CC BY
8
2. Соколов, В. В. Стентирование при стенонозирующем раке пищевода и желудка / В. В. Соколов, Е. С. Карпова, П. В. Павлов // Клиническая эндоскопия. - 2010. - № 4. - С. 2-9.
3. Королёв, М. П. Осложнения эндоскопического стентирования стриктур пищевода / М. П. Королёв, Л. Е. Федотов, А. А. Смирнов [и др.] // Клиническая эндоскопия. - 2009. - N° 3. - С. 14-20.
4. Atkinson, V. Fiber - optic endoscopio palliative intubación of inoperabile oesophagogastric neoplasms / V. Atkinson, R. Ferguson // BMI. -1997. - V. 1. - № 4. - Р. 266-267.
5. Frimberger, E. В. Expanding Spiral a new type of prothesis for the palliative treatment oesophageal stenosis / E. В. Frimberger // Endoscopy. -1983. - V. 15. - P. 213-214.
6. Maier, A. Self - expandable coated stents after untraluminal treatment of oesophageal cancer Risky procedures / A. Maier, H. Pinter [et al.] // Ann. Thorarac. Surg. - 1999. -V. 67. - P. 781.
© Буторин Н. Н., Блохин А. А., Резникова О. С., 2014 УДК 571.27
ОЦЕНКА ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПРИ РАСПРОСТРАНЁННОМ ГНОЙНОМ ПЕРИТОНИТЕ
И. И. Гвоздев1, В. Д. Беленюк1, Д. Ш. Курбанов2, В. А. Шапкина2, А. В. Мошев1, В. Н. Кощеев1
'Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера СО РАМН 2Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого
Проведено динамическое исследование хемилюминесцентной активности нейтрофильных гранулоцитов крови больных с распространённым гнойным перитонитом (РГП). Выявлена усиленная продукция супероксидного анион-радикала и вторичных активных форм кислорода нейтрофильными гранулоцитами больных РГП относительно контрольной группы. В динамике лечения заболевания выявлены снижение продукции супероксидного анион-радикала и усиленный ответ на антигенную стимуляцию относительно первого дня лечения. Ключевые слова: перитонит, воспаление, нейтрофильные гранулоциты, хемилюминесцентная активность.
Введение. Воспаление является типовым патологическим процессом, развивающимся при большинстве заболеваний, которым организм отвечает на самые различные воздействия. Нейтрофильные гранулоциты, являясь ключевыми клетками воспаления, представляют собой высокореактивное звено в иммунной системе. Они первыми мобилизуются в очаг воспаления, от их фагоцитарной активности во многом зависит эффективность про-тивомикробной защиты организма [1; 2]. Воспринимая многочисленные сигналы о дестабилизации внутренней среды, нейтрофилы модулируют свои функции, нацеленные на её восстановление. Активированные нейтрофи-лы сами становятся мощными эффекторами пусковых и регуляторных механизмов каскадных реакций, обеспечивающих развитие воспаления. Это связано с тем, что нейтрофильные гранулоциты способны не только в качестве эффекторов продуцировать цитотоксические молекулы, но и как регуляторные клетки синтезировать широкий спектр различных цитокинов [3; 4]. В связи с этим изучение функциональной активности нейтро-фильных гранулоцитов позволит на клеточном уровне охарактеризовать особенности генеза воспалительных процессов, например, при распространённом гнойном перитоните (РГП).
Несмотря на совершенствование методов хирургического лечения и использование мощного арсенала средств интенсивной терапии, летальность от РГП сохраняется на уровне 32-43,9 %, а в случае генерализации инфекции и развития полиорганной недостаточности достигает 75,8-100 % [5].
РГП остаётся одной из нерешённых проблем современной абдоминальной хирургии [6]. Течение перитонита, характер и особенности развития гнойных инфекционных осложнений определяются не только тяжестью основного патологического процесса, адекватностью выполненного оперативного вмешательства и полнотой послеоперацонного проводимого лечения. Во многом они зависят от происходящих изменений в системе иммунитета [7]. Распространённый гнойный перитонит сопровождается избыточным поступлением в биологические среды организма микробных антигенов и бактериальных токсинов одновременно из трёх источников: гнойно-деструктивного очага брюшной полости, перитониального экссудата и паралитически изменённого тонкого кишечника [6; 7]. Известно, что липополисахарид грамотрицательных бактерий индуцирует секрецию моноцитами, макрофагами и нейтрофилами провоспалительных цитокинов, где триггерами выступают эйкоза-ноиды, биогенные амины, продукты активации системы гемостаза и комплемента, свободные радикалы, действие которых проявляется типичными признаками эндогенной интоксикации в виде лихорадки, нарушения гемодинамики, гемостаза, а в последующем приводит к полиорганной недостаточности [8]. Всё это определяет необходимость изучения молекулярно-клеточных механизмов воспаления при РГП.
