CC BY
42
DOI: 10.23868/201906017
ОЦЕНКА БИОСОВМЕСТИМОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ДОСТАВКИ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ГЕН-АКТИВИРОВАННЫМИ ГИДРОГЕЛЯМИ iW VITRO
И.Я. Бозо1-3, А.А. Титова4, М.Н. Журавлева4, А.И. Билялов4, М.О. Мавликеев4, И.А. Яковлев5, И.И. Еремин1' 6, А.А. Пулин1 7, В.С. Комлев8, Р.В. Деев3' 5' 9
1 Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии, Москва, Россия
2 Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России, Москва, Россия
3 ООО «Гистографт», Москва, Россия
4 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
5 Рязанский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова, Рязань, Россия
6 Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, Россия
7 Национальный медицинский хирургический центр им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
8 Институт металлургии и материаловедения РАН им. А.А. Байкова, Москва, Россия
9 ПАО «Институт Стволовых Клеток Человека», Москва, Россия
e-mail: [email protected]
EVALUATION OF BIOCOMPATIBILITY AND EFFICIENCY OF PLASMID DNA DELIVERY BY GENE-ACTIVATED HYDROGELS IN VITRO
I.Y. Bozo1-3, A.A. Titova4, M.N. Zhuravleva4, A.I. Bilyalov4, M.O. Mavlikeev4, I.A. Yakovlev5, I.I. Eremin1, 6, A.A. Pulin1, 7, V.S. Komlev8, R.V. Deev3, 5, 9
1 Research Institute of General Pathology and Pathophysiology, Moscow, Russia
2 A.I. Burnazyana Federal Medical Biophysical Center, FMBA of Russia, Moscow, Russia
3 Histograft, LLC, Moscow, Russia
4 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia
5 I.P. Pavlov Ryazan State Medical University, Ryazan, Russia
6 National Research Center "Kurchatov Institute", Moscow, Russia
7 N.I. Pirogov National Medical Surgical Center, Moscow, Russia
8 AA. Baykov Institute of Metallurgy and Materials Science of the RAS, Moscow, Russia
9 PJSC "Human Stem Cells Institute", Moscow, Russia
Инъекционные формы биоматериалов имеют значительные перспективы для развития малоинвазивных медицинских технологий в рамках регенеративной медицины. В данном исследовании была оценена возможность использования синтетических и натуральных гидрогелей, в том числе содержащих фосфаты кальция и гидроксиапатит, для доставки генных конструкций — молекул плазмидной ДНК, несущих ген (сосудистого эндотели-ального фактора роста, зеленого флуоресцентного белка или люциферазы), в клетки ¡гу^го. Исследование по оценке поступления плазмидной ДНК в клетки выполняли на культуре эмбриональных фибробластов мыши линии 3Т3 с использованием флуоресцентных и люминисцентных методов. На культурах мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток охарак-теризовывали биосовместимость гидрогелей.
Было установлено, что экстракты исследованных гидрогелей а не оказывали цитотоксических эффектов, однако при непосредственном контакте материалов, содержащих частицы фосфатов кальция и гидроксиапатит цитотоксическое влияние наблюдалось. Эффективность трансфекции в случае гидрогелей на основе коллагена и гиалуроновой кислоты, показавших оптимальную биосовместимость, без использования трансфицирующего агента оказалась низкой, а при его использовании — 24 и 31%, соответственно. Другие варианты гидрогелей доставку плазмид-ных ДНК не обеспечивали, возможно, в виду цитотоксических эффектов. Дальнейшие исследования ¡гумопозволят уточнить особенности доставки плазмидной ДНК гидрогелями, а также оценить эффективность ген-активированных гидрогелей в регенерации тканей опорно-двигательного аппарата.
Ключевые слова: ген-активированные гидрогели, плаз-мидная ДНК, биосовместимость, люцифераза.
Введение
В связи с развитием малоинвазивных медицинских технологий инъекционные формы биоматериалов приобретают все большее значение. В частности, медицинские изделия на основе гидрогелей востребованы для
Injectable forms of biomaterials have significant prospects for development of minimally invasive medical technologies in regenerative medicine. In this study, we evaluated the opportunities of using synthetic and natural hydrogels, including those containing calcium phosphates and hydroxyapatite, to deliver gene constructs, plasmid DNA molecules carrying some genes (encoding vascular endothelial growth factor, green fluorescent protein, or luciferase), to cells in vitro. The study of plasmid DNA delivery was performed in the line of mouse embryonic fibroblasts 3T3 using fluorescence and luminescent methods. Hydrogel biocompatibility was characterized in cultures of multipotent mesenchymal stromal cells.
