CC BY
254
О ВЛИЯНИИ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДОВ МЕТАЛЛОВ НА ФИЗИОЛОГИЮ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ
УДК 577.539.199 DOI: 10.17816/RCF14324-33
© О.А. Зейналов1, С.П. Комбарова1, Д.В. Багров2, М.А. Петросян3, Г.Х. Толибова3, А.В. Феофанов2, К.В. Шайтан2
'ООО «ФармГен Технологии»;
2Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва;
3ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта» СЗО РАМН, Санкт-Петербург
Поступила в редакцию 01.07.2016 Принята к печати 16.08.2016
Ключевые слова:
нанотехнологии; наночастицы оксидов металлов; характериза-ция наночастиц; просвечивающая электронная микроскопия; биосистемы; биобезопасность; лабораторные мыши; физиология; интоксикация; первичный контроль; показатели поведения животных; клинические и биохимические параметры крови.
Список сокращений:
АСТ — аспартатаминотрансфераза; ЩФ — щелочная фос-фатаза; АЛТ — аланинаминотрансфераза.
Резюме
В настоящее время стремительно растет количество материалов и товаров, производимых с помощью нанотехнологий, что приводит к увеличению поступления наночастиц в биосистемы. Для оценки рисков, связанных с производством и оборотом нанопродукции, должны быть разработаны методы экспресс-диагностики нанопатологий.
В данной работе экспериментально показано, что введение наночастиц оксидов металлов ZnO, Al2O3, CeO2) ла-
бораторным мышам приводит к изменению профилей специфических гематологических и биохимических параметров крови. На основании этого с целью раннего выявления признаков интоксикации в качестве оценочных критериев влияния наночастиц оксидов металлов на живые организмы можно рекомендовать экспресс-контроль периферической крови (показатели красной крови) и биохимические параметры сыворотки крови (активности аминотрансфераз и показатели азотистого обмена). Выбранные показатели крови могут служить диагностическими биомаркерами при разработке экспресс-тестов первичной комплексной оценки воздействия наночастиц оксидов металлов на биосистемы.
ABOUT THE iNFLUENCE OF METAL OXiDE NANOPARTiCLES ON LiViNG ORGANiSMS PHYSiOLOGY
© O.A. Zeinalov1, S.P. Kombarova1, D.V. Bagrov2, M.A. Petrosyan3, G.H. Tolibova3, A.V. Feofanov2, K.V. Shaitan2
1 LLC "PharmGene Technology", Moscow, Russia;
2 M.V. Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, Moscow, Russia;
3 D.O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Russian Academy of Medical Sciences, Saint Petersburg, Russia
For citation: Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy, 2016;14(3):24-33 Received: 01.07.2016
Accepted: 16.08.2016
♦ Keywords: nanotechnology; metal oxides nanopartic-les; characterization of nanoparticles; transmission electron microscopy; biosystems; biosafety; primary monitoring; laboratory mice; physiology; intoxication; indicators of animal behavior; hematological and biochemical parameters of blood.
♦ Abstract. Recently the number of materials and goods produced by nanotechnology has been growing rapidly, leading to an increased penetration of nanoparticles into biosystems. To assess the risks associated with the production and circulation of nanoproducts should be developed methods for the rapid diagnostics of nanopathology. In this work, it has been experimentally
shown that the introduction of metal oxides nanoparticles (TiO2, ZnO, Al2O3, CeO2) to laboratory mice leads to changes some profiles of specific hematological and biochemical blood parameters. Therefore for the purpose of early detection of symptoms of intoxication as benchmarks of the influence of metal oxide nanoparticles on living organisms can recommend express monitoring of peripheral blood (red blood parameters) and biochemical parameters of blood serum (activity of aminotransferases and indicators of nitrogen metabolism). The chosen indicators of blood can serve as diagnostic biomarkers in the development of rapid tests of primary monitoring of the impact of metal oxide nanoparticles on biological systems.
введение
Рынок наноматериалов в мировой экономике является одним из наиболее динамично развивающихся. В соответствии с существующими прогнозами [9] мировой объем производства в области нанотехнологий через 10-15 лет должен превысить 1 трлн долл. США. Одним из важнейших направлений развития нанотехнологий является получение наноразмерных порошков (нанопорошков), не менее 80 % которых составляют нанодисперсные оксиды металлов: оксиды титана, цинка, церия, алюминия, циркония, железа и некоторые другие [9, 37].
В настоящее время нанопорошки металлов и оксидов уже используются для твердотопливных ракетных ускорителей, в солнечной и водородной энергетике, в составах для низкотемпературной пайки в электронике, химической промышленности, медицине, фармацевтике, ветеринарии, косметологии и других областях [7, 37].
В Великобритании на основе наночастиц оксида церия разработан катализатор сгорания моторного топлива Envirox, добавление которого в моторное топливо (5 мг/л) уменьшает расход топлива, снижает образование углекислого газа и эмиссию частиц. Подобный отечественный катализатор на основе на-норазмерных частиц CeO2 разработан в Институте прикладной нанотехнологии [1, 30].
Еще одно перспективное направление использования наночастиц оксидов металлов — это фотокаталитическая очистка воды [22]. Подобные системы очистки воды, использующие TiO2, уже производятся американской компанией Lokheed Martin и функционируют во Флориде (США) [39].
На основе наночастиц TiO2 разрешен к применению пищевой краситель E171, получаемый из минеральных пород и применяемый для защиты цвета и упаковки продуктов от ультрафиолетового излучения [38, 40].
