CC BY
88
Вестник Челябинского государственного университета. 2015. № 21 (376). Биология. Вып. 3. С. 89-93.
УДК 57.085.2+614.8.086.5 ББК 28.04
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ РАДИОЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИОКСИДАНТОВ БУТИЛИРОВАННОГО ГИДРОКСИТОЛУОЛА, ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА И АСТАКСАНТИНА В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO
И. А. Шапошникова1'2, Н. А. Обвинцева, Г. А. Тряпицына1'2, Д. И. Осипов, Е. А. Пряхин, Ю. И. Остроумов, Е. В. Новиков, А. В. Аклеев1'2
1ФГБУН «Уральский научно-практический центр радиационной медицины» ФМБА России, Челябинск, Россия 2ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет», Челябинск, Россия 3ОАО «Институт инженерной иммунологии», Москва, Россия 4ГБУЗ «Челябинский областной клинический онкологический диспансер», Челябинск, Россия
Проведено изучение эффективности радиозащитного действия синтетического препарата бутили-рованного гидрокситолуола (БГТ), биофлавоноидного соединения дигидрокверцетина (ДГК), ксантофилла астаксантина и микроэмульсии комплекса выше перечисленных антиоксидантов на выживаемость клеток после острого гамма-облучения в дозе 3 Гр на ускорителе Elekta Synergy в экспериментах in vitro. В результате проведённых исследований установлено, что все изученные антиоксиданты повышают выживаемость лимфоцитов после облучения, но различия от контроля достигали статистической значимости в группе, где в культуральную среду была добавлена микроэмульсия, включающая все три испытуемых антиоксиданта.
Ключевые слова: лимфоциты, антиоксиданты, бутилированный гидрокситолуол, дигидроквер-цетин, астаксантин.
Введение. В связи с расширением сферы использования источников ионизирующего излучения в различных областях деятельности человека, в том числе в медицине, возможностью возникновения аварийных ситуаций на атомных энергетических установках, возрастанием угрозы ядерного терроризма, сохраняющейся вероятности применения ядерного оружия в современных войнах проблема профилактики радиационных поражений приобретает всё большую актуальность. В последние годы отечественными и зарубежными исследователями проводится экспериментальная работа по поиску, испытанию и внедрению новых лекарственных средств, обладающих противолучевыми свойствами. При этом большое внимание уделяется изучению радиопротекторных и лечебных свойств естественных и синтетических антиоксидантов. Разработка но -вых эффективных средств профилактики и лечения лучевых поражений невозможна без испытаний этих препаратов в экспериментах in vitro и in vivo. Исследования, направленные на использование антиоксидантов с целью снижения деструкции после лучевого воздействия за счёт инактивации окислительных радикалов, являются перспективными [1—4].
Цель работы: установить эффективность радиозащитного действия четырёх препаратов антиоксидантов — бутилированного гидрокситолуола (БГТ), дигидрокверцетина (ДГК), астаксантина и микроэмульсии комплекса выше перечисленных антиоксидантов на выживаемость клеток после острого гамма-облучения в дозе 3 Гр в экспериментах in vitro.
Материалы и методы. Объектом исследования служили лимфоциты периферической крови человека. Кровь из локтевой вены в объёме 10 мл забирали у 5 здоровых доноров (двое мужчин и три женщины) в возрасте от 30 до 40 лет. Лимфоциты выделяли из периферической крови по методу Boyum, 1968, основанному на седиментации в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина [2].
В качестве изучаемых противолучевых средств использовали следующие препараты, обладающие антиоксидантными свойствами:
1. Синтетический антиоксидант бутилированный гидрокситолуол (БГТ), синоним дибунол, C10H14O2; ингибирует свободнорадикальные реакции, тормозит перекисное окисление липидов в тканях, корригирует кислородозависимые патологические состояния, стимулирует процес-
сы регенерации, снижает воспалительную реакцию.
