CC BY
43
УДК 631.521:575.21:581.45:633.111
ОЦЕНКА КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ОПУШЕНИЯ ЛИСТЬЕВ КАРТОФЕЛЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНАЛИЗА ЦИФРОВЫХ МИКРОИЗОБРАЖЕНИЙ*
А.В. ДОРОШКОВ, кандидат биологических наук, научный сотрудник
А.В. СИМОНОВ, кандидат биологических наук, научный сотрудник
А.Д. САФОНОВА, старший научный сотрудник Д.А. АФОННИКОВ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией (e-mail: [email protected])
И.Е. ЛИХЕНКО, доктор сельскохозяйственных наук, зам. директора
Н.А. КОЛЧАНОВ, академик РАН, директор Федеральный исследовательский центр «Институт цитологии и генетики СО РАН», просп. Лаврентьева, 10, Новосибирск, 630090, Российская Федерация
Резюме. С помощью методов анализа микроизображений оценены количественные характеристики опушения листьев 35 сортов картофеля. Растения выращивали в поле СибНИИРС (Новосибирская обл.) с конца мая до начала августа 2016 г. Образцы листьев собраны и обработаны 3-5 августа 2016 г. Фрагменты листа размером 1,5 х 0,5 см, взятые между жилок, вырезали в лабораторных условиях и сгибали поперек нижней поверхностью внутрь. Фиксацию фрагмента листа на предметном стекле проводили липкой лентой с отступом от края сгиба на 3 мм. Предметное стекло помещали под цифровую камеру Axiocam HRc оптического микроскопа ZEISS Axioscop 2 plus c адаптером при увеличении 0,63 в проходящем свете. Полученные изображения обрабатывали в программе LHDetect2, которая позволяет подсчитывать число трихом на изображении и оценивать длину каждой из них. Данные усредняли по 6-и фрагментам листа для одного растения. Для исследованных сортов среднее число трихом на изображении варьировало от 1 (слабо опушенные, сорта Красавчик, Импала, Брянский, Регги) до 7,3 (сильно опушенные, сорта Кемеровчанин, Великан, Танай). Среднее значение по выборке составило 2,94, величина стандартного отклонения - 1,55. Средняя длина трихом варьировала от 120150 мкм (сорта Красавчик, Сафо, Танго, Кемеровчанин) до 380 мкм (сорт Кортни). Среднее значение по выборке составило 207,39 мкм, величина стандартного отклонения - 58, 30 мкм. Значимой связи между числом трихом и их длиной у растений не обнаружено (коэффициент корреляции Пирсона составил -0,147, p<0,39).
Ключевые слова: Solanum tuberosum, трихомы, опушение листа, высокопроизводительное фенотипирования, анализ изображений.
Для цитирования: Оценка количественных характеристик опушения листьев картофеля с использованием анализа цифровых микроизображений / А.В. Дорошков, А.В. Симонов, А.Д. Сафонова, Д.А. Афонников, И.Е. Лихенко, Н.А. Колчанов// Достижения науки и техники АПК. 2016. Т.30. №10. С. 12-14.
Опушение листьев растений - один из важных признаков, который отвечает за формирование микроклимата у поверхности листа и защиту от неблагоприятных биотических и абиотических факторов среды. У картофеля Solanum tuberosum опушение листа представлено двумя типами многоклеточных трихом: трихомы типа A незначительно выступают на поверхности листа и содержат железы в виде четырех долей; трихомы типа B более длинные [1]. Показано, что опушение у картофеля - один из важных биотических факторов сопротивления растения колорадскому жуку [2]. Кроме того, растения с интенсивным опушением менее благоприятны
для размножения на них тли, основного переносчика вирусных заболеваний картофеля, и демонстрируют пониженные уровни заражения вирусами Y и L [3].
Существующие подходы к анализу опушения картофеля основаны преимущественно на визуальной оценке поверхности листа под микроскопом и подсчете числа трихом вручную [3]. Это трудоемкий процесс, который, кроме того, не позволяет оценить размеры трихом.
Цель нашей работы - проверка применимости высокопроизводительной технологии оценки количественных характеристик опушения листа картофеля (числа трихом и их длины) на основе разработанного ранее метода анализа опушения пшеницы [4], а также их описание у 35 сортов картофеля, созданных в России.