Целью исследования явилась оценка хемилюминесцентной активности нейтрофильных гранулоцитов при РГП в динамике лечения.
Хемилюминесцентная активность характеризует состояние «респираторного взрыва» нейтрофильных гранулоцитов, который развивается при взаимодействии клеток с объектами фагоцитоза [3; 9]. Обсуждается значение синтеза ряда активных форм кислорода в системе внешнего киллинга [3; 10]. «Респираторный взрыв» относится к серии метаболических процессов, активность которых определяется состоянием клеток и изменяется при стимуляции нейтрофилов вследствие увеличения потребления кислорода и усиления окисления глюкозы в пентозофосфатном цикле [3; 9].
Материалы и методы исследования. На базе отделения гнойной хирургии Краевой клинической больницы г. Красноярска обследовано 25 больных с РГП в возрасте 40-55 лет в первый день после поступления в стационар и периоды 4-7 дней, 10-14 дней и 20-24 дня. Из исследования были исключены больные с неоперабельными онкологическими заболеваниями органов брюшной области и неоперабельными нарушениями мезентериального кровообращения. Исходную степень тяжести больных определяли по шкале SAPSII [11]. Тяжесть РГП исходно определяли по Мангеймскому индексу перитонита (МИП) и индексу брюшной полости (ИБП) [12]. Наличие и степень выраженности ПОН исходно и в динамике определяли по шкале SOFA [13]. При оценке тяжести синдрома системной воспалительной реакции (ССВР) мы придерживались критериев ACCP/SCCM [14]. В качестве контроля обследовано 97 здоровых людей аналогичного возрастного диапазона. Исследования проводились в строгом соответствии с этическими нормами Хельсинкской декларации (WMA, 1964).
Нейтрофильные гранулоциты выделяли из цельной гепаринизированной крови центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-урографина: р = 1,077 г/см3 - для отделения лимфоцитов; р = 1,119 г/см3 - для выделения нейтрофилов. Реакционная смесь для хемилюминесцентной реакции состояла из 20 мкл донорской сыворотки AB (IV)Rh (-), 50 мкл люминола или люцигенина («Sigma», США) в концентрации 10-5 М, 40 мкл опсонизированного зимозана (в случае определения индуцированной хемилюминесценции), 200 мкл взвеси нейтрофилов (2 млн/мл) и 240 мкл раствора Хэнкса («ПанЭко», Россия) для определения спонтанной хеми-люминесценции или 200 мкл раствора Хенкса - для индуцированной [3]. Оценку спонтанной и зимозан-индуцированной хемилюминесценции осуществляли в течение 90 минут на 36-канальном хемилюминес-центном анализаторе «CL3606» (СКТБ «Наука», Красноярск). Определяли следующие характеристики: время выхода на максимум (Tmax), максимальное значение интенсивности (Imax), а также площадь под кривой (S) хемилюминесценции. Усиление хемилюминесценции, индуцированной зимозаном, оценивали по отношению площади индуцированной хемилюминесценции к площади спонтанной ^инд.^спонт.) и определяли как индекс активации.
Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoftInc., 2007). Описание выборки производили с помощью подсчёта медианы (Ме) и интерквартального размаха в виде 25 и 75 процентилей (С25-С75). Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни. Достоверность различий в динамике лечения определяли по критерию Wilcoxon.