2. Дигидрокверцетин (ДГК), синоним таксофо-лин, С15Н12О7; флавоноид растительного происхождения лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) или лиственницы даурской (L. dahurica Turcz.), обладает высокой биологической активностью, является нейтрализатором свободных радикалов.
3. Астаксантин, C40H52O4C4; каротиноид растительного и животного происхождения, имеющий по сравнению с бета-каротином два дополнительных атома кислорода на каждом из ше-стичленных колец; обнаружен в фитопланктоне, дрожжах, лососёвых рыбах, форели, криле, креветках, раках, ракообразных и в перьях птиц; относится к группе ксантофиллов, производным ка-ротиноидов.
4. Микроэмульсия комплекса антиоксидантов: 1 %-й бутилированный гидрокситолуол (БГТ) + 1 %-й гидроксикверцетин (ДГК) + 0,17 °%-й астаксантин + 4,5 %-й эмульгатор гидрогенизирован-ный лецитин + 0,3 %-е консерванты + 30 %-е масло растительное + вода дистиллированная до 100 мл.
Все тестируемые препараты растворяли в биполярном апротонном растворителе DMSO в эффективной нетоксической концентрации для достижения концентрации в культуральной среде 12,5 мкмоль/л.
Лимфоциты каждого донора были поделены на 12 экспериментальных групп. Каждая порция лимфоцитов была внесена в стерильную бакпе-чатку, содержащую 3 мл среды RPMI с глута-мином и 0,75 мл сыворотки эмбриональной телячьей. В бакпечатки 2-9-х групп были внесены растворы соответствующих антиоксидантов на основе DMSO; в бакпечатки 1-й и 10-й групп — DMSO; в бакпечатках 11-й и 12-й групп содержалась только культуральная среда. Затем культуры лимфоцитов 1, 2, 4, 6, 8, 11-й групп были подвергнуты облучению.
Острое гамма-облучение культур лимфоцитов выполнено в дозе 3 Гр с мощностью дозы 5,5 Гр/мин и номинальной энергией фотонов 6 МэВ на ускорителе Elekta Synergy (Elekta Limited, Великобритания) стереотаксической радиохирургии «Кибер-нож» (CyberKnife, Accuray Incorporated, США) Челябинского областного клинического онкологического диспансера. Облучение культуры клеток в дозе 3 Гр проводили в день посадки лимфоцитов. Культивирование
лимфоцитов осуществлялось при З7 °С в термостате.
Оценку проводили по показателю выживаемости лимфоцитов в культуре через 48 ч после острого облучения. С этой целью клетки окрашивали флуоресцентными красителями SYBR Green I, Propidium iodide фирмы Molecular Probes, США. Анализировали с помощью лазерного проточного цитофлуориметра А^^Юб фирмы Becton, Dickinson and Company, США. Для возбуждения флуоресценции применялся лазер с длиной волны 488 нм, для оценки интенсивности флуоресценции использовали фотодатчик с фильтром с полосой пропускания 518-548 нм. Во время инкубации окрашенных проб проводился анализ проб без окрашивания для определения положения пика флуоресценции в отсутствие красителя и последующего введения поправки на разрушение клеток в процессе окрашивания.
Статистический анализ. Проводили расчёт средней арифметической величины показателей и ошибки средней арифметической величины. Определяли достоверность отличий показателей в экспериментальных группах с использованием í-критерия Стьюдента (р < 0,05).
Результаты и обсуждение. С использованием культуры лимфоцитов периферической крови человека была выполнена оценка радиозащитного действия препаратов антиоксидантов в экспериментах in vitro. В контрольной группе облучение в дозе З Гр привело к снижению доли живых клеток до 45 % относительно необлучённого контроля.
Поскольку растворы испытуемых препаратов приготовлены на основе DMSO, была выполнена оценка влияния растворителя на выживаемость лимфоцитов периферической крови человека. Не было выявлено существенного влияния на показатель выживаемости присутствия в куль-туральной среде DMSO.