В последнее время появилось первое истинно медицинское применение нанопорошков — прочные, биологически совместимые импланты и биоактивные покрытия. Разработан процесс синтеза из нанопорошков оксидов TiO2 и Al2O3 наноструктури-рованных покрытий имплантов [7].
После проведения широкомасштабных исследований нанопорошки планируется также использовать для доставки лекарств к определенным органам [36]. В качестве таких носителей продемонстрирован высокий потенциал наночастиц CeO2 [31].
Значительная доля косметических препаратов на сегодняшний день уже содержит наночастицы. Из 1200 солнцезащитных кремов примерно 228 содержат оксид цинка, 363 — диоксид титана, а в 73 включены оба эти соединения. При этом в 70 % кремов, содержащих TiO2, и в 30 % кремов, содержащих ZnO, эти оксиды находятся в наноформе [12]. Однако мало кто задумывается о том, что частицы TiO2 проникают в кожу и обнаруживаются в эпидер-
ме уже через 6-8 ч после нанесения крема. В случае проблемной кожи проницаемость дермы для наночастиц значительно повышается, особенно в местах ее растяжений (например, на сгибах суставов и т. п.) [14, 15, 21].
Накопленные данные о воздействии различных наночастиц на лабораторных животных подтверждают их потенциальную опасность. Это связано со способностью наночастиц проникать сквозь защитные барьеры организма — трансдермально, через слизистые оболочки дыхательных путей и пищеварительной системы, через гистогематические барьеры [6, 8, 11, 14, 18, 21, 23, 24, 27, 29, 33].
На примере наиболее широко используемых наноматериалов на основе наночастиц TiO2 показано, что при ингаляционном введении их крысам частицы размером 20 нм способны накапливаться в лимфоидных тканях и обладают повреждающим действием по отношению к ДНК лимфоцитов и клеткам мозга [28]. Основным механизмом токсического действия наночастиц TiO2 большинство исследователей [8, 20, 28] считают индукцию активных форм кислорода, причем активность зависит не только от размеров наночастиц, но и от того, в какой форме находится TiO2 — кристаллической или аморфной.
Наибольшую опасность представляют наночастицы ZnO, также широко распространенные даже в антисептических средствах для детей (Деситин, Диадерм и др.). При изучении in vitro токсичности наночастиц ZnO, TiO2, Fe3O4, Al2O3 и CrO3 (30-47 нм, Sigma Inc. and Nanoscale Inc.), используемых или предложенных для использования в ряде отраслей промышленности, показана высокая токсичность наночастиц ZnO; умеренная токсичность TiO2; наночастицы Fe3O4 и Al2O3 проявляли незначительную токсичность лишь при концентрациях более 200 мкг/мл. В присутствии наночастиц ZnO (от 50 до 100 мкг/мл) значительно подавлялась функция митохондрий клеток Neuro-2A (мышиной нейробласто-мы, CCL-131, ATCC), а также увеличивалась утечка из них лактатдегидрогеназы, что приводило к апоп-тозу клеток [19].
Недостаточно изучено мутагенное воздействие нанопорошков на живые организмы (в основном в тестах in vitro). ДНК-повреждения выявлены при исследовании влияния наночастиц TiO2 на лимфо-бласты человека; а также покрытых церием нано-частиц TiO2, активируемых видимым светом, — на клетки гепатомы человека Bel7402 [34]; наночастиц TiO2 без фотоактивации — на бронхиальные эпите-лиоциты человека BEAS-2B [16].
В целом количество производимых наноматериалов и нанотоваров ежегодно стремительно растет, что приводит к существенному увеличению поступления наночастиц в биосистемы. Поэтому до начала коммерциализации необходимо оценить воздействие наночастиц на окружающую среду, здоровье и безопасность людей. Их проникновение в биосферу может быть чревато многими последствиями,
прогнозировать которые пока не представляется возможным из-за недостатка информации. Для дальнейшего развития нанотехнологий необходимо более четкое понимание как свойств самих наночастиц и наноматериалов, так и механизмов их взаимодействия с биологическими объектами. В связи с этим, в частности, актуальны исследования влияния наночастиц оксидов металлов на физиологию живых организмов и изучение возможности разработки экспресс-контроля наночастиц с использованием методов клинической лабораторной диагностики.
целью данной работы явилась оценка влияния высоких доз препаратов, содержащих наночастицы оксидов металлов (TiO2, Al2O3, ZnO, CeO2), на поведение экспериментальных животных, морфологические и биохимические показатели крови.
экспериментальная часть
В работе использованы взрослые белые аутбред-ные мыши-самцы с исходной массой 25-35 г. Лабораторные животные были получены из ФГУП «Питомник лабораторных животных "Рапполово" РАМН» и содержались в регламентированных условиях вивария ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН при соблюдении всех правил содержания лабораторных животных (время и порядок проведения карантина, маркировка особей, постоянный санитарный контроль, стандартный рацион питания, свободный доступ к воде и пище, автоматический режим освещения «день — ночь» и др.) при полном исключении отрицательных воздействий [3-5].
Исследование выполнено на 75 экспериментальных животных, из которых было сформировано 5 групп: одна — контрольная и четыре — подопытные. Каждая группа состояла из 15 животных, которые получали соответствующее группе испытуемое вещество. Все препараты вводили животным в виде водных суспензий в желудок per os с использованием металлического зонда ежедневно в течение 5 суток в дневные часы с 12 до 15 часов.