Результаты и обсуждение. При проведении сравнительного исследования показателей люцигенин-зависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов контрольной группы и больных РГП обнаружены: увеличение интенсивности и площади под кривой зимозан-индуцированной хемилюминесценции относительно контрольной группы в период 4-7 дней после поступления в стационар и увеличение площади под кривой хемилюминесценции в период 20-24 дня после поступления в стационар. В динамике лечения обнаружены: снижение интенсивности зимозан-индуцированной хемилюминесценции в период 20-24 дня относительно первого дня лечения, снижение площади под кривой спонтанной люцигенин-зависимой хемилюминесценции в периоды 4-7 дней и 20-24 дня после поступления в стационар, увеличение площади под кривой зимозан-индуцированной хемилюминесценции и индекса активации в период 20-24 дня относительно первого дня лечения. При оценке люминол-зависимой хемилюминесценции у больных РГП наблюдается более медленный выход на максимум спонтанной хемилюминесценции, а также увеличение интенсивности спонтанной и зимо-зан-индуцированной хемилюминесценции и увеличение площади под кривой спонтанной и зимозан-индуцированной хемилюминесценции в первый день лечения и период 4-7 дней после поступления в стационар. В период 10-14 дней после поступления в стационар было установлено увеличение интенсивности и площади под кривой хемилюминесценции в период 20-24 дня выявлены: более медленный выход на максимум спонтанной хемилюминесценции, увеличение интенсивности спонтанной и зимозан-индуцированной хемилю-минесценции и увеличение площади под кривой спонтанной и зимозан-индуцированной хемилюминесценции. В динамике лечения выявлено ускорение выхода на максимум спонтанной хемилюминесценции в период 10-14 дней после поступления в стационар относительно первого дня лечения. Известно, что люцигенин окисляется и люминесцирует только под влиянием супероксид-радикала, который определяется как первичная активная форма кислорода и синтезируется в системе НАДФН-оксидазы [3; 9; 10]. Следовательно, исследование люци-генин-зависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов позволяет охарактеризовать состояние активности НАДФН-оксидазы в нейтрофильных гранулоцитах у больных РГП. Соответственно можно заключить, что у больных РГП наблюдается повышение активности НАДФН-оксидазы нейтрофильных гранулоцитов как в состоянии относительного покоя, так и при антигенной стимуляции in vitro. Время выхода на максимум характеризует скорость развития «дыхательного взрыва» в случае регуляторного или антигенного воздействия на клетку, включая этапы рецепторного воздействия, передачи сигнала внутрь клетки и собственно «дыхательный взрыв», генерируемый ферментными системами. Увеличение времени выхода на максимум хемилюминес-ценции нейтрофильных гранулоцитов у больных РГП характеризует более длительный период функциональной активации клеток.
Заключение. Цитотоксическая активность нейтрофильных гранулоцитов определяется уровнем продукции как первичных, так и вторичных активных форм (гидроксильный радикал, перекись водорода и др.) кислорода. В формировании пула вторичных форм кислорода в нейтрофильных гранулоцитах принимают участие такие ферменты, как супероксиддисмутаза, каталаза, миелопероксидаза и др. [3; 10]. Люминол способен вступать в хемилюминесцентную реакцию и с первичными, и с вторичными активными формами кислорода [9]. Увеличение интенсивности и площади под кривой люминол-зависимой хемилюминесценции при РГП свидетельствует об усиленной продукции вторичных активных форм кислорода как в состоянии относительного покоя, так и при антигенной стимуляции in vitro. При спонтанной хемилюминесцентной реакции у больных РГП наблюдается замедленное образование вторичных активных форм кислорода. Различий в скорости образования супероксидного анион-радикала не наблюдается. Снижение площади под кривой спонтанной люцигенин-зависимой хемилюминесценции в динамике свидетельствует о постепенном снижении НАДФ-Н-оксидазной активности нейтрофильных гранулоцитов в состоянии покоя, а увеличение площади под кривой зимозан -индуцированной хемилюминесценции и индекса активации свидетельствует об улучшении их способности отвечать на дополнительную антигенную стимуляцию к периоду 20-24 дня относительно первого дня лечения. Снижение времени выхода на максимум спонтанной люминол-зависимой хемилюминесценции свидетельствует об увеличении скорости образования вторичных активных форм кислорода в нейтрофильных гранулоцитах к периоду 10-14 дней. «Респираторный взрыв» относится к серии метаболических процессов, активность которых изменяется при стимуляции нейтрофилов, следовательно, регистрируемый при РГП повышенный синтез активных форм кислорода нейтрофилами свидетельствует об избыточной активации нейтрофильных гранулоцитов больных РГП вследствие эндогенной интоксикации. В динамике лечения наблюдаются постепенное снижение НАДФ-Н-оксидазной активности, увеличение скорости образования вторичных активных форм кислорода и усиление способности отвечать на антигенную стимуляцию in vitro. Однако снижения ХЛ активности до уровня контрольной группы не происходит.
