CC BY
12
УДК 619:579.62;577.27
ИЗУЧЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБОВ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ МОРСКИХ СВИНОК МИКОБАКТЕРИЯМИ M. AVIUM ДЛЯ ОЦЕНКИ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ППД ТУБЕРКУЛИНОВ
МЯСОЕДОВ Ю.М.,
кандидат биологических наук, ФКП «Курская биофабрика»; e-mail: [email protected].
Реферат. Эффективность начального этапа выявления животных и птицы инфицированных патогенными ми-кобактериями определяет аллергическая проба, с использованием ППД туберкулинов. Основными параметрами качества ППД туберкулинов, определяющими диагностическую ценность являются биологическая активность и специфичность. Данные параметры оцениваются на биологических моделях - сенсибилизированных морских свинках. Поэтому МЭБ и ВОЗ разработаны требования к методам определения биологической активности и специфичности. Одним из требований является моделирование туберкулёзного процесса низкой интенсивности. Требуемая интенсивность микобактериальной инфекции зависит от нескольких факторов, таких как вид микобакте-рий, доза и путь введения в организм. При этом, нормативная документация регламентирует вид и путь введения патогена в организм, в от время как диапазон дозировок является широким. Для воспроизведения микобактериаль-ной инфекции при использовании M. tuberculosis и M. bovis требуется введение десятых долей миллиграмма мико-бактерий, в то время как для воспроизведения инфекции M. avium дозировка должна быть несколько миллиграмм. Вместе с тем известно, что применение больших доз микобактерий при иммунизации животных может сопровождаться иммунодепрессией. Поэтому определение варианта с пониженной антигенной нагрузкой, обеспечивающего требуемый уровень интенсивности аллергической реакции у инфицированных животных, в рамках установленных нормативной документацией является актуальным.Учитывая вышеизложенное, целью исследования было: подбор оптимального варианта сенсибилизации морских свинок микобактериями M. avium для контроля иммунобиологических параметров ППД туберкулинов. В результате проведенных исследований было выявлено, что использование внутрикожного введения микобактерий характеризуется большей чувствительностью, в сравнении с применением внутримышечного введения. Биологическая модель туберкулезной инфекции опосредованная использованием морских свинок инфицированных M. avium внутрикожно может быть использована при изучении иммунобиологических параметров микобактериальных аллергенов, согласно требований МЭБ и ВОЗ.
Ключевые слова: микобактерии туберкулёза, аллергическая диагностика, доза, чувствительность, биологическая активность, модель, сенсибилизация.
THE STUDY OF DIFFERENT WAYS OF SENSITIZATION GUINEA PIGS OF MYCOBACTERIUM M. AVIUM TO ASSESS IMMUNOLOGICAL PARAMETERS PPD TUBERCULINS
MYASOEDOV Y.M.
Candidate of Biology Sciences, Kursk biofactory; e-mail: [email protected].
Essay. The efficiency of the initial stage detection of infected pathogenic mycobacterium's a animals and birds determines allergic test using PPD tuberculins. Main parameters of the quality of PPD tuberculin determining the diagnostic value are the biological activity and specificity. These parameters are evaluated on biological models - sensitized Guinea pigs. Therefore OIE and WHO have develop requirements for methods for determining biological activity and specificity. One of the requirements is modeling of low-intensity tuberculosis process. The required intensity of Mycobacterium infection depends on several factors, such as the species of Mycobacterium, dose and route of administration. Type and way of introduction of mycobacteria in an organism of animals is defined by normative documentation. In this case, the dose of the causative agent can vary widely. Modeling M. tuberculosis and M. bovis infection requires tenths of a milligram, while for M. avium infection, the dosage should be a few milligrams. However, it is known that the use of high doses of mycobacte-ria in animal immunization can be accompanied by immunosuppression. Therefore, determining the variant with reduced antigenic load, providing the required level of intensity of allergic reaction in infected animals, within the framework of the established normative documentation is relevant. The aim of the study was the selection of optimal variant of sensitization of Guinea pigs with mycobacteria M. avium for control of immunobiological parameters PPD tuberculins. As a result of the research it was revealed that the use of intradermal administration of mycobacteria is characterized by greater sensitivity, compared with the use of intramuscular administration. Biological model of tuberculosis infection mediated by the use of Guinea pigs infected with M. avium can be used in the study of immunobiological parameters of Mycobacterium allergens, according to the requirements of OIE and WHO.