Контрольная группа животных получала дистиллированную воду (Milli-Q), подопытные группы — оксиды металлов TiO2, Al2O3, CeO2, ZnO (Sigma-Aldrich).
Исходные препараты оксидов металлов (TiO2, Al2O3, CeO2) представляли собой водные суспензии (10 масс. %), оксид цинка (ZnO) — нанодисперсный порошок. Суспензию наночастиц ZnO в дистиллированной воде (10 масс.%) готовили непосредственно перед использованием путем диспергирования на ультразвуковом дезинтеграторе Elmasonic S 60 H (Elma, Германия). Суспензию озвучивали 30 мин при мощности УЗ 30 Вт и частоте 35 кГц (размеры резервуара Ш/Г/В — 194/84/60, наполнитель — вода Milli-Q). Суспензия ZnO сохраняла стабильность в течение 2 суток.
Ежесуточная доза вводимых суспензий оксидов металлов составляла 250 мкг/г животного (в объеме
0,15 мл). Введение осуществляли в течение 5 суток. Для получения необходимых концентраций и объема исходные суспензии оксидов непосредственно перед их введением разводили в 2 раза дистиллированной водой. Контрольная группа животных параллельно с подопытными получала дистиллированную воду тем же способом в сопоставимых объемах.
С целью выявления признаков интоксикации во всех экспериментальных группах, включая контроль, изучали показатели индивидуального поведения животных, а также гематологические и биохимические параметры крови [2, 4, 10].
1. Показатели поведения животных Наблюдения за характером поведения животных
во всех экспериментальных группах проводили ежедневно с первого дня введения препаратов до окончания эксперимента. При этом оценивались следующие показатели: общее состояние животных, интенсивность и характер двигательной активности, координация движений, состояние волосяного, кожного покрова и положение хвоста, частота и глубина дыхания, реакция на тактильные, болевые и звуковые раздражители, потребление корма и воды, изменения массы тела.
2. Гематологические показатели
Для проведения морфологического исследования периферической крови кончик хвоста мыши протирали асептическим раствором, давали высохнуть, после чего скальпелем отсекали кончик хвоста животного. Первую каплю крови наносили на обезжиренное предметное стекло, предметным шлифованным стеклом готовили тонкий мазок, высушивали его на воздухе, после чего окрашивали. Окраску мазков проводили по Романовскому — Гим-зе с использованием автоматической системы для окраски гематологических мазков Hema-Tek (Bayer Diagnostics, Германия).
На окрашенном мазке анализировались следующие показатели:
- лейкоцитарная формула — морфологическое исследование форменных элементов крови проводилось методом Меандра;
- тромбоциты — учет проводился с помощью автоматического счетчика клеток ABX Micros 60 (Франция) и визуально при подсчете лейкоцитарной формулы;
- морфология эритроцитов — исследование окрашенных мазков крови с помощью иммерсионной системы микроскопа.
Для проведения общеклинического анализа крови (лейкоциты, эритроциты, гемоглобин, тромбоциты) использовали автоматизированный гематологический анализатор ABX Micros 60 (Франция), применяемый для диагностического тестирования цельной крови in vitro.
3. Биохимические показатели крови
Для биохимических исследований крови во всех экспериментальных группах, включая контрольную, на следующий день после введения препаратов из
опыта выводили по три животных. После декапи-тации мышей проводили тотальный забор крови. Кровь собирали в центрифужные пробирки, отстаивали 30 мин, затем центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин. Сыворотку отделяли и использовали для анализа следующих показателей:
- аспартатаминотрансфераза (АСТ — AST IFCC, colorimetric Konelab[TM]);
- аланинаминотрансфераза (АЛТ— ALT IFCC, colo-rimetric Konelab[TM]);
- щелочная фосфатаза (ЩФ — Alkaline Phoshatase SCE, colorimetric Konelab[TM]);
- креатинин (Creatinine Jaffe, colorimetric Konelab [TM]);
- мочевина (Urea, colorimetric Konelab[TM]);
- белок общий (Total protein, colorimetric Konelab [TM]).
Биохимические исследования сыворотки крови проводили в день забора крови с использованием диагностических наборов фирмы Konelab/Thermo Fisher Scientific (Финляндия) на аппарате Vitalab Flexor (Голландия).
Для статистической обработки всех полученных результатов применяли пакет прикладных программ Microsoft Excel. В каждой группе рассчитывали средние значения и ошибку среднего. Достоверность различий с соответствующей контрольной группой оценивали по f-критерию Стьюдента при р < 0,05.
4. Характеризация наночастиц оксидов металлов
Использованные в работе наночастицы были охарактеризованы методом просвечивающей электронной микроскопии [34-36]. Для определения размеров и формы наночастиц использовали просвечивающий электронный микроскоп LEO912 AB OMEGA. Суспензии наночастиц исследовали на сетках, покрытых формваром.
Обработка изображений осуществлялась с помощью программы ImageJ. Для каждой частицы вручную измеряли размеры вдоль двух направлений, их среднее принималось за размер частицы, а отношение — за форм-фактор. Хотя такой способ обработки вносит субъективную погрешность в измерения, именно он был выбран для характеристики образцов, поскольку часть частиц наблюдалась в виде агрегатов (предположительно они слипались при высыхании капли на сетке). Поэтому использовать автоматизированные средства обработки изображений не удавалось. Измерения проводили только на тех частицах, у которых можно было зрительно определить границы. Субъек-
тивная погрешность таких измерении составляла не более 5 пикселей (1,0-2,5 нм) в зависимости от увеличения и контрастности частиц. По результатам измерений (объем выборки составлял N = 100-130 для каждого типа частиц) вычисляли средний размер и средний форм-фактор. Для того чтобы охарактеризовать распределение частиц по размерам, рассчитывали стандартное отклонение.