Добавление в культуральную среду бутилиро-ванного гидрокситолуола (БГТ), гидроксиквер-цетина (ДГК), астаксантина и микроэмульсии трёх антиоксидантов привело к повышению выживаемости лимфоцитов после облучения на 1З, 14,6, 21,7 и 12,9 % соответственно по сравнению с выживаемостью в группе контроля. Однако эти различия достигали статистической значимости только в группе, где в культуральную среду была добавлена микроэмульсия, включающая все три испытуемых антиоксиданта.
Оценка эффективности радиозащитного действия антиоксидантов бутилированного гидрокситолуола..
91
Ц 0.60
Контроль
-г Облучение, 3Гр
1I 11
1.07 0.62 1.14 0.76 1.05 0.61 0.97 0.52 1.00
Микроэмульсия антиоксидантов
Астаксантин БГТ ДМСО
Экспериментальные группы
Контроль
ДГК
Влияние антиоксидантов на выживаемость лимфоцитов через 48 ч после острого облучения в дозе 3 Гр
Заключение. Поиск новых средств профилактики и лечения радиационных поражений остаётся одной из актуальных научных задач современной радиобиологии. В радиационных поражениях клеточных структур значительную долю составляют непрямые повреждения молекул за счёт сво -бодных радикалов. Применение антиоксидантов, влияющих на процессы свободно-радикального окисления и антиоксидантной активности, может
оказывать защитное действие при радиационных поражениях. Полученные результаты свидетельствуют о наличии радиозащитных свойств у бутилированного гидрокситолуола (БГТ), гидро-ксикверцетина (ДГК), астаксантина и микроэмульсии трёх антиоксидантов и перспективности дальнейшего развития этого направления в поиске, создании и испытании новых противолучевых средств.
1.40
1.20
1.00
0.80
0.40
0.20
0.00
Список литературы
1. Котенко, К. В. Современные методы клеточной терапии при лечении ожогов / К. В. Котенко, С. В. Смирнов и др. // Хирургия. - 2003. - Вып. 12. - С. 58-62.
2. Boyum, A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow / A. Boyum // Scandinavian J. of Clinical and Laboratory Investigation. - 1968. - Vol. 21. - Suppl. 97. - P. 1-9.
3. Greenberger, J. S. Strategies for discovery of small molecule radiation protectors and radiation mitigators [Электронный ресурс] / J. S. Greenberger, D. Clump, V. Kagan [et al.] // Frontiers in Oncology. - 2012. - URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3356036
4. Kouvaris, J. R. Amifostine: the first selective-target and broad-spectrum radioprotector / J. R. Kouvaris, V. E. Kouloulias, L. J. Vlahos // J. Oncologist. - 2007. - Vol. 12. - P. 738-747.
5. Montana, G. S. Topical application of WR-2721 to prevent radiation-induced proctosigmoiditis. A phase I/II trial / G. S. Montana, M. S. Anscher, C. M. Mansbach [et al.] // Cancer. - 1992. - Vol. 69. - P. 2826-2830.
Сведения об авторах Шапошникова Ирина Александровна — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник экспериментального отдела Уральского научно-практического центра радиационной медицины, магистрант второго года обучения кафедры радиационной биологии Челябинского государственного университета, Челябинск, Россия. shaposhnikova@lenta.ru
Обвинцева Надежда Александровна — научный сотрудник экспериментального отдела Уральского научно-практического центра радиационной медицины, Челябинск, Россия. n_obvintseva@mail.ru
Тряпицына Галина Александровна — доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник экспериментального отдела Уральского научно-практического центра радиационной медицины, профессор кафедры радиационной биологии Челябинского государственного университета, Челябинск, Россия. tga28@mail.ru
Осипов Денис Иванович — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник экспериментального отдела Уральского научно-практического центра радиационной медицины, Челябинск, Россия. osipov_d@ list.ru
Пряхин Евгений Александрович — доктор биологических наук, профессор, заведующий экспериментальным отделом Уральского научно-практического центра радиационной медицины, Челябинск, Россия. pryakhin@yandex.ru
Остроумов Юрий Игоревич — кандидат химических наук, ОАО «Институт инженерной иммунологии», Москва, Россия. proterius@yandex.ru
Новиков Евгений Викторович — начальник отдела радиационной медицинской физики и радиохимии Челябинского областного клинического онкологического диспансера, Челябинск, Россия. shaposhnikova@ lenta.ru
Аклеев Александр Васильевич — доктор медицинских наук, профессор, директор Уральского научно-практического центра радиационной медицины, заведующий кафедрой радиационной биологии Челябинского государственного университета, Челябинск, Россия. akleyev@urcrm.ru
Bulletin of Chelyabinsk State University. 2015. No. 21 (376). Biology. Issue 3. Pp. 89-93.