Key words: mycobacterium tuberculosis, allergic diagnostic, a doze, sensitivity, biological activity, model, a sensitization.
Введение. Аллергическая проба, с использованием ППД туберкулинов определяет результативность начального этапа выявления инфицированных патогенными микобактериями и больных туберкулёзом животных и птицы [1]. Основными показателями качества микобактериальных аллергенов, от которых зависят результаты аллергического исследования, являются
биологическая активность и специфичность [2, 3]. МЭБ и ВОЗ разработаны требования к методам определения биологической активности и специфичности туберкулиновых аллергенов. Например, при сенсибилизации морских свинок живыми микобактериями, дозировка должна обеспечивать развитие состояния повышенной чувствительности замедленного типа (ПЧЗТ), без про-
явления острого туберкулёзного процесса [4]. При этом, для моделирования вялотекущей микобактери-альной инфекции обусловленной M. tuberculosis или M. bovis достаточно десятых долей миллиграмма микобак-терий, в то время как для воспроизведения инфекционной патологии с использованием М. avium дозировка должна составлять несколько миллиграмм [4, 5, 6].
Вместе с тем известно, что иммунизация животных большим дозами микобактерий, может сопровождаться иммунодепрессией [7]. В связи с этим, определение оптимальной дозы, обеспечивающей требуемый уровень интенсивности аллергической реакции и не сопровождающейся иммунодепрессорным действием, является актуальным.
Учитывая вышеизложенное целью исследования было: подбор оптимальной дозы и пути введения мико-бактерий птичьего вида морским свинкам, при моделировании микобактериальной инфекции, для контроля иммунобиологических параметров ППД туберкулинов.
Материал и методика исследования. В исследованиях было использовано 80 голов беспородных самок морских свинок, массой 500±100 г., одновременно полученных из ФГБУН НЦБМТ ФМБА России, филиал «Андреевка». Животных содержали в вольерах, на стандартном рационе кормления, с использованием гранулированного корма. Животных, перед осуществлением исследований, распределили в 8 групп, по 10 голов в каждой, по принципу аналогов.
Для исключения спонтанного туберкулёза проводили тестирование морских свинок аллергическим способом, с использованием 5 МЕ ППД туберкулина для млекопитающих [1], после чего осуществляли сенсибилизацию.
В работе были использованы микобактерии птичьего вида M. avium, штамм 2282. Биомассу микобактерий выращивали на картофельной среде Павловского, в течение 25 суток, при температуре 37°С, после чего на физиологическом растворе готовили варианты суспензии из расчёта содержания 4 мг/0,5 см3; 0,4 мг/0,1 см3; 0,2 мг/0,1 см3; 0,1 мг/0,1 см3.
Животным первой, второй и третьей групп внутри-кожно вводили M. avium, в дозах от 0,4 до 0,1 мг/0,1 см3. Морских свинок четвертой группы сенсибилизировали микобактериями птичьего вида, в заднебедренную группу мышц дозой 4 мг/0,5см3. Через 30 дней, после введения микобактерий, животные были использованы в опытах.
Оценку вариантов моделей микобактериальной инфекции осуществляли с использованием различных
разведений ППД туберкулина для птиц, контрольной серии (эквивалент Международного стандарта PPD avium) на растворителе микобактериальных аллергенов: 625 МЕ, 125 МЕ, 25 МЕ, 5 МЕ, 1 МЕ, 0,2 МЕ в 0,1 см3. Критериями оценки вариантов служили: интенсивность ПЧЗТ и частота проявления аллергической реакции.
Статистическую обработку результатов экспериментов проводили общепринятыми методами, рассчитывая среднее арифметическое, ошибку среднего арифметического, стандартное отклонение [8]. Кроме того, оценку вариантов туберкулёзной инфекции осуществляли по величине биологической активности ППД для птиц, рассчитывая: R, LgR, доверительный интервал [2].