результаты исследовании и их обсуждение
В медицине в качестве биологических индикаторов токсических процессов нередко используют гематологические показатели (содержание тромбоцитов в периферической крови, гематокрит, лейкоцитарную формулу и др.) и биохимические параметры крови (активности АСТ, АЛТ, ЩФ, уровни азота мочевины, креатинина, общего белка, желчных кислот и др.). Количественными маркерами оксида-тивного стресса и цитотоксичности могут служить также уровни глутатиона, малонового диальдегида, лактатдегидрогеназы и др. При изучении токсичности наноматериалов в ряде работ уже применяли некоторые показатели крови в качестве характеристических индикаторов интоксикации организмов наночастицами [13, 19, 20, 23, 27-29, 32, 35].
Например, изучение хронической токсичности препарата Синерм (на основе наночастиц Fe2O3) на крысах и собаках выявило увеличение активности АСТ и АЛТ в крови животных, что коррелировало с ци-томорфологическими изменениями в печени [35].
Однократное пероральное введение крысам наночастиц ТЮ2 размером 25 и 80 нм в дозе 5000 мг/кг привело к повышению в сыворотке крови уровней лактатдегидрогеназы и а-гидрокси-бутират-дегидрогеназы (25 нм), а также к увеличению массы печени и некрозу гепатоцитов (80 нм) у экспериментальных животных [13].
В данной работе на первом этапе изучения влияния наночастиц оксидов металлов (TiO2, Al2O3, CeO2, ZnO) на лабораторных мышах была проведена характеризация наночастиц методом просвечивающей электронной микроскопии.
Нужно отметить, что размер всех исследованных типов наночастиц оказался в пределах размеров, сообщаемых поставщиком Sigma-Aldrich. Результаты измерений собраны в табл. 1. Типичные изображения наночастиц показаны на рис. 1.
■ Таблица 1. Характеристика наночастиц по размерам
Материал частиц Средний размер, нм Стандартное отклонение размера, нм Средний форм-фактор Размер, сообщаемый поставщиком, нм
Оксид церия, Се02 11,3 ± 1,3 3,2 1,50 ± 0,10 < 25
Оксид титана, ТЮ2 17,0 ± 3,0 9,0 1,28 ± 0,05 < 75
Оксид цинка, ZnO 54,0 ± 5,0 27,0 1,70 ± 0,10 < 100
Оксид алюминия, А1203 10,0 ± 2,0* 3,0 1,40 ± 0,20 < 50
* В образце присутствовали единичные крупные (более 250 нм) частицы, которые не были включены в выборку
Рис. 1. Изображения наночастиц, полученные на электронном микроскопе
■ Таблица 2. Лейкоцитарная формула периферической крови контрольных и подопытных животных после введения испытуемых препаратов
Группа животных, препарат Дни опыта Морфологический состав периферической крови
нейтрофилы, % моноциты, % эозинофилы, % лимфоциты, %
палочкоядерные сегментоядерные
Контроль (дистил. вода) 1-5 1,4 ± 0,2 18,5 ± 3,0 1,6 ± 0,2 0,6 ± 0,1 65,0 ± 5,0
тю2 1 2,0 ± 0,5 21,0 ± 3,3 3,0 ± 0,4 0 49,0 ± 4,0
2 1,5 ± 0,3 20,5 ± 3,3 2,5 ± 0,3 0 50,5 ± 4,0
3 1,0 ± 0 20,0 ± 3,0 2,0 ± 0,2 1,0 ± 0,2 58,5 ± 4,5
4 1,5 ± 0,3 18,8 ± 2,4 1,8 ± 0,2 1,0 ± 0,2 60,2 ± 3,8
5 1,5 ± 0,3 19,5 ± 2,7 1,6 ± 0,1 1,5 ± 0,3 62,5 ± 3,0
А1А 1 1,0 ± 0 17,5 ± 2,0 1,6 ± 0,1 0 65,5 ± 4,5
2 1,5 ± 0 25,0 ± 3,5 2,3 ± 0,2 2,0 ± 0,5 51,0 ± 3,5
3 1,5 ± 0,3 23,0 ± 2,8 2,2 ± 0,3 3,0 ± 0,6 50,5 ± 3,2
4 1,5 ± 0,3 15,0 ± 2,0 2,1 ± 0,2 2,0 ± 0,4 61,5 ± 4,0
5 1,5 ± 0 13,2 ± 2,0 1,9 ± 0,2 1,0 ± 0,2 67,5 ± 4,8
ZnO 1 1,3 ± 0,2 32,5 ± 3,9 2,5 ± 0,4 0 42,0 ± 2,5
2 1,0 ± 0 34,5 ± 4,5 2,3 ± 0,3 1,0 ± 0 40,3 ± 1,8
3 1,0 ± 0 24,5 ± 3,6 2,0 ± 0,2 0,5 ± 0,05 55,2 ± 3,2
4 1,0 ± 0 25,5 ± 3,8 2,0 ± 0,2 0,5 ± 0,05 53,0 ± 2,8
5 1,0 ± 0 30,2 ± 3,6 1,9 ± 0,1 1,0 ± 0 45,5 ± 2,5
Се02 1 1,0 ± 0 42,0 ± 4,7 1,6 ± 0,1 1,0 ± 0,2 37,4 ± 2,0
2 2,0 ± 0,3 29,0 ± 3,4 2,2 ± 0,3 1,5 ± 0,3 46,9 ± 3,1
3 1,5 ± 0,2 23,5 ± 2,5 2,0 ± 0,2 2,5 ± 0,5 57,7 ± 4,4
4 1,0 ± 0 18,7 ± 2,4 2,0 ± 0,2 0 60,7 ± 4,5
5 1,0 ± 0 17,5 ± 2,0 1,5 ± 0,1 0,5 ± 0 66,0 ± 5,3
20 т
б
ТЮг Д1203 гпо Се02
КЗДень! Ш День2 ШДеньЗ 1У День4 С] День 5
ТЮ2
А120з
1пО
Се О,
ИДень1 ВДень2 ШДеньЗ ЯДень4 СЭДень 5 2000 т
^^ контроль
Рис. 2. Общеклиническое исследование (уровень гемоглобина и эритроцитов) крови экспериментальных животных после введения испытуемых препаратов
ТЮ2
б
контроль
А1А
2.пО
СеО,
