CC BY
20
УДК 619:579.62;619:577.27
ОЦЕНКА РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТОВ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ МОРСКИХ СВИНОК АТИПИЧНЫМИ МИКОБАКТЕРИЯМИ
МЯСОЕДОВ Ю.М.,
кандидат биологических наук, ФКП «Курская биофабрика»; e-mail: [email protected].
Реферат. Нетуберкулезные микобактерии характеризуются широким распространением во всем мире. Частота выделения атипичных микобактерий, в различных климатических зонах зависит от многих факторов. Нетуберкулёзные микобактерии, обитая в окружающей среде, колонизируют организм млекопитающих, что сопровождается иммунологическими изменениями. В свою очередь иммунные изменения затрудняют проведение аллергической диагностики туберкулёза. Так, например, введение ППД туберкулина для млекопитающих, при осуществлении плановых диагностических исследований у таких животных может сопровождаться развитием кожной аллергической реакции. Это приводит к вынужденному убою животных, проведению комплекса лабораторных исследований. В связи с этим изучение биологических свойств атипичных микобактерий является актуальной задачей. В настоящее время накоплено большое количество экспериментального материала по изучению биологических свойств нетуберкулёзных микобактерий. При этом условия развития состояния повышенной чувствительности замедленного типа (ПЧЗТ) и виды атипичных микобактерий вызывающие состояние ПЧЗТ у животных изучены недостаточно.
Цель исследования - оценка сенсибилизирующих атипичных микобактерий при различных введениях морским свинкам. В результате проведенных исследований было установлено, что вариант внутри-кожного введения микобактерий M. intracellulare, M. scrofulaceum и M. fortuitum в дозе 1 мг характеризуется большей чувствительностью в сравнении с вариантом подкожного введения микобактерий в дозе 1 мг. Вариант внутрикожного введения микобактерий в дозе 1 мг сопоставим с вариантом подкожного введения микобактерий в дозе 5 мг. Кроме того, показано, что вариант предполагающий внутрикожное введение микобактерий 2, 3 и 4 групп по классификации Раньена, в дозе 1 мг может быть использован при оценке сенсибилизирующих свойств штаммов атипичных микобактерий.
Ключевые слова: атипичные микобактерии, доза микобактерий, чувствительность, морские свинки, сенсибилизация, повышенная чувствительность замедленного типа.
ASSESSMENT OF VARIOUS OPTIONS FOR SENSITIZING GUINEA PIGS WITH ATYPICAL MYCOBACTERIA
MYASOEDOV Y.M.,
Candidate of Biology Sciences, Kursk biofactory; е-mail: [email protected].
Essay. Non-tuberculosis mycobacteria are characterized by a wide spread throughout the world. The frequency of allocation of atypical mycobacteria in different climatic regions depends on many factors. Non-tuberculosis mycobacteria, inhabited in the environment, colonize the mammalian organism, which is accompanied by immunological changes. In turn, these immune changes make it difficult to conduct an allergic diagnosis of tuberculosis. For example, the introduction of PPD tuberculin for mammals, in the implementation of routine diagnostic studies in such animals may be accompanied by the development of a skin allergic reaction. This leads to forced slaughter of animals, the conduct of a complex of laboratory studies. In connection with this, the study of the biological properties of atypical mycobacteria is an urgent task.
Currently, there is a large number of studies on the biological properties of non-tuberculosis mycobacteria. At the same time, the conditions for the development of the state of delayed type hypersensevity (DTH) and the types of atypical mycobacteria that cause the condition of DTH in animals have not been studied enough. The aim of the study was to evaluate various variants of sensitization of guinea pigs with atypical mycobacteria in the study of their sensitizing properties. As a result of the conducted studies it was found that the variant of intradermal administration of M. intracellulare, M. scrofulaceum and M. fortuitum at a dose of 1 mg is more sensitive in comparison with the variant of subcutaneous injection of mycobacteria in a dose of 1 mg. The variant of intradermal administration of mycobacteria in a dose of 1 mg is comparable to the variant of subcutaneous injection of mycobacteria in a dose of 5 mg. In addition, it was shown that the variant involving intracutaneous introduction of mycobacteria of 2, 3 and 4 groups according to Ranyon classification, at a dose of 1 mg can be used in evaluating the sensitizing properties of strains of atypical mycobacteria.