Результаты исследования. Интенсивность туберкулёзного процесса определяется множеством факторов, например дозой возбудителя и местом введения патогена в организм животного. При этом количество вариантов биологической модели при использовании только двух переменных может достигать больших цифровых значений. Поэтому, при планировании настоящего исследования был использован алгоритм, реализованный ранее, при разработке и последующей оценке биологических моделей обусловленные использованием M. bovis [9].
Исследование предполагало три последовательных этапа. При реализации первого этапа был определён оптимальный вариант модели туберкулёзной инфекции. При осуществлении второго этапа была проведена оценка биологической активности ППД для птиц на группе морских свинок сенсибилизированных ранее определённой дозой. При осуществлении третьего этапа была оценена возможность использования разработанной модели, через длительный промежуток времени (12 месяцев).
На первом этапе исследования были использованы 4 группы морских свинок. Животным трех групп внут-рикожно инъецировали различное количество микобактерий туберкулёза птичьего вида. Контрольным вариантом являлась группа морских свинок, сенсибилизированная микобактериями M. avium внутримышечно, в дозе 4 мг. Данный вариант модели туберкулёзной инфекции был разработан ранее, и в течение нескольких десятилетий используется при контроле микобактери-альных аллергенов [10]. Результаты исследования представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Чувствительность вариантов моделей микобактериальной инфекции M. avium
Доза туберкулина, МЕ Вариант и доза сенсибилизации морских свинок
0,1 мг/0,1 см3, в/к 0,2 мг/0,1 см3г, в/к 0,4 мг/0,1 см3, в/к 4 мг/0,5 см3, в/м
1 группа (n=10) 2 группа(n=10) 3 группа (n=10) 4 группа(n=10)
M±m f M±m f M±m f M±m f
625 15,5±0,66* 1 17,0±0,65* 1 22,0±0,60* 1 19,25±0,70 1
125 14,5±1,33* 1 15,0±1,20* 1 18,5±1,40 1 18,5±0,80 1
25 8,5 0,8 10,5±0,89* 1 17,0±0,80 1 16,0±1,22 1
5 6,5 0,4 10,0±0,5* 1 15,5±0,90 1 14,5±0,80 1
1 0 0 8,0±0,4* 1 9,0±0,77 1 10,5±0,90 1
0,2 0 0 0 0 0 0 0 0
Примечание: *Разница достоверна при р< 0,05
Таблица 2 - Биологическая активность ППД для птиц на группе морских свинках внутрикожно сенсибилизированных микобактериями птичьего вида в дозе 0,4 мг/0,1см3, через 1 месяц после введения микобактерий_
Вариант инфицирования M. avium морских свинок
Номер морской свинки внутрикожно (доза 0,4 мг) внутримышечно (доза 4 мг)
Туберкулины Туберкулины
испытуемый контрольный испытуемый контрольный
дозы, МЕ дозы, МЕ
125 25 5 125 25 5 125 25 5 125 25 5
M±m OS 4, ,0 -н OS с-"4 4 <о -н г- ,4 0 <о -н г- 0 с-, <о -н СП с-"4 <о -н 0, ,4 сп <о -Н сп \о СП, ,0 -Н 00 СП, с-"4 <о -н 00 сп" 3 <о -н 4, ,0 0 <о нн 3 <о -н 00 сп, ,4 2 <о -н 0, ,0
МЕ/мг 50000 53550
Д. И. * 64 %-157 % 68-148
Примечание: Д.И. - доверительный интервал (р = 0,05 при 50-200 %)
Сопоставляя интенсивность и частоту проявления реакции ПЧЗТ на различные дозы ППД для птиц, в группах морских свинок сенсибилизированных не одинаковым количеством микобактерий, выявлены различия. Так в первой группе животных, сенсибилизированных микобактериями в дозе 0,1 мг/см3, интенсивность реакции на дозы 625 и 125 МЕ (частота проявления реакции соответствует 1) достоверно ниже, в сравнении со значениями контрольной группы. При этом интенсивность реакции на дозы 25 и 5 МЕ, а также частота реакции, в сравнении с контролем ниже. Результаты исследования, полученные в первой группе морских свинок, свидетельствуют о сниженной интенсивности микобактериального процесса и нецелесообразности использования данного варианта для определения иммунобиологических параметров микобактериальных аллергенов.