¡День2 ШДеньЗ НДень4 ПДень 5
Рис. 3. Общеклиническое исследование (уровень лейкоцитов и тромбоцитов) крови экспериментальных животных после введения испытуемых препаратов
а
а
В результате наблюдения за общим состоянием животных контрольных и подопытных групп после введения им изучаемых препаратов (ТЮ2, А1203, Се02, 7пО) в выбранной дозе (250 мкг/г животного в сутки) внешних признаков проявления интоксикации отмечено не было. Однако после введения препаратов у мышей всех подопытных групп наблюдали изменение цвета стула, что, вероятно, связано с цветом введенных препаратов.
Во всех экспериментальных группах животные не проявляли беспокойства. Потребление воды и пищи не отклонялось от нормы. Каких-либо изменений
А1;Оз 1пО Се02
3 День2 ППДеньЗ ЕВ Денъ4 □ День 5
в поведении лабораторных мышей не наблюдалось, поэтому параметры поведения животных не могут быть использованы в качестве первичных критериев ранних стадий интоксикации живых организмов на-ночастицами оксидов металлов.
В процессе исследований во всех экспериментальных и контрольной группах оценку изменений морфологических параметров периферической крови и биохимических показателей сыворотки крови проводили ежесуточно. Результаты гематологических исследований периферической крови самцов мышей представлены в табл. 2 и на рис. 2, 3;
ТЮ2
А120З
гпо
СеО,
в Ч::) Л1ДС:!!..! |Д(-Ц1:Б
контроль
Рис. 4. Биохимическое исследование (активность ферментов) крови экспериментальных животных после введения испытуемых препаратов
б
А1Рз
гпо
СаОо
б
контроль
День2 шДеиьЗ и День4 □ День 5
Рис. 5. Биохимическое исследование (уровень мочевины и кре-атинина) крови экспериментальных животных после введения испытуемых препаратов
результаты биохимического анализа сыворотки крови — на рис. 4, 5.
Для всех групп животных, включая контрольную, в течение всего периода наблюдений зарегистрирован умеренный тромбоцитоз (контроль — 1025 ± 100 х 103/мм3), установленный при визуализации мазка крови (см. рис. 3). Известно, что подобные изменения клеток крови могут наблюдаться при сильном стрессе, вызванном травмой, операцией или большой кровопотерей. В данном случае необходимый объем крови для клинического исследования составлял 200 мкл, что для мыши массой примерно 30 г можно рассматривать как большую кровопотерю. Кроме того, нельзя не учитывать стрессовое воздействие на животное в результате процедуры взятия крови.
Во всех подопытных группах мышей в первые два дня введения исследуемых препаратов, а в группе оксида цинка в течение всего периода отмечено уменьшение содержания лимфоцитов (см. табл. 2). Такое явление может быть показателем начальной стадии возможного токсического процесса.
Количество эозинофилов в мазках крови находилось в пределах нормальных колебаний, что указывает на отсутствие аллергической реакции организма животных. При подсчете лейкоцитарной формулы во всех мазках крови молодые клетки (миелоциты, метамиелоциты, базофилы и плазмоциты) не выявлены (см. табл. 2). Полихромазия наблюдалась у всех экспериментальных животных.
ТЮ2. Введение мышам оксида титана ТО2 в первые три дня приводило к снижению концентрации гемоглобина, эритроцитов и уровня гематокрита (см. рис. 2). При этом средний объем эритроцитов и цветовой по-
казатель оставались в норме. Со второго по четвертый день эксперимента в анализах отмечалось уменьшение количества лейкоцитов, на протяжении всего периода наблюдался тромбоцитоз (см. рис. 3).
В сыворотке крови животных после первого введения оксида титана TiO2 (250 мкг/г животного в сутки) отмечен некоторый подъем уровня креатинина и мочевины (см. рис. 5). В дальнейшем каких-либо изменений со стороны показателей азотистого обмена не зафиксировано. На второй день наблюдался незначительный рост активности АЛТ, АСТ и спад активности ЩФ (см. рис. 4). В последующие дни исследуемые биохимические показатели крови стабилизировались.
ZnO. Низкие показатели, характеризующие красную кровь, отмечались также в течение первых 2 дней введения мышам оксида цинка, после чего нормализовались (см. рис. 2).
