CC BY
44
УДК 574.24:351.777.61
О. М. Плотникова1, Б. И. Кудрин1, А.Н. Евдокимов2, С. Ю. Максимовских2
ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ ГЛИФОСАТА ПО ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИМ И БИОХИМИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ КРОВИ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ
1 КУРГАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ РЕГИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ПО ОБЕСПЕЧЕНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОГО ЭКОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ И МОНИТОРИНГА ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО
ОРУЖИЯ ПО КУРГАНСКОЙ ОБЛАСТИ
O. M. Plotnikova1, B. I. Kudrin1, A. N. Evdokimov2, S. Y. Maksimovskikh2 THE ESTIMATION OF TOXICITY GLYPHOSATE ACCORDING TO HEMATOLOGICAL AND BIOCHEMICAL PARAMETERS OF BLOOD LABORATORY MICE
1KURGAN STATE UNIVERSITY 2REGIONAL CENTER FOR STATE ENVIRONMENTAL CONTROL AND MONITORING OF THE STORAGE FACILITY AND DESTRUCTION OF CHEMICAL WEAPONS ROUND KURGAN REGION
Аннотация. Однократное внутримышечное введение белым лабораторным мышам глифосата в дозе 50 мг/кг приводило к повышению содержания в плазме крови общего фосфора и к снижению активности фермента аланинаминотрансферазы. Обнаружены изменения количества эритроцитов и лейкоцитов. Выявлена реакция со стороны миелоидного и лимфоидного лейкоцитарных ростков, ответственных за клеточный и гуморальный иммунитет.
Ключевые слова: глифосат; токсичность; белые лабораторные мыши; морфология крови; биохимия крови.
Ольга Михайловна Плотникова
Olga Mikhailovna Plotnikova доктор биологических наук, кандидат химических наук, доцент
Сергей Юрьевич Максимовских
Sergey Yuryevich Maksimovskikh кандидат сельскохозяйственных наук [email protected]
Введение. Глифосат (К-(фосфонометил)-глицин или 2-[(К-фосфонометил)амино]-уксусная кислота) относится к производным класса алкилфосфонатов, входит в качестве активного компонента в состав гербицидов неизбирательного действия, широко применяемых в настоящее время в сельском хозяйстве. В нашей стране распространение получили такие глифосат-содержащие препараты этой группы, как «Раундап», «Ураган», «Торнадо» и другие. Глифосат является достаточно стойким химическим соединением, поэтому его появление в компонентах окружающей среды является признаком антропогенного загрязнения.
Abstract. A single intramuscular injection of glyphosate to the white laboratory mice in a dose of 50 mg/kg led to the increasing of total phosphorus in blood plasma level and to the decreasing of the activity of the glutamyl pyruvic transaminase enzyme. The changes of erythrocytes and leucocytes were found. The reaction of myeloid and lymphoid leukocyte germs responsible for cellular and humoral immunity was revealed.
Keywords: glyphosate; toxicity; white laboratory mice; the morphology of blood; blood biochemistry.
Борис Иванович Кудрин
Boris Ivanovich Kudrin кандидат медицинских наук [email protected]
Александр Николаевич Евдокимов
Aleksander Nikolaevich Evdokimov [email protected]
Гербицидная активность глифосата связана с ин-гибированием в растениях фермента 5-энолпирувил-шикимат-3-фосфат-синтазы, участвующего в синтезе ароматических аминокислот, необходимых для синтеза белков [1]. У животных эти ароматические аминокислоты не синтезируются, а поступают с пищей. Именно этот факт отсутствия в организме млекопитающих биохимических путей, которые могли бы быть блокированы глифосатом, а также низкая всасываемость его через пищеварительный тракт и кожные покровы (15-35 %) [2] послужили основанием первому производителю гербицида «Раундап» на основе глифосата - фирме «Монсанто» - считать свой продукт не токсичным для животных и человека [3].