Модель туберкулёзной инфекции второй группы характеризуется повышением интенсивности иммунных изменений в организме лабораторных животных, в сравнении с первой группой. Частота проявления реакции на разные дозы ППД для птиц соответствуют таковым в контроле. В свою очередь значения интенсивности кожной реакции ПЧЗТ на дозы ППД для млекопитающих достоверно ниже контрольных цифр. Таким образом, результаты, полученные в данной группе, предполагают возможность её использовать для изучения иммунобиологических свойств туберкулинов. Вместе с тем второй вариант не является эквивалентным контролю, что предполагает увеличение дозировки ми-кобактерий при сенсибилизации морских свинок.
Анализ критериев эксперимента определённые в третьей группе характеризуются эквивалентностью с таковым контрольной группы. Так интенсивность туберкулиновой реакции на различные дозировки аллергена (кроме 625 МЕ), а также частота реакции достоверно не отличаются от контрольных цифр. Таким образом, полученные результаты предполагают возможность использования внутрикожного варианта введения микобактерий в дозе 0,4 мг/0,1см3, при изучении иммунобиологических параметров ППД туберкулинов. Полученные результаты не могут быть основанием для использования варианта модели туберкулёзной инфекции третьей группы при тестировании биологических параметров ППД туберкулинов. Поэтому вторым этапом исследования было определение биологической активности ППД для птиц на модели предполагающей
использование внутрикожного введения микобактерий в пониженной дозе (0,4 мг) с вариантом, предполагающем внутримышечное введение.
Для этого были сенсибилизированы две группы морских свинок (по 10 голов в каждой) M. avium в дозе 0,4 мг/0,1см3 внутрикожно и в дозе 4 мг/0,5 см3 внутримышечно (группа сравнения). Через 30 дней, после введения микобактерий на двух группах животных определяли величину биологической активности коммерческой серии ППД для птиц, относительно контрольной серии и сопоставляли полученные значения между собой. Результаты исследования представлены в таблице 2.
Из представленных данных видно отсутствие достоверных различий в интенсивности кожной реакции ПЧЗТ, при использовании различных разведений ППД туберкулином для птиц, что указывает на равнозначность вариантов. Кроме того, величина биологической активности, в группе морских свинок иммунизированная микобактериями в дозе 0,4 мг сопоставима с результатом, полученным в контрольной группе. При этом значение доверительного интервала в различных группах морских свинок соответствует 50-200 %.
Одним из требований предъявляемым к биологическим моделям, используемым для определения иммунобиологических параметров микобактериальных аллергенов, является сохранность уровня интенсивности кожной реакции ПЧЗТ не менее 6 месяцев [3, 6]. Принимая во внимание данное обстоятельство, следующим этапом исследования была оценка интенсивности кожной реакции ПЧЗТ, а также биологической активности ППД для птиц в группах морских свинок иммунизированных микобактериями птичьего вида 0,4 мг/0,1 см и 4 мг/0,5 см3 через длительный промежуток времени (12 месяцев после введения микобактерий). Результаты эксперимента представлены в таблице 3.
Полученные результаты демонстрируют отсутствие отличий в интенсивности кожной реакции ПЧЗТ в группах морских свинок сенсибилизированных внутри-кожно в дозе 0,4 мг, а также внутримышечно в дозе 4 мг, по истечении 12 месяцев. При этом значение активности препаратов являются сопоставимыми. Таким образом, вариант модели туберкулёзной инфекции обусловленной использованием микобактерий птичьего вида в дозе 0,4 мг/0,1см3 является приемлемым для изучения иммунобиологических параметров микобак-териальных аллергенов.