После введения первой дозы ZnO (250 мкг/г животного в сутки) происходило также увеличение количества тромбоцитов и лейкоцитов (см. рис. 3), а в лейкоцитарной формуле — повышение уровня моноцитов (см. табл. 2). Это отличает данный препарат от других и указывает на иммунный ответ организма на введение оксида цинка.
На протяжении всего периода наблюдений, начиная со второго дня эксперимента, введение ZnO вызывало увеличение активности аминотрансфераз и показателей азотистого обмена (см. рис. 4, 5). Увеличение ферментативной активности может свидетельствовать о потенциальном гепатотоксическом воздействии наночастиц оксида цинка, а повышение концентрации креатинина и мочевины — о возможном нарушении выделительной и фильтрационной функции почек.
А1203. При введении экспериментальным животным оксида алюминия, как и в случае приведенных выше препаратов, на всех этапах эксперимента отмечалось уменьшение концентрации гемоглобина, количества эритроцитов и уровня гематокрита (см. рис. 2). На второй день наблюдали увеличение числа тромбоцитов и падение уровня лейкоцитов. Количество лейкоцитов оставалось низким до 4-го дня (контроль — 17,6 ± 1,9 х 10 3/мм3), после чего наблюдался подъем (см. рис. 3).
Изменения биохимических показателей крови при проверке наночастиц Al2O3 зарегистрированы после введения третьей дозы препарата, что проявилось в повышении активности аминотрансфераз. Последующее введение оксида алюминия привело к незначительному увеличению активности ЩФ, белка и креатинина (см. рис. 4, 5). На пятый день эксперимента биохимические показатели крови подопытных животных нормализовались и колебались в пределах естественных физиологических норм.
Се02. Введение оксида церия CeO2 в течение 5 дней эксперимента характеризовалось разнонаправленным влиянием на основные показатели периферической крови мышей. Наиболее выраженные
а
изменения произошли на второй день. Они проявились в уменьшении количества эритроцитов, гемоглобина и гематокрита при одновременном подъеме уровней лейкоцитов и тромбоцитов (см. рис. 2, 3).
В сыворотке крови после первого введения оксида церия Се02 (250 мкг/г животного в сутки) отмечалось увеличение содержания креатинина и ЩФ. На второй день незначительно повысилась концентрация общего белка (на 17 % при контроле 50,0 ± 2,5 г/л). На третий день произошло некоторое увеличение активности аминотрансфераз, которое сохранилось до конца эксперимента (см. рис. 4).
В целом оценка морфологического состава периферической крови и биохимические исследования сыворотки крови экспериментальных животных продемонстрировали наличие первичной реакции животных на введение наночастиц оксидов металлов в первые 2-3 суток эксперимента. В основном это проявлялось в снижении концентрации гемоглобина, эритроцитов и уровня гематокрита. Подобные изменения характерны для начальной стадии развития нормохромной анемии. Кроме того, наблюдалось повышение уровней ферментативной активности АЛТ и АСТ, что может указывать на потенциальное гепатотоксическое воздействие наночастиц. К концу эксперимента (4-5-е сутки) исследуемые морфологические показатели периферической крови и биохимические анализы сыворотки крови стабилизировались и возвращались к исходному физиологическому уровню.
Таким образом, методы клинической лабораторной диагностики, такие как гематологические и биохимические исследования крови, оказались достаточно информативными (см. табл. 2, рис. 2-5) для выявления ранних стадий патологических состояний, которые могут вызывать наночастицы, например, оксидов металлов, поэтому их можно рекомендовать для первичной оценки воздействия наночастиц и наноматериалов на биосистемы. В частности, для наночастиц оксидов металлов диагностическими маркерами могут служить показатели красной крови (см. рис. 2), а также биохимические параметры, такие как активность некоторых ферментов (АЛТ, АСТ и ЩФ) и показатели азотистого обмена (креатинин, мочевина и др.) (см. рис. 4, 5).
выводы
Приведенные в настоящей работе данные подтвердили опубликованные ранее другими исследователями отдельные сведения о потенциальной токсичности наночастиц оксидов металлов для живых организмов. Это свидетельствует о необходимости разработки новых методов немедленного реагирования. Для этой цели, основываясь на полученных в данном исследовании экспериментальных результатах, в качестве биомаркеров в комплексной оценке токсического влияния высоких доз наночастич
можно рекомендовать основные параметры крови млекопитающих: экспресс-контроль периферической крови и показатели биохимического исследования сыворотки крови.
Таким образом, необходимо проведение дальнейших исследований потенциальной токсичности наиболее часто используемых наночастиц оксидов металлов, разработка и стандартизация экспресс-методов их определения в воздухе, воде и биосистемах.
литература (references)
1. Абрамян А., Беклемышев В., Вартанов Р., и др. На-нокатализаторы в топливе для транспорта. Нано без границ... // Наноиндустрия. - 2007. - Т. 4. - С. 26-28. [Abramyan A, Beklemyshev V, Vartanov R, et al. Nanocatalysts in fuel for transport. Nano without borders ... Nanoindustry. 2007;4:26-28. (In Russ).]
2. Медицинские лабораторные технологии / Под ред. А.И. Карпищенко. — СПб.: Интермедика, 2002. — Т. 2. — 600 с. [Medical laboratory technology. Ed by А. Karpishchenko. Saint Petersburg: Intermedica; 2002;2:600 р. (In Russ).]