Key words: Non-tuberculosis mycobacteria, doze of mycobacterium, sensitivity, guinea pig, sensitization, delayed type hypersensitivity.
Введение. Атипичные микобактерии, являясь сапрофитными микроорганизмами, широко распространены во всем мире, они колонизируют не только объекты внешней среды, но и животные организмы. Распространенность нетуберкулёзных микобактерий и частота их выделения от животных, в различных климатических зонах, варьируют в широких пределах. Несмотря на большое количество публикаций, по изучению биологических свойств нетуберкулёзных микобактерий, до настоящего времени все условия сенсибилизации животных нетуберкулёзными микобактериями не известны [1]. Так, в одном из исследований [2] упоминается, что нетуберкулёзные микобактерии обнаруживаются на разных объектах внешней среды (в том числе и кормах), что вероятнее всего является причиной контаминации ими животных. При этом под влиянием неблагоприятных внешних условий и последующих изменений физиологических параметров организма, развивается сенсибилизация. При возникновении подобной ситуации, для дифференциации нетуберкулёзных микобактерий от патогенных представителей, необходим комплекс лабораторных исследований, в том числе оценка сенсибилизирующих свойств. В стране, согласно «Наставления по диагностике туберкулёза» [3] при изучении сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий используются морские свинки, которым подкожно инъецируется исследуемая культура в дозе 1мг/см3. По истечении 3-4 недель проводится дифференциальное аллергическое исследование с использованием КАМ и ППД для млекопитающих, по выраженности кожной реакции ПЧЗТ.
Вместе с тем опыт, накопленный разными авторами, свидетельствует, что используемая дозировка микобактерий (1 мг, подкожно) у морских свинок не обеспечивает развития состояния ПЧЗТ. В связи с этим, для оценки сенсибилизирующих свойств, разными авторами предложено увеличение дозировки атипичных микобактерий.
Так в исследованиях [4] было продемонстрировано, что при оценке сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий дозировка должна быть не менее 5 мг. При этом схема двукратного введения морским свинкам микобакте-рий в дозе 5 мг и интервалом 14 суток, предпочтительнее схемы однократной инъекции в указанной дозировке.
Авторами исследования [5] при оценке сенсибилизирующих свойств нетуберкулёзных мико-бактерий на морских свинках предложено использовать дозировку до 10 мг/см3. Другой исследовательской группой рекомендовано применение дозы до 10 -20 мг/см3 [6].
Очевидно, что в цитированных исследованиях описываются разные варианты биологической модели микобактериозов с использованием морских свинок и варьирования дозировки микобактерий,
что позволяет дать исчерпывающий ответ о сенсибилизирующих свойствах изолятов атипичных микобактерий. Вместе с тем, вариантом биологической модели позволяющей определить сенсибилизирующие свойства атипичных микобактерий могут быть обусловлены местом их введения. Так известно, что при иммунизации человека против туберкулёзной инфекции используются микобак-терии M. bovis BCG инъецируемые внутрикожно. Данный подход позволяет не только снизить частоту поствакцинальных осложнений, но и обеспечить длительность нестерильного иммунитета [7]. Подобный результат при использовании микобак-терий M. bovis BCG был продемонстрирован в опытах и на морских свинках [8, 9].
Очевидно, что по аналогии с микобактериями бычьего вида введение атипичных микобактерий внутрикожно может обеспечить развитие состояния ПЧЗТ требуемого уровня, но при использовании минимального количества атипчных микобак-терий. Принимая во внимание вышеизложенное, целью исследования была оценка различных вариантов сенсибилизации морских свинок атипичными микобактериями 2, 3 и 4 групп по классификации Раньена.