Библиографический список
1. Ярилин, А. А. Иммунология / А. А. Ярилин. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752 с.
2. Савченко, А. А. Иммунометаболические нарушения при распространённом гнойном перитоните / А. А. Савченко, Д. Э. Здзитовецкий, А. Г. Борисов. - Новосибирск: Наука, 2013. - 142 с.
3. Куртасова, Л. М. Клинические аспекты функциональных нарушений нейтрофильных гранулоцитов при онкопатологии / Л. М. Куртасо-ва, А. А. Савченко, Е. А. Шкапова. - Новосибирск: Наука, 2009. - 184 с.
4. Kasama, T. Neutrophil-derived cytokines: potential therapeutic targets in inflammation / T. Kasama, Y. Miwa, T. Isozaki [et al.]. // Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy. - 2005. - Vol. 4. - № 3.- P. 273-279.
5. Малков, И. С. Новые подходы к лечению разлитого перитонита / И. С. Малков, Р. Ш. Шаймарданов, В. Н. Биряльцев [и др.] // Казанский медицинский журнал. - 2003. - Т. 84. - № 6. - С. 424-428.
6. Савченко, А. А. Хемилюминесцентная активность нейтрофильных гранулоцитов и уровни концентрации цитокинов у больных распространённым гнойным перитонитом / А. А. Савченко, Д. Э. Здзитовецкий, А. Г. Борисов [и др.] // Цитокины и воспаление. - 2013. -Т. 12. - № 1-2. - С. 115-119.
7. Гаин, Ю. М. Иммунный статус при перитоните и пути его патогенетической коррекции: руководство для врачей / Ю. М. Гаин, С. И. Леонович, Н. В. Завада [и др.]. - Минск: Юнипресс, 2001. - 256 с.
8. Терещенко, О. А.. Синдром эндогенной интоксикации и системной воспалительной реакции при желчном перитоните, осложнённом абдоминальным сепсисом / О. А. Терещенко, А. А. Боташев, Ю. В. Помещик [и др.] // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. - 2012. - Т. V, № 4. - С. 722-726.
9. Владимиров, Ю. А. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция / Ю. А. Владимиров, Е. В. Проскурина // Успехи биологической химии. - 2009. - № 49. - С. 341-388.
10. Benbarek, H. Modulatory effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs on the luminol and lucigenin amplified chemiluminescence of equine neutrophils / H. Benbarek, A. Ayad, G. Deby-Dupont [et al.] // Vet. Res. Commun. - 2012. Vol. 36. - № 1. - P. 29-33.
11. Le Gall, J.-R. A new Simplified Acute Physiology Score (SAPS II) based on a European / J.-R. Le Gall, S. Lemeshow, F. Saulnier // North American multicenter study // JAMA. - 1993. - Vol. 270. - P. 2957-2963.
12. Linder, M. M. Der Mannheimer Peritonitis-Index. Ein Instrument zur intraoperativen Prognose der Peritonitis / M. M. Linder, H. Wacha, U. Feldmann [et al.] // Chirurg. - 1987. - № 58. - P. 84-91.
13. Vincent, J. L. The SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessment) score to describe organ dysfunction/failure. On behalf of the Working Group on Sepsis-Related Problems of the European Society of Intensive Care Medicine / J. L. Vincent, R. Moreno, J. Takala [et al.] // Intensive Care Med. - 1996. - Vol. 22. - № 7. - P. 707-710.
14. Bone, R. S. American college of Chest Physicians. Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: Definitions for sepsis and organ failure and guide lines for the use of innovative therapies in sepsis / Bone R. S., Balk R. A. B., Cerra F. B. [et al.] // Crit. Care Med. - 1992. -Vol. 20. - № 6. - P. 864-874.
© Гвоздев И. И., Беленюк В. Д., Курбанов Д. Ш., Шапкина В. А., Мошев А. В., Кощеев В. Н., 2014