3. Методические указания МУ 1.2.2520-09. 1.2. Гигиена, Токсикология, Санитария. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. — М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотреб-надзора, 2009. [Methodical instructions MU 1.2.2520-09. 1.2. Hygiene, Toxicology, Sanitation. Toxicological and hygienic safety evaluation of nanomaterials. Moscow: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of Rospotrebnadzor; 2009. (In Russ).]
4. Методические указания МУ 1.2.2635-10. 1.2. Гигиена, Токсикология, Санитария. Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов. — М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Рос-потребнадзора, 2010. [Methodical instructions MU 1.2.2635-10. 1.2. Hygiene, Toxicology, Sanitation. Medico-biological safety assessment of nanomaterials. Moscow: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of Rospotrebnadzor; 2010. (In Russ).]
5. Общая токсикология: руководство для врачей / Под ред. А.О. Лойта. — СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2006. — 224 с. [General toxicology: a guide for physicians. Ed. by A.O. Loit. Saint Petersburg: ELBI Saint Petersburg; 2006. 224 p. (In Russ).]
6. Петрицкая Е.Н., Рогаткин Д.А., Абаева Л.Ф., и др. К вопросу о влиянии наночастиц диоксида титана на внутренние органы при пероральном введении у эк-периментальных животных // Нанотехника. — 2012. — Т. 2. — С. 84-86. [Petritskаyа Е, Rogatkin D, Abaeva L, et al. To the question about the influence of titanium dioxide nanoparticles on the internal organs when oral administration in an experimental animals. Nanotechnics. 2012;2:84-86. (In Russ).]
7. Прогноз научно-технологического развития России: 2030. Новые материалы и нанотехнологии / Под ред.
Л.М. Гохберга, А.Б. Ярославцева. — М.: Министерство образования и науки Российской Федерации, Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики», 2014. — 52 c. [Forecast of scientific and technological development of Russia: 2030. New materials and nanotechnology. Ed by L. Gokhberg, A. Yaroslavtsev. Moscow: The Ministry of education and science of the Russian Federation, National Research University "Higher School of Economics"; 2014. 52 p. (In Russ).]
8. Проданчук Н.Г., Балан Г.М. Нанотоксикология: состояние и перспективы исследований // Современные проблемы токсикологии. — 2011. — № 3-4. — С. 11-27. [Prodanchuk N, Balan G. Nanotoxicology: status and prospects of research. Modern problems of toxicology. 2011;4:11-27. (In Russ).]
9. Шабанова Н.А., Попов В.В., Саркисов П.Д. Химия и технология нанодисперсных оксидов. — М.: ИКЦ Академкнига, 2007. — 309 с. [Shabanova N, Popov V, Sarkisov PD. Chemistry and technology of nanodispersed oxides. Moscow: Academkniga; 2007: 309 p. (In Russ).]
10. Энциклопедия клинических лабораторных тестов / Под ред. Н. Тица. — М.: Лабинформ, 1997. — 960 c. [Encyclopedia of clinical laboratory tests. Ed by N. Tietz. Moscow: Labinform; 1997. 960 р. (In Russ).]
11. Albanese A, Tang PS, Chan WC. The effect of nanoparticle size, shape, and surface chemistry on biological systems. Annu Rev Biomed Eng. 2012;14:1-16. doi: 10.1146/ annurev-bioeng-071811-150124.
12. A review of the scientific literature on the safety of nanoparticulate titanium dioxide or zinc oxide in sunscreens. Australian government/OTC Medicines Section/Therapeutic Goods Administration. 2009. 32 p. www.tga.gov.au.
13. Bermudez E, Mangum JB, Asgharian B, et. а!. Long-term pulmonary responses of three laboratory rodent species to subchronic inhalation of pigmentary titanium dioxide. ToxicolSci. 2002;70(1):86-97.
14. Brayner R. The toxicological impact of nanoparticles. Nano Today. 2008;3(1-2):48-55. doi:10.1016/S1748-0132(08)70015-X.
15. Friends of the Earth, Nanomaterials, Sunscreens and Cosmetics: Small Ingredients, Big Risks/ Soil Association first organisation in the world to ban nanoparticles -potentially toxic beauty products that get right under your skin. Soil Association Press Release. 2008.
16. Gurr JR, Wang AS, Chen CH, Jan KY. Ultrafine titanium dioxide particles in the absence of photoactivation can induce oxidative damage to human bronchial epithelial cells. Toxicology. 2005;213(1-2):66-73.
17. Hassellov M, Readman JW, Ranville JF, Tiede K. Nanoparticle Analysis and Characterization Methodologies in Environmental Risk Assessment of Engineered Nanoparticles. Ecotoxicology. 2008;17(5):344-361. doi: org/10.1007/s10646-008-0225-x.
18. Hoet PH, Bruske-Hohlfeld I, Salata OV. Nanoparticles — known and unknown health risks. j Nanobiotechnology. 2004;2(1):12.
19. Jeng HA, Swanson J. Toxicity of metal oxide nanoparticles in mammalian cells. j of Environmental Science and Health. Part A. 2006;41(12):2699-2711.
20. Jiang J, Oberdrster G, Elder A, et al. Does nanoparticle activity depend upon size and crystal phase? Nanotoxicology. 2008;2(1):33-42.
21. Jonaitis TS, Card JW, Magnuson B. Concerns regarding nano-sized titanium dioxide dermal penetration and toxicity study. Toxicology Letters. 2010;192(2):268-269. doi: 10.1016/j.toxlet.2009.10.007.
