА
1. AmMapun И.П. и др. Статистические методы в микробиологических исследованиях./ И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев // Ленинград: Изд-во «Мед.лит.», 1962. 180 с.
2. Мишапькип Б.Н. и др. Изучение хитинолитического комплекса холерного вибриона сероварианта О139 / Б.Н. Мишанькин, Н.Я. Шиманюк, С.О. Водопьянов [и др.] // Биотехнология. 2010. № 1. С. 32-40.
3. Henrissat B. et al. New familities in the classification of glycosyl hydrolase based on amino acid sequence similarities / B. Henrissat, A. Bairoch // Biochem. J. 1993. Vol. 293. P. 781-788.
4. Hunt D.E. et al. Conservation of the chitin utilization pathway in the Vibrionaceae / D.E. Hunt, D. Gevers, N.M. Vahora, M.F. Polz // Appl. Environ. Microbiol. 2008. Vol. 74. № 1. Р. 44-51.
5. Kaplan J.B. et al. Detachmеnt of Actinobacillus actinomy-cetemcomitans biofilm cells by an endogenous p-hexosa-minidase activity/ J.B. Kaplan, C. Ragunath, N. Rama-subbu, D.H. Fine// J. Bacteriol. 2003. Vol. 185. №16.
P. 4693-4698.
Контактная информация:
Дуванова Ольга Викторовна, тел.: +7 (863) 240-22-66, e-mail: [email protected] Contact information: Duvanova Olga, р^эм: +7 (863) 240-22-66, e-mail: [email protected]