We found that the extracts of investigated hydrogels did not exert cytotoxic effects, however, with direct contact of materials containing either calcium phosphate particles or hydroxyapatite, a cytotoxic effect was observed. In the case of hydrogels based on collagen and hyaluronic acid that showed optimal biocompatibility, the transfection efficiency turned out to be low without using of a transfection agent and when used, it was 24 and 31%, respectively. Other variants of hydrogels did not provide plasmid DNA delivery, possibly due to cytotoxic effects. Further in vivo studies will clarify the features of plasmid DNA delivery with hydrogels, as well as evaluate the effectiveness of gene-activated hydrogels in tissue regeneration of the musculoskeletal system.
Keywords: gene-activated hydrogels, plasmid DNA, biocompatibility, luciferase.
выполнения различных вариантов костной пластики, для восстановления целостности мышц [1], суставных хрящей [2, 3], кожного покрова [4] и т. п., особенно оптимизированные варианты таких изделий, доставляющие биологически активные компоненты, индуцирующие
оригинальные исследования
41
репаративную регенерацию тканей: клетки, факторы роста или генные конструкции, кодирующие их [5].
Гидрогели, содержащие генные конструкции, относятся к ген-активированным материалам, представляющим собой комплексы биорезорбируемых матриксов-носите-лей и биологически активных нуклеиновых кислот, несущих гены терапевтических белков [6, 7]. В отличие от стандартизированных твердых форм ген-активированных материалов [8], изделия на основе гидрогелей способны заполнять весь объем дефекта ткани и (или) органа, тем самым обеспечивая максимально быстрое заселение своей структуры клетками реципиента, способными акцептировать и экспрессировать в течение контролируемого периода времени генные конструкции.
В зависимости от конкретного показания для применения, в состав гидрогелевых матриксов-носителей могут вноситься дополнительные компоненты. В частности, для обеспечения репаративного остеогенеза целесообразно внесение микрочастиц или гранул фосфатов кальция, способных наделить изделие остеокондуктивными свойствами. Это особенно важно в случае гидрогелей с низкими биомеханическими свойствами и (или) высокой скоростью биодеградации [5].
среди ряда известных способов совмещения гидрогелевых материалов и генных конструкций наиболее простым является простое смешивание полимера с водным раствором биологически активных молекул, что позволяет равномерно распределить их во всем объеме гидрогеля и обеспечить быстрое высвобождение в реципиентном ложе [9].
Учитывая высокую актуальность инъекционных форм медицинских изделий для восстановления целостности тканей опорно-двигательного аппарата, а также базируясь на передовом опыте в разработке твердых ген-активированных остеопластических материалов [10, 11] целью настоящего исследования стала разработка прототипов ген-активированных гидрогелей с оценкой биосовместимости и эффективности доставки генных конструкций.
Материал и методы
Гидрогелевые матриксы-носители
В качестве матриксов-носителей для разрабатываемых изделий были выбраны гидрогелевые материалы следующего состава: коллаген (К), коллаген с микрочастицами фосфатов кальция (КФ), коллаген с частицами гидрокси-апатита (КГА), полимер на основе гиалуроновой кислоты (ГК), со-полимер полигликолиевой кислоты и полиэтилен-глколя (ПГК-ПЭГ), зарегистрированные в качестве медицинских изделий на территории российской Федерации и показанные для лечения пациентов с повреждениями тканей опорно-двигательного аппарата и кожи. основными критериями для отбора отдельных вариантов гидрогелей в качестве потенциальных матриксов-носителей генных конструкций являлась заявленная производителями и (или) разработчиками биосовместимость, способность к биодеградации, высокая гидрофильность.