22. Kahru A, Dubourguier HC, Blinova I, et al. Biotests and Biosensors for Ecotoxicology of Metal Oxide Nanoparticles: A Minireview. Sensors. 2008;8:5153-5170. doi: 10.3390/s8085153.
23. Lewinski N, Colvin V, Drezek R. Cytotoxicity of Nanoparticles. Small-journal. 2008;4(1):26-49. doi: 10.1002/smll.200700595.
24. Oberdörster G, Elder A, Rinderknecht A. Nanoparticles and the Brain: Cause for Concern? j Nanosci Nanotechnol. 2009;9(8):4996-5007. doi: 10.1166/jnn.2009.gr02.
25. Oberdörster G, Maynard A, Donaldson K, et. al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Part. and Fibre Toxicology. 2005;2:8. doi: 10.1186/1743-8977-2-8.
26. Oberdörster G, Oberdörster E, Oberdörster J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles. Environ Health Perspect. 2005;113(7):823-839.
27. Oberdörster G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. j Internal Medic. 2010;267(1):89-105.
28. Ostiguy C, Soucy B, Lapointe G, et al. Health Effects of Nanoparticles-Second Edition, Studies and Research Projects. Report R-589. Montréal, IRSST. 2008. 114 p.
29. Panyala N, Pena-Mendez E, Havel J. Silver or silver nanoparticles: a hazardous threat to the environment and human health? j Appl Biomed. 2008;6:117-129.
30. Park B, Donaldson K, Duffin R, et al. Hazard and risk assessment of a nanoparticulate cerium oxide-based diesel fuel additive — a case study. Inhalation Toxicology: International Forum for Respiratory Research. 2008; 20(6):547-566. doi: 10.1080/08958370801915309.
31. Patil S, Reshetnikov S, Haldar MK, et al. Surface-derivatized nanoceria with human carbonic anhydrase II inhibitors and fluorophores: a potential drug delivery device. jPhys Chem. 2007;111:8437-8442.
32. Sahoo SK, Parveen S, Panda JJ. The present and future of nanotechnologyin human health care. Nanomedicine: Nanotechnolog, Biology and Medicine. 2007;3(1):20-31.
33. Shang L, Nienhaus K, Nienhaus G. Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters. j Nanobiotechnology. 2014;12(5):1-11. doi: 10.1186/1477-3155-12-5.
34. Wang J, Sanderson B, Wang H. Cyto- and genotoxicity of ultrafine TiO2 particles in cultured human lymphoblastoid cells. Mutat Res. 2007;628(2):99-106.
35. Withdrawal assessment report for Sinerm. Report EMEA. CHMP London. 11527. 2008.
36. Yoo JW, Irvine DJ, Discher DE, Mitragotri S. Bio-inspired, 38. http://www.edobavkam.net/e171.html. bioengineered and biomimetic drug delivery carriers. Nat Rev 39. http://www.tallevast.info/pdfs/102006tallevastinfoWEB.pdf. DrugDiscov. 2011;10(7):521-535. doi: 10.1038/nrd3499. 40. http://www.ukfoodguide.net/e171.htm.
37. http://abercade.ru/research/analysis.
♦ Информация об авторах
Орхан Ахмедович Зейналов — канд. биол. наук, главный специалист ООО «НПК«СКиФФ». E-mail: office@skiff-pharm.ru.
Светлана Петровна Комбарова — канд. биол. наук, старший научный сотрудник ООО «НПК«СКиФФ». E-mail: kombarsv@rambler.ru.
Дмитрий Владимирович Багров — канд. физ.-мат. наук, научный сотрудник кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. E-mail: dbagrov@gmail.ru.
Мария Анатольевна Петросян — канд. биол. наук, старший научный сотрудник гр. фармакологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродук-тологии им. Д.О.Отта». E-mail: mariya@labpharm.spb.ru.
ГулрухсорХайбуллоевна Толибова — канд. мед. наук, старший научный сотрудник лаб. клеточной биологии отдела патомор-фологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О.Отта». E-mail: gulyatolibova@yandex.ru.
Алексей Валерьевич Феофанов — д-р биол. наук, профессор кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. E-mail: avfeofanov@yandex.ru.
Константин Вольдемарович Шайтан — д-р физ.-мат. наук, профессор кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. E-mail: shaytan49@yandex.ru.
♦ Information about the authors
Orkhan A. Zeinalov — PhD, Chief Specialist, Research and Production Company "SK&FF" Ltd. E-mail: office@skiff-pharm.ru.
Svetlana P. Kombarova — PhD, Senior Researcher, Research and Production Company «SK&FF» Ltd. E-mail: kombarsv@rambler.ru.
Dmitry V. Bagrov — PhD, Researcher at the Department of Bioengineering, Lomonosov Moscow State University. E-mail: dbagrov@gmail.ru.
Mariya A. Petrosyan — PhD, Senior Researcher at the Laboratory of Pharmacology D.O.Ott Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology. E-mail: mariya@labpharm.spb.ru.
GulrukhsorH. Tolibova — PhD, MD, Senior Researcher at the Laboratory of Cell Biology, Department of Pathomorphology, D.O.Ott Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology. E-mail: gulyatolibova@yandex.ru
Alexey V. Feofanov — Dr. Sci., Professor at the department of bioengineering, Lomonosov Moscow State University. E-mail: avfeofanov@yandex.ru.
Konstantin V. Shaitan — Prof., Dr. Sci., Professor at the department of bioengineering, Lomonosov Moscow State University. E-mail: shaytan49@yandex.ru.