Материал и методика исследования. В исследовании использовали 18 морских свинок, массой 500±100 г. Животных содержали в вольерах, на стандартном рационе кормления, с использованием гранулированного корма. Животных, по принципу аналогов распределили в 6 групп (по 3 головы в каждой). Для оценки сенсибилизирующих свойств использовали следующие микобактерии: M. scrofulaceum штамм N- 12 C (2 группа по классификации Раньена); M. intracellulare штамм S- 13 N (3 группа по классификации Раньена); M. fortuitum штамм 18023 (4 группа по классификации Раньена). Микобактерии выращивали на питательной среде Павловского 25 суток при 37°С. По истечении перечисленного периода на физиологическом растворе, были приготовлены варианты суспензии с различным содержанием микобакте-рий: 1мг/см3, 5мг/см3, 1мг/0,1см3.
В работе были использованы следующие ми-кобактериальные аллергены:
- туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих, стандартный раствор, (производство ФКП «Курская биофабрика»);
- аллерген сухой очищенный из атипичных микобактерий (КАМ), (производство ФКП «Курская биофабрика»).
Из указанных препаратов готовили рабочие разведения: ППД для млекопитающих 5 МЕ [8], КАМ 10 ЕД. в 0,1 см3 физиологического раствора. Препараты инъецировали морским свинкам в де-пилированные участки кожи, внутрикожно, учёт реакции осуществляли через 24 и 48 часов после введения.
Таблица 1 - Интенсивность реакции на внутрикожное введение 5 МЕ ППД для млекопитающих и 10 ЕД. КАМ в группах морских свинок сенсибилизированных разными дозами M. intracellulare, M. scrofЫaceum и M. Fortuitum
Доза № Сенснонлнзащня
мнко- мор- М. intracellulare М. 5сю: ulaceum М. fortuitum
бакге- ской учёт ч /з24ч учёт ч з48ч учёт ч /з24ч учёт ч з45ч учёт ч /з24 ч учёт ч з 48 ч
рнн СБННКН KAM ШЦ KAM ШЛ KAM ШИ KAM ППД KAM ТШ KAM ППД
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1мг 2 10,5 0 10,0 0 9,5 0 0 0 0 0 0 0
3 12,0 0 12,5 0 10,5 0 14,0 0 0 0 0 0
f - 0,67 0 0,67 0 0,67 0 0,33 0 0 0 0 0
1 16,5 7,0 17,5 0 13,0 0 14,5 0 10,0 0 11,0 0
1мг* 2 17,0 9,0 16,5 3,5 15,5 0 15,0 0 10,5 0 11,0 0
3 15,0 0 15,5 0 22,5 8,0 20,5 9,0 11,0 0 10,5 0
f - 1 0,67 1 0,33 1 0,33 1 0,33 1 0 1 0
1 14,0 0 15,5 0 13,0 0 13,0 0 10 0 10 0
5 мг 2 В,0 0 13,0 0 14,0 0 13,5 0 10,5 0 10 0
3 13,0 0 13,0 0 17,0 9,0 15,0 0 11 0 11,5 0
f - 1 0 1 0 1 0,33 1 0 1 0 1 0
Примечание: *введение микобактерий внутрикожно.
Результаты исследования. Для моделирования ПЧЗТ на морских свинках, при использовании M. bovis и M. tuberculosis достаточно несколько бактериальных клеток и, несмотря на развитие каскада иммунных противомикробных реакций организма, микобактерии внутри макрофагальных клеток реплицируются. Вместе с тем для получения модели микобактериальной инфекции при использовании нетуберкулёзных микобактерий дозировка должна быть на несколько порядков выше, в сравнении с вариантом предполагающем использование патогенных микобактерий.