Таблица 3 - Биологическая активность ППД для птиц на морских свинках внутрикожно сенсибилизированных микобактериями птичьего вида в дозе 0,4 мг/0,1 см3, через 12 месяцев после введения микобактерий_
Номер морской свинки
Вариант инфицирования M. avium морских свинок
внутрикожно (доза 0,4 мг)
туберкулины
испытуемый
125
25
Дозы, МЕ
контрольный
5
125
25
внутримышечно (доза 4 мг)
туберкулины
испытуемый
125
25
Дозы, МЕ
контрольный
5
125
25
M±m
0
t-,
,0
±
ич
4
о
± 0
(N
00 со <о
±
ич
"О,
<о
±
ич 00
о
±
о
±
ич
4
00
4,
,0
±
0
00
2 Tt-,
<о
± 5
со <о
±
0 4
о
±
ич
00
5,
<о
±
г-
о
± 0
МЕ/мг
53874
50000
_ДЖ_
61 %-163 %
75 %-133 %
0,05 при 50-200 %)
5
5
Примечание: Д.И. - доверительный интервал (р =
Вывод. Выявлено, что вариант моделирования микобактериальной инфекции на морских свинках опосредованный внутрикожным введением M. avium является более чувствительным в сравнении с внутримышечным.
Биологическая модель туберкулёзной инфекции опосредованная введением M. avium в дозе 0,4 мг внутрикожно может быть использована для оценки иммунобиологических параметров микобактериальных аллергенов, в соответствии с требованиями ГОСТ 323062013.
Список использованных источников
1. Наставление по диагностике туберкулеза животных. - М., 2002. - 63 с.
2. Фрадкин В.А. Диагностические и лечебные аллергены // М.: Медицина, 1990. - С. 52-53.
3. European Pharmacopoeia 4 th Edition 2002. Council of Europe Strasbourg. - P. 2088-2089.
4. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. 36-й доклад. Серия технических докладов 745. ВОЗ. Женева. С. 43.
5. Кассич Ю.Я. Туберкулез животных и меры борьбы с ним / Ю.Я Кассич. - Киев: Урожай, 1990. - С. 63-65.
6. Экспериментальное изучение препарата вакцины БЦЖ-М с уменьшенной нагрузкой. Проблемы туберкулеза / Т.Б. Яблокова, Н.Н. Писаренко, Д.Т. Леви. - 1985. - № 6. - P. 52-55.
7. Стефан, Х.Е. Кауфманн, Б.А. Краткая история научных работ Роберта Коха о туберкулёзе. Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. - 2003. - № 9. - С. 36-42.
8. Лакин, Г.Ф. Биометрия. - М.; Высшая школа, 1990. - 352 с.
9. Мясоедов Ю.М., Морозов С.В. Оптимизация теста определения биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2012. - № 9. - С. 71-74.
10. ГОСТ 23881-79. Туберкулин сухой очищенный (ППД) для птиц. - М.: Изд-во стандартов, 1979. - 13 с.
11. OIE Manual of Standards for Diagnostic Test and Vaccines. - 2009. - P. 359-369.
List of sources used
1. Manual on the diagnosis of tuberculosis of animals. - M., 2002. - 63 p.
2. Fradkin V.A. Diagnostic and therapeutic allergens // M.: Medicine, 1990. - P. 52-53.
3. European Pharmacopoeia 4 th Edition 2002. Council of Europe Strasbourg. - P. 2088-2089.
4. WHO Expert Committee on Biological Standardization. 36th report. Technical reports series 745. WHO. Geneva. P.
43.
5. Kassich Yu.Ya. Tuberculosis of animals and measures to combat it / Yu. I Kassich .- Kiev: Harvest, 1990. - P. 6365.
6. Experimental study of BCG-M vaccine preparation with reduced on-load. Problems of tuberculosis / TB. Yablokova, N.N. Pisarenko, D.T. Levi. - 1985. - No. 6. - P. 52-55.
7. Stefan, H.E. Kaufmann, B.A. A brief history of Robert Koch's scientific papers on tuberculosis. Problems of tuberculosis and lung diseases. - 2003. - No. 9. - P. 36-42.
8. Lakin, G.F. Biometrics. - M .; Higher School, 1990. - 352 p.
9. Myasoedov Yu.M., Morozov S.V. Optimization of the test for determining the biological activity of PPD tuberculin for mammals // Bulletin of the Kursk State Agricultural Academy. - 2012. - No. 9. - P. 71-74.
10. GOST 23881-79. Tuberculin is a dry peeled (PPD) for birds. - Moscow: Izd-vo Stan-datov, 1979. - 13 p.
11. OIE Manual of Standards for Diagnostic Test and Vaccines. - 2009. - P. 359-369.