Однако широкое применение в сельскохозяйственном производстве гербицидов различных товарных марок, созданных на основе глифосата, выявило их острую токсичность для млекопитающих, включая человека. Этот факт был объяснен токсичностью сопутствующих компонентов, прежде всего детергентов, которые добавлялись к глифосату для улучшения его потребительских свойств. Острая токсичность гербицидов на основе глифосата по показателю ЬБ50 при пероральном введении лабораторным животным (крысы, мыши) варьирует, в зависимости от формулы гербицида и вида животных, в пределах от 1000 до 5000 мг/кг [4]. В экспериментах на животных, подвергавшихся воздействию разных доз глифосат-содержащих гербицидов, обнаружен ряд отклонений физиологического, биохимического и морфологического характера [5-8]. Описаны многочисленные случаи отравления людей глифосат-содержащими гербицидами, попавшими в организм человека случайно либо при попытке суицида [9; 10].
Острая оральная токсичность самого глифосата, без добавок, входящих в формулу гербицида, определенная в экспериментах на грызунах, оказалась действительно низкой - показатель ЬБ50 составил свыше 5000 мг/кг для крыс и свыше 10000 мг/кг для мышей [11]. При подкожном введении глифосата показатель ЬБ50 также был достаточно велик и составил 3157±112 мг/кг [11]. Возможно, по этой причине исследователи мало внимания уделяли изучению токсического влияния на органы и системы млекопитающих самого глифосата.
Целью выполненного исследования было изучение острой токсичности раствора глифосата для млекопитающих при его однократном парентеральном введении былым лабораторным мышам в дозе 50 мг/кг.
Методика. Исследование выполнено на 60 белых лабораторных мышах-самцах линии СВА, стандартизированных по массе, возрасту и условиям содержания. Все животные соответствовали категории конвенционально улучшенных, клинически здоровых. Масса мышей составила 24,0-26,0 г. В экспери-
ментах использовали раствор натриевой соли глифосата, который получали из технического (85 %) гли -фосата (производство КНР) путем нейтрализации его раствором гидроксида натрия. Раствор глифосата (0,74 моль/л) вводили мышам однократно внутримышечно в дозе 50 мг/кг, что составляет 1,6 % от LD50.
Мышей умерщвляли через 1, 2, 3 и 4 суток методом декапитации, кровь собирали и использовали для проведения гематологических (подсчет эритроцитов и лейкоцитов, определение лейкоцитарной формулы) и биохимических исследований (определение активности щелочной фосфатазы (ЩФ), алани-наминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансфе-разы (АСТ), холинэстеразы (ХЭ) и содержания общего белка, мочевины, холестерина, общего фосфора). Контрольной группой служили 12 животных, ко -торым внутримышечно вводили 0,1 мл физиологического раствора.
Подсчет числа эритроцитов и лейкоцитов, приготовление мазков, с последующей окраской по Романовскому-Гимза, определение лейкоцитарной формулы проводили по общепринятым методикам
[12]. Анализ содержания субстратов и активности ферментов проводили с помощью наборных методов фирмы Вектор-Бест (Новосибирск). Достоверность различий определяли методом непараметрической статистики по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни
[13]. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез составил р<0,05. При статистической обработке результатов исследования был использован интегратор модульной программы Attestat 1.0 для Microsoft Exel, разработанный И. П. Гай-дышевым.
Результаты. Поведение животных после введения натриевой соли глифосата в дозе 50 мг/кг не претерпевало каких-либо изменений. Осмотр внутренних органов животных при вскрытии также не выявил отклонений от нормы.
Однако гематологическое обследование, проведенное в этой серии опытов (таблица), позволило выявить определенные отклонения от контроля.
Таблица - Показатели крови мышей при однократном введении глифосата
Группа мышей Стат. показ. Эр. Лейк. Н. Э. Л. М. Абс. Н. Абс. Л.