Учитывая вышеизложенное, при осуществлении настоящих исследований, были использованы следующие дозировки микобактерий: 5 мг, подкожно (как минимальная, обеспечивающая при внутрикожном введении развития состояния ПЧЗТ); 1 мг подкожно (согласно «Наставления по диагностике туберкулёза животных»); 1 мг внут-рикожно (по аналогии с вакцинацией вакциной БЦЖ).
Варианты предполагающие подкожное введение микобактерий в дозах 1 и 5 мг являлись вариантами сравнения со способом предусматривающем внутрикожное введение микобактерий в дозе 1 мг.
При осуществлении исследования оценивались следующие показатели: наличие реакции (<5 мм папула и /или эритема); частота проявления реакции.
Результаты изучения сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий M. intracellularae, M. scrofulaceum и M. fortuiutm, при использовании различных дозировок, и путей введения в организм лабораторных животных, представлены в таблице 1.
Данные, полученные в группах животных сенсибилизированных разными видами атипичных микобактерий, при использовании не одинаковых доз и путей введения демонстрируют различия.
Так вариант предполагающий подкожное введение микобактерий M. intracellulare и M. scrofulaceum в дозе 1 мг/см3 характеризуется развитием кожной реакции ПЧЗТ у двух из трех животных только на КАМ. В группе животных подкожно сенсибилизированной M. fortuitum в дозе 1 мг/см3 кожная реакция ПЧЗТ на 10 ЕД. КАМ и 5 МЕ ППД для млекопитающих не выявлена.
Вариант, предполагающий внутрикожное введение атипичных микобактерий в дозе 1 мг/см3, отличается от варианта предполагающего подкожное введение микобактерий в дозе 1 мг. Так у всех животных сенсибилизированных M. intracellulare, M. scrofulaceum и M. fortuitum аллергическая реакция на 10 ЕД. КАМ была выражена. Вариант, предусматривающий подкожное введение атипичных микобактерий в дозе 5 мг характеризовался проявлением аллергической реакции на КАМ во всех группах животных, что предполагает возможность его использования при изучении сенсибилизирующих свойств.
Из полученных данных видно, что вариант сенсибилизации морских свинок с использованием дозировки 5 мг характеризовался сопоставимыми значениями частоты и интенсивности ПЧЗТ на КАМ с вариантом предполагающем внутрикожное введение атипичных микобактерий в дозе 1 мг. Полученные результаты позволяют оценить вариант внутрикожного введения микобактерий в дозе 1 мг как более чувствительный в сравнении предполагающими использование доз 1 и 5 мг подкожно.
Различия, полученные при использовании одинаковых доз, но разных путей введения M. intracellulare, M. scrofulaceum и M. fortuitum мико-бактерий в организм морских свинок, предполагает различие механизмов формирования реакции ПЧЗТ. Так исследованиями, проведенными при использовании микобактерий M. bovis BCG продемонстрировано, что внутрикожное введение ми-кобактерий сопровождается их быстрым захватом
клетками макрофагального ряда с последующей миграцией в регионарные лимфатические узлы. Вместе с тем подкожное введение дозы аналогичной, как и при внутрикожным введением микобак-терий характеризуется клональной селекцией большего числа супрессорных Т-клеток [2].
Вывод. Выявлено, что вариант внутрикожного введения микобактерий M. mtraceПulare, M. scrofUlaceum и M. fortuitum в дозе 1 мг характеризуется большей чувствительностью в сравнении с
вариантом подкожного введения микобактерий в дозе 1 мг. Вариант внутрикожного введения мико-бактерий в дозе 1 мг сопоставим с вариантом подкожного введения микобактерий в дозе 5 мг.
Вариант, предполагающий внутрикожное введение микобактерий 2, 3 и 4 групп по классификации Раньена в дозе 1 мг может быть использован при оценке сенсибилизирующих свойств штаммов атипичных микобактерий.