Условия, материалы и методы. В работе использовали 35 сортов картофеля российского происхождения: Брянский деликатес, Великан, Вымпел, Гала, Голубизна, Гусар, Евразия, Жуковский ранний, Ильинский, Импала, Колобок, Кортни, Красавчик, Крепыш, Ломоносовский, Метеор, Накра, Никулинский, Регги, Ред Скарлетт, Сударыня, Танго, Удача, Фаворит, Фрителла, Чароит, Любава, Кемеровчанин, Кузнечанка, Танай, Тулеевский, Златка, Сафо, Юна и Невский. Образцы выращивали в поле СибНИИРС (Новосибирская обл.) в 2016 г. Срок посадки - вторая половина мая. Листья для анализа собирали 3-5 августа 2016 г.
Для определения количественных характеристик опушения использовали листья пятого порядка, начиная с верхушки. Листья после сбора в поле помещали черешками в воду для сохранения тургора. В лабораторных условиях из них вырезали фрагменты, заключённые между жилок, по три для каждого листа (рис. 1).
Рис. 1. Основные этапы получения изображений трихом картофеля для фенотипирования: а) вырезание фрагментов; б) приготовление препаратов; в) получение изображений и их компьютерная обработка.
Фрагмент сгибали пополам таким образом, чтобы верхняя поверхность листа оказалась снаружи, и помещали на предметное стекло. Фиксацию фрагмента листа на предметном стекле осуществляли липкой
*Работа выполнена в рамках бюджетного проекта ИЦиГ СО РАН № 0324-2015-0003.
Тип А
а) б)
Рис. 2. Примеры изображений сгиба листа картофеля: а) сорт Колобок, для которого указаны типы трихом на изображении; б) сорт Красавчик.
лентой с отступом от сгиба на 3 мм. Такая методика позволяет получать в проходящем свете контрастное изображение трихом на светлом фоне [4, 5].
Образцы согнутых фрагментов листа помещали под микроскоп ZEISS Axioscop 2 plus с камерой Ax-iocam HRc и адаптером с увеличением 0,63, при помощи которого были получены их цифровые микро-
Результаты и обсуждение. Анализ изображений показывает наличие на сгибе листа картофеля трихом двух типов: едва заметные короткие типа А и длинные типа В (рис. 2).
Гистограммы распределений средней длины и среднего числа трихом на изображении для исследованных сортов картофеля показывают, что размеры трихом большинства растений варьируют в пределах 150-250 мкм, число трихом на изображении - 2-4 шт. (рис. 3). В то же время можно выделить сорта с наиболее длинными трихомами (в среднем более 350 мкм, сорт Кортни) и наиболее короткими трихомами (менее 175 мкм, сорта Импала, Красавчик, Регги, Тулеевский), а также сорта с интенсивным опушением (более 5,5 шт. на изображении, сорта Великан, Кемеровчанин, Танай) и слабым опушением (менее 1,5 шт. на изображении, сорт Красавчик).
Анализ графика рассеяния средней длины и количества трихом типа В (рис. 4) показывает, что в основном исследованные сорта располагаются в области, соответствующей числу трихом от 1 до 4-х и длине от 100 до 250 мкм. Отметим, что для сортов с интенсивным опушением средняя длина трихом не превышает 200 мкм.
я
I-
18 16 14 12
¡2 10 О £ 8
F7I
И
и
а)
50 100 150 200 250 300 350 400 Средняя длина трихом, мкм
1 2 3 4 5 6 7 б) Среднее число трихом на изображении, шт.
6
0
Рис. 3. Гистограммы распределений средней длины и числа трихом на изображении для исследованных сортов картофеля: а) распределение средней длины трихом (ось Х) - минимум 124,17 мкм, максимум 382,67 мкм, медиана 191,61 мкм, среднее значение 207,39 мкм, дисперсия 3398,91 мкм2, стандартное отклонение 58,30 мкм; б) распределение среднего числа трихом (ось Х) - минимум 1 шт., максимум 7,33 шт., среднее значение 2,94 шт., медиана 2,41 шт., дисперсия 2,40 шт2, стандартное отклонение 1,55 шт.