Контроль п=12 М 9,33 7,16 15,1 1,4 83,9 1,6 1,14 6,01
1 сутки п=9 М 8,96 8,30 18,2 0,9 79,3 0,9 1,53* 6,58
2 суток п=9 М 9,93 10,28* 14,8 1,6 82,8 0,9 1,45* 8,51*
3 суток п=20 М 8,38* 7,03 18,5 1,5 74,8* 0,4 1,30* 5,25
4 суток п=10 М 8,51* 5,25* 17,6 1,0 81,0 0,3 0,99 4,25*
Обозначения: Эр. - эритроциты (тыс./мкл); Лейк. - лейкоциты (ед./мкл); Н - общее содержание нейтрофилов (%); Э - эозинофилы (%); Л - лимфоциты (%); М - моноциты (%); Абс. Л. - абсолютное число лимфоцитов; Абс. Н. - абсолютное число нейтрофилов; Стат. показ. - статистический показатель; п - величина выборки;
* статистически значимые отличия при р<0,05.
Со стороны красной крови у животных, спустя трое суток и более от начала эксперимента, обнаружено достоверное снижение числа эритроцитов. Со стороны белой крови отмечено двухфазное изменение количества лейкоцитов. Вначале оно повышалось и, по истечении двух суток от начала эксперимента, становилось значимым. Затем повышение сменялось снижением, которое, спустя четверо суток от начала эксперимента, также становилось значимым.
Анализ лейкоцитарной формулы и расчет абсолютного содержания в крови нейтрофилов и лимфоцитов показал, что лейкоцитоз, выявленный по истечении первых 2 суток, формируется за счет как грануло-цитов, так и агранулоцитов, знаменуя собой реакцию иммунной системы на введение глифосата. Обе разно-
видности лейкоцитов принимают участие и в развивающейся по истечении четырех суток лейкопении.
Таким образом, гематологическое исследование крови подопытных мышей выявило морфофизиоло-гические отклонения, проявляющиеся в изменении числа эритроцитов и лейкоцитов, а также в нарушении нормальной морфологической картины крови. Обнаруженные изменения со стороны миелоидного и лимфоидного ростков свидетельствуют о вовлечении также иммунных механизмов в процесс выведения и нейтрализации глифосата.
Биохимическое исследование плазмы крови показало (рисунок), что введение глифосата оказало влияние, в основном, на содержание общего фосфора и на активность АЛТ.
о £
X о и н о
160
140
120
100
80
60
40
144
122
1
73
141
118
55
50
1 сутки □ ОБ ШХЛ
2 сутки I МОЧ Ш Фосфор
3 сутки 4 сутки
I ЩФ □ АСТ ЕЗ АЛТ В ХЭ
Рисунок - Активность ферментов и содержание субстратов в плазме крови (в % от контроля) через 1, 2, 3, 4 суток после однократного внутримышечного введения самцам лабораторных мышей раствора глифосата в дозе 50 мг/кг (приведены данные в случае достоверности отличия от контроля при р<0,05).
Повышение содержания общего фосфора спустя 1, 2 и 3 суток, является логичным следствием введения в организм фосфорорганического токсиканта. Следует отметить, что по истечении 4 суток после введения глифосата изменения в содержании этого метаболита в крови перестают быть достоверными, что может свидетельствовать о выведении большей части токсиканта из организма.
Активность АЛТ оставалась во всех вариантах опытов ниже значений в контроле, уменьшаясь примерно на 35-50 %, а активность АСТ после введения раствора глифосата оставалась в пределах контрольных значений, имея тенденцию к увеличению на 3-4 сутки после введения глифосата. Понижение активности АЛТ, вероятно, может быть вызвано дефици-
том его кофермента - пиридоксальфосфата за счет переэтерификации с глифосатом, а также с повреждением гепатоцитов, участвующих в процессах обмена аминокислот и синтеза белков. Это подтверждается тенденцией к снижению активности ХЭ.
Снижение активности АЛТ при сохранении не уровне контроля активности АЛТ приводит к увеличению интегрального показателя - коэффициента де Ритиса (отношение АСТ/АЛТ) - в 2 и более раз на 3-4 сутки после введения глифосата. Увеличение коэффициента де Ритиса при снижении активности АЛТ рекомендовано в качестве биохимических маркеров при оценке воздействия на теплокровные организмы метилфосфонатов как в высоких, так и в низких дозах [14].