Список использованных источников
1. Найманов А.Х. Проблемы диагностики и профилактики туберкулёза крупного рогатого скота в современных условиях // Ветеринарная патология. - 2004. - № 1-2 (9). - С.18-23.
2. Принадлежность микобактерий выделяемых от крупного рогатого скота и из объектов внешней среды / Н. П. Овдиенко, В.И. Косенко, А.Х. Найманов и др. // Проблемы туберкулёза. - 1990. - № 1. - С. 46-48.
3. Наставление по диагностике туберкулёза животных. Утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 18 ноября 2002 г. - М., 2002. - 63 с.
4. Экспериментальные данные по изучению сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий и близкородственных бактерий Nocardia и Rodococcus / А.Х. Найманов, Г.И. Устинова, Н.Г. Толстенко и др. // Ветеринария и кормление. - 2015. - № 6. - С. 11-13.
5. Оттен Т.Ф., Васильев А.В. Микобактериоз.- Санкт-Петербург, 2005. - 218 с.
6. Новый способ определения сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий / Н.Н. Кошеев, В.Ф. Бордюг, В.Г. Ощепков и др. // Инфекционная патология животных. - Омск, 2011. - С. 102-105.
7. Кошечкин В.А., Иванова З.А. Туберкулёз: учебное пособие. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 302 с.
8. Мясоедов Ю.М. Сравнительный анализ критериев формирования групп морских свинок используемых для моделирования реакций гиперчувствительности замедленного типа // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. - № 7. - С. 66-67.
9. Оптимальная диагностическая доза ППД туберкулина для млекопитающих в международных единицах (МЕ) при биологической пробе на лабораторных животных / Ю.М. Мясоедов, В.М. Безгин, В.Е. Козлов, А.Х. Найманов // Ветеринария и кормление.- 2016. - № 6. - С. 35-37.
List of sources used
1. Naimanov A.Kh. Problems of diagnostics and prevention of tuberculosis of cattle in modern conditions // Veterinary pathology. - 2004. - No. 1-2 (9). - С.-18-23.
2. The belonging of mycobacteria isolated from cattle and from objects of the environment / N.P. Ovdienko, V.I. Kosenko, A.Kh. Naimanov et al. // Problems of tuberculosis. - 1990. - No. 1. - P. 46-48.
3. Manual on the diagnosis of tuberculosis of animals. Approved by the Veterinary Department of the Ministry of Agriculture of the Russian Federation on November 18, 2002 - M., 2002. - 63 p.
4. Experimental data on the sensitizing properties of atypical mycobacteria and closely related bacteria Nocardia and Rodococcus / A.Kh. Naymanov, G.I. Ustinova, N.G. Tolstenko and others // Veterinary medicine and feeding. - 2015. - No. 6. - P. 11-13.
5. Otten T.F., Vasiliev A.V. Mycobacteriosis. - St. Petersburg, 2005. - 218 p.
6. A new way to determine the sensitizing properties of atypical mycobacteria / N.N. Kosheev, V.F. Bordyug, V.G. Oschepkov et al. / Infectious pathology of animals. - Omsk, 2011. - P. 102-105.
7. Koshechkin V.A., Ivanova Z.A. Tuberculosis: a study guide. - Moscow: GEOTAR-Media, 2007. - 302 p.
8. Myasoedov Yu.M. Comparative analysis of the criteria for the formation of groups of sea pigs used to model delayed-type hypersensitivity reactions // Bulletin of the Kursk State Agricultural Academy. - 2013. - No. 7. - P. 66-67.
9. Optimal diagnostic dose of tuberculin PPD for mammals in international units (ME) at a biological test on laboratory animals / Yu.M. Myasoedov, V.M. Bezgin, V.E. Kozlov, A.Kh. Naimanov // Veterinary Medicine and Feeding. - 2016. - No. 6. - P. 35-37.