ASSESSMENT OF RADIOPROTECTIVE ACTION EFFICIENCY OF ANTIOXIDANTS OF THE BUTHYLATED GIDROKSITOLUOL, DIGIDROKVERTSETIN, ASTAKSANTIN IN THE IN VITRO EXPERIMENTS
I. A. Shaposhnikova
Urals Research Center for Radiation Medicine, Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia. shaposhnikova@lenta.ru
N. A. Obvintseva
Urals Research Center for Radiation Medicine, Chelyabinsk, Russia. n_obvintseva@mail.ru
G. A. Tryapitsyna
Urals Research Center for Radiation Medicine, Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia. tga28@mail.ru
D.I. Оsipov
Urals Research Center for Radiation Medicine, Chelyabinsk, Russia. osipov_d@list.ru
Е. A. Pryakhin
Urals Research Center for Radiation Medicine, Chelyabinsk, Russia. pryakhin@yandex.ru
Yu. I. Оstroumov
Public Corporation Institute of Engineering Immunology, Moscow, Russia. proterius@yandex.ru
E. V. ^vikov
Chelyabinsk Regional Clinical Oncology Center, Chelyabinsk, Russia. shaposhnikova@lenta.ru
A. V. Akleyev
Urals Research Center for Radiation Medicine, Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia. akleyev@urcrm.ru
Studying of radioprotective action efficiency of a synthetic preparation of the buthyleted gidroksitoluol (BGT), bioflavonoid digidrokvertsetin (DGK), xanthophyll astaksantin and a microemulsion of the complex
Ovjema э$$ектu6ностирaдuoзaцumнoгo deucmBun anmaoKoudaHmoe 6утип.ированного гuдрoкcumonуona..
93
higher listed antioxidants is carried out on survival of cells after sharp gamma irradiation in a dose of 3 Gr on the Elekta Synergy accelerator in the in vitro experiments. As a result of the conducted researches it is established that all studied antioxidants increase survival of lymphocytes after radiation, but distinctions from control reached the statistical importance in group where on cultural medium the microemulsion including all three examinees of an antioxidant was added.
Keywords: lymphocytes, antioxidants, buthyleted gidroksitoluol, digidrokvertsetin, astaksantin.
References
1. Kotenko K.V., Smirnov S.V. et al. Sovremennye metody kletochnoy terapii pri lechenii ozhogov [Modern methods of cellular therapy at treatment of burns]. Khirurgiya [Surgery], 2003, iss. 12, pp. 58-62. (In Russ.).
2. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 1968, vol. 21, suppl. 97, pp. 1-9.
3. Greenberger J.S., Clump D., Kagan V. et al. Strategies for discovery of small molecule radiation protectors and radiation mitigators. Frontiers in Oncology, 2012. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ar-ticles/PMC3356036/, accessed 08.11.2015.
4. Kouvaris J.R., Kouloulias V.E., Vlahos L.J. Amifostine: the first selective-target and broad-spectrum ra-dioprotector. Journal Oncologist, 2007, vol. 12, pp. 738-747.
5. Montana G.S., Anscher M.S., Mansbach C.M. et al. Topical application of WR-2721 to prevent radiation-induced proctosigmoiditis. A phase I/II trial. Cancer, 1992, vol. 69, pp. 2826-2830.