Через сутки после введения глифосата отмечалось снижение активности ЩФ, что, вероятно, может быть следствием нарушения функции клеточных структур печени и почек, синтезирующих этот фермент, что согласуется с тенденцией к повышению содержания в крови мочевины и гипоферментемией ХЭ и АЛТ, являющихся энзимами, характеризующими функции печени.
Таким образом, биохимическое исследование плазмы крови показало, что введение лабораторным мышам фосфорсодержащего токсиканта глифо-сата в дозе 50 мг/кг увеличивает содержание общего фосфора и вызывает снижение активности фермента
АЛТ, что свидетельствует об изменениях равновесных состояний метаболизма и снижении активности ферментов в печени.
Выводы. Однократное парентеральное введение глифосата самцам белых лабораторных мышей в дозе 50 мг/кг приводило к достоверному увеличению содержания в плазме крови общего фосфора и снижению активности аланинаминотрансферазы, к изменению содержания эритроцитов и лейкоцитов в крови мышей, а также вызывало реакцию со стороны ми-елоидного и лимфоидного лейкоцитарных ростков, ответственных за поддержание клеточного и гуморального иммунитета.
Список литературы
1 National pesticide information center. Glypho-sate technical fact sheet. [Электронный ресурс]. URL: http://npic.orst.edu/factsheets/glyphotech.pdf (дата обращения 30.06.2015).
2 Williams G. M., Kroes R., Munro I. C. Safety evaluation and risk assessment of herbicide Roundup and its active ingredient, glyphosate, for humans //Regulatory Toxicology and Pharmacology. - 2000. - V. 31.
- P. 117-165.
3 Backgrounder: Glyphosate and standard toxicology studies. 2002. [Электронный ресурс]. URL: http:// www.monsanto.com/products/documents/glyphosate-background-materials/gly_tox101_bkg.pdf (дата обращения 10.06.2015).
4 Extension toxicology network.Pesticide information profiles. Glyphosate. [Электронный ресурс]. URL: http://extoxnet.orst.edu/pips/glyphosa.htm (дата обращения 10.06.2015).
5 Benachour N., Seralini G.-E. Glyphosate formulations induce apoptosis and necrosis in human umbilical, embryonic, and placental cells // Chemical Research in Toxicology Journal, American Chemical Society. - 2009.
- V. 22. - Р. 97-105.
6 Jasper R., Locatelli G. O., Pilati C., Locatelli C. Evaluation of biochemical, hematological and oxidative parameters in mice exposed to the herbicide glypho-sate-Roundup // Interdiscip Toxicology. - 2012. - V. 5.
- N. 3. - Р. 133-140.
7 Pieniazek D., Bukowska B., Duda W. Comparison of the effect of Roundup Ultra 360 SL pesticide and its
active compound glyphosate on human erythrocytes // Pesticide Biochemistry and Physiology. - 2004. - V. 79.
- N. 2. - Р. 58-63.
8 Differential effects of glyphosate and roundup on human placental cells and aromatase / Richard S., Mos-lemi S., Sipahutar H., et al. // Environ Health Perspect. 2005 June; v. 113, No 6, P. 716-720.
9 Acute poisoning with glyphosate-containing herbicides is approximately 7,7% from the available studies / Roberts D. M., Buckley N. A., Mohamed F., at el. // Clin Toxicology. - 2010. - V. 48. - N. 2. - P. 129-36.
10 Acute poisoning with a Glyphosate-Surfactant Herbicide ('Roundup'): A Review of 93 Cases / Talbot A. R., Shiaw M. H., Huang J. S., at el. // Human and Experimental Toxicology. - 1991. - V. 10. - N. 1. - Р. 1-8.
11 Исследование острой токсичности глифосата / Максимовских С. Ю. [и др.] // Достижения науки - агропромышленному производству : материалы LIV междунар. науч.-техн. конф. - Челябинск : ЧГАА, 2015. - Ч. V. - С. 140-145.
12 Меньшиков В. В. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.
13 Гублер Е. В., Генкин А. А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Л. : Медицина, 1973.
- 144 с.
14 Плотникова О. М. Влияние метилфосфоновой кислоты на основные звенья гомеостаза белых лабораторных мышей : дис ... докт. биол. наук. - Казань, 2012. - 266 с.