фотографии. Размеры изображения в пикселях составляли 1300 х 1030, размер одного пикселя - 2,1 х 2,1 мкм. Для анализа трихом использовали программу LHDetect2 [4], которая ранее была разработана для анализа опушения пшеницы. Текущая ее версия не позволяет точно оценить длину трихом типа A, поскольку большинство из них слишком короткие и недостаточно выступают за пределы поверхности листа на изображении. В то же время распознавание всех трихом типа B на изображении было успешным, что позволило измерить их среднюю длину в микрометрах (L), а также число трихом на изображении (N).
После этого были рассчитаны распределения трихом по длинам с шагом 42 мкм, средняя длина волосков и их количество. Распределения трихом по длинам усредняли для каждого генотипа и использовали для кластерного анализа и анализа главных компонент. Статистическую обработку данных осуществляли с использованием программы PAST [6].
Значимой линейной зависимости между числом трихом и их средней длиной не обнаружено: коэффи-
Крепыш ^ ^ • • Фаворит
Жуковский ранний
Удача МетеорКолобок " Юн^ в.ПюбаЕСдарыня Брянский Ред Скарлетл ьинск1Гала
деликатес . Евразулеевский Импала Никулинский
. .Реггифрителла , Голубизна
Красавчик Чароит Кузнечанка
• Сафо • Танго
Гусар
Ломоносовский
Невский , Вымпел
• Танай
Кемеровчанин
Число трихом на изображении, шт.
Рис. 4. Диаграмма рассеяния средней длины и числа трихом на изображении у 35 сортов картофеля.
5С
циент корреляции между этими величинами составил -0,147 (p<0,39).
Анализ главных компонент для количественных характеристик опушения исследованных сортов в многомерном пространстве числа трихом в различных интервалах длин (рис. 5) показал, что на две главные компоненты приходится 58% дисперсии (43% на первую и 15% на вторую).
Коэффициент корреляции Пирсона между весами первой компоненты и числом трихом составил 0,9, с длиной трихом - -0,43. Таким образом, увеличение первой компоненты характеризует увеличение числа трихом при уменьшении их длины. Наибольшее значение первой компоненты (см. рис. 5) свойственно для самых опушенных сортов (Великан, Танай, Кемеровчанин, Танго), которые, преимущественно, имеют трихомы умеренной и малой длины. Веса второй компоненты оказались отрицательны для числа трихом в интервалах длин 42-200 мкм и положительны для числа трихом в интервалах длин 200-400 мкм. Таким образом вторая компонента отражает преобладание в опушении трихом умеренной длины. Например, сорт Танго характеризуется преобладанием коротких трихом (~100 мкм), а сорт Великан, трихом умеренной длины (~200 мкм). Сорта Великан, Танай, Кемеровчанин и Танго характеризуются наибольшим разбросом в пространстве главных компонент, то есть демонстрируют наибольшие отклонения по свойствам опушения листьев по отношению к основной массе исследованных растений.
Литература.
1. Gregory P. et al. Potato glandular trichomes: a physicochemical defense mechanism against insects //ACS symposium series. Oxford University Press, 1986. Т. 296. Pp. 160-167.
2. Maharijaya A., Vosman B. Managing the Colorado potato beetle; the need for resistance breeding// Euphytica. 2015. V. 204. №. 3. Pp. 487-501.
3. Полухин Н.И. Вирусная теория вырождения картофеля, ее состоятельность и перспективы практического использования //Достижения науки и техники АПК. 2008. № 4. С. 29-32.
4. Genaev M. A. et al. Extraction of quantitative characteristics describing wheat leaf pubescence with a novel image-processing technique // Planta. 2012. V. 236. № 6. Pp. 1943-1954.
5. Дорошков А.В., Арсенина С.И., Пшеничникова Т.А. и др. Применение компьютерного анализа микроизображений листа для оценки характеристик опушения пшеницы Triticum aestivum L. // Инф. вестн. ВОГиС. 2009. Т. 11. №1. С. 218-226.
6. Hammer 0., Harper D.A.T., Ryan P.D. PAST: Paleontological statistics software package for education and data analysis // Palaeontologia Electronica. 2001. V. 1. Pp. 4-11.
ESTIMATION OF QUANTITATIVE CHARACTERISTICS OF POTATO LEAF HAIRINESS USING MICROSCOPIC IMAGE ANALYSIS
A.V. Doroshkov, A.V. Simonov, A.D. Safonova, D.A. Afonnikov, I.E. Likhenko, N.A. Kolchanov
The Federal Research Center "Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences", prosp. Lavrentyeva, 10, Novosibirsk, 630090, Russian Federation
Summary. Quantitative characteristics of leaf indumentum for 35 varieties of potato were estimated using analysis of microscopic images. The plants were grown in a field of the Siberian Research Institute for Plant Industry and Breeding (Novosibirsk region) from late May to early August 2016. Leaf samples were collected and processed from 3 to 5 August 2016. Fragments of leaves of 1.5 x 0.5 cm were taken between the veins, cut in the laboratory and fold across, the bottom surface of the leaf inside. Fixation of the leaf fragment on a slide was made using sticky tape with the 3 mm offset from the rim of the fold. The glass slide was placed under a digital camera Axiocam HRc of the optical microscope ZEISS Axioscop 2 with an adapter at the magnification of 0.63 in the transmitted light. The obtained images were processed by the program LHDetect2, which enables to count the number of trichoma in the image and estimate the length of each of them. The data were averaged over 6 leaf samples for one plant. For the studied varieties, the average number of trichoma in the image ranged from 1 (weakly downy varieties Krasavchik, Impala, Bryanskii, Reggi) to 7.3 (very downy varieties Kemerovchanin, Velikan, Tanai varieties). The average value for the sample was 2.94, the value of a standard deviation was 1.55. The average length of trichoma varied from 120 to 150 mcm (Krasavchik, Safo, Tango, Kemerovchanin varieties) to 380 mcm (Kortni variety). The average value for the sample was 207.39 mcm, the standard deviation was 58.30 mcm. Significant relationship between the number of trichoma and their length in plants was not detected (Pearson correlation coefficient was -0.147, p is less than 0.39).
Keywords: Solanum tuberosum, trichoma, leaf indumentum, high throughput phenotyping, image analysis.
Author Details: A.V. Doroshkov, Cand. Sc. (Biol.), research fellow; A.V. Simonov, Cand. Sc. (Biol.), research fellow; A.D. Safonova, senior research fellow; D.A. Afonnikov, Cand. Sc. (Biol.), head of laboratory (e-mail: [email protected]); I.E. Likhenko, D. Sc. (Agr.), deputy director; N.A. Kolchanov, member of the RAS, director
For citation: Doroshkov A.V., Simonov A.V., Safonova A.D., Afonnikov D.A., Likhenko I.E., Kolchanov N.A. Estimation of Quantitative Characteristics of Potato Leaf Hairiness Using Microscopic Image Analysis. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2016. V.30. No. 10. Pp. 12-14 (in Russ.).
1,2 1 Ломоносовск Гусар 0,6 • Удача 0,4 ■ Фаворит • ЛрСра • Жуковский ранд • Регги „ •едШк • Великан ий » ГаЯаВымпел • Танай рыня Голубизна ' »'Невский арлетт
_0 5 • Колобок ' • Фрител • Креп'ьМм^Р1^ .(Б^нииоил • Красавчик4 -0,6 -0,8 -1 ¡Минский 05 1 15 2 25 Тулеевский • Накра еор - • *Златка иеносркийКузнечанка ликатес • Кемеровчанин • Танго
Рис. 5. Отображение 35 сортов картофеля в пространстве двух первых компонент, полученных в результате анализа количественных характеристик опушения.
Умеренная доля объясненной дисперсии для первых двух компонент (~60%) указывает, что изменчивость опушения листьев картофеля является комплексной и не может быть сведена к изменению небольшого числа параметров, таких как число трихом и их средняя длина.
Выводы. Предложенный метод оценки количественных характеристик опушения листьев картофеля показал высокую производительность и эффективность. С его помощью охарактеризованы количественные характеристики опушения листьев 35 сортов картофеля, выделены сорта, имеющие наиболее интенсивное опушение (Великан, Танай, Кемеровчанин, Танго).