Генные конструкции
В качестве генных конструкций использовали молекулы плазмидной ДНК, несущие терапевтический или маркерный трансген. Для оценки эффективности транс-фекции люминисцентными методами использовали плазмидную ДНК с геном, кодирующим люциферазу (pC4W-GL3), предоставленную лабораторией генно-кле-точной терапии медицинского научно-образовательного центра МГУ им. М.В. Ломоносова, флуоресцентными методами — плазмидную ДНК с геном зеленого
флуоресцентного белка (pEGFP-N2), предоставленную Казанским (Приволжским) федеральным университетом. В качестве контроля в экспериментах по оценке эффективности трансфекции служила плазмидная ДНК, несущая ген сосудистого эндотелиального фактора роста А-165 (pVEGFA), — активный компонент лекарственного препарата «Неоваскулген» [12].
Оценка эффективности доставки
генных конструкций ген-активированных
гелей в клетки in vitro
Культуры клеток. Исследования in vitro выполняли на эмбриональных фибробластах мыши линии 3т3 (NIH/3T3), полученных из коллекции клеточных культур Open Lab «Генные и клеточные технологии» ИФМиБ КФУ (Казань). Клетки выращивали до образования монослоя в культуральном флаконе т75 в питательной среде а-МЕМ, к которой были добавлены 10% фетальная сыворотка крупного рогатого скота (fetal bovine serum, FBS) (Sigma-Aldrich, США) и 2 мM L-глутамина (SigmaAldrich, сША) при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. При достижении монослоя клетки пассировали и рассевали в 24-луночный планшет в количестве 5х104 клеток на лунку в соответствии с экспериментальными группами и через 24 ч. производили трансфекцию.
Со-инкубирование клеточных культур с прототипами ген-активированных гелей. В качестве экспериментальных групп использовали прототипы ген-активированных гелей с одним из вариантов маркерной плазмидной ДНК как без, так и с использованием трансфицирующего агента Lipofectamine® 3000 (Thermo Fisher Scientific, США). Контрольными группами служили клетки без каких-либо материалов, а также инкубированные с соответствующими гидрогелевыми материалами без генных конструкций, генными конструкциями в воде для инъекций как без, так и с использованием трансфицирующего агента Lipofectamine® 3000.
Для осуществления трансфекции в группе с раствором плазмидной ДНК и Lipofectamine® 3000 брали 2 микропробирки бессывороточной среды аМЕМ по 25 мкл в каждой (для 1 лунки), затем в первую вносили 0,75 мкл трансфицирующего агента, а во вторую — 0,5 мкг плазмидной ДНК (pC4W-GL3 или pEGFP-N2) и 1 мкл реагента Р3000, размещали пробирки на вортексе в течение 1 мин. и затем смешивали содержимое двух пробирок. Итоговый объем составлял 50 мкл. смесь еще раз взбалтывали на вортексе и инкубировали в течение 1 5 мин. при комнатной температуре. В контрольных группах с гидрогеле-выми материалами и Lipofectamine® 3000 осуществляли аналогичные действия, а после смешивания содержимого двух пробирок добавляли равное количество гидрогелей (50 мкл). Предварительно материалы разводили в воде для инъекций в соотношении 1:1. Затем с клеток отбирали культуральную среду, добавляли ген-активированный гель непосредственно на клетки, после чего добавляли в лунки 400 мкл культуральной среды.
Оценка эффективности доставки генных конструкций в клетки производилась через 48 ч. после начала со-инкубирования методами проточной цитофлуориме-трии, флуоресцентной микроскопии и люминесценции.
Проточная цитофлуориметрия. Определение количества клеток, экспрессирующих egfp, доставленный pEGFP-N2, осуществляли на проточных цитометрах Guava EasyCyte 8HT (Millipore, США) и BD FACS Aria III (BD Bioscience, США) с помощью программного обеспечения InCyte (Millipore, США) и FACS Diva 8 (BD Bioscience, США), соответственно. Чтобы при анализе клеточной популяции не учитывать вклад фрагментов клеток
и дебриса в значение флуоресценции, на графике бокового светорассеивания (Side Scatter) против прямого светорассеивания (Forward Scatter) выделяли регионом (gate) только популяцию клеток, которые по размерам соответствовали фибробластам. В соответствующем канале считывания (530/30 нм — для клеток, экспресси-рующих egfp) осуществляли детекцию флуоресцентного сигнала. Положительными считали клетки, обладающие уровнем флуоресценции выше уровня автофлуоресценции контрольных клеток. С помощью региона отделяли и подсчитывали положительные, то есть обладающие флуоресценцией клетки, от отрицательных. Оценку средней интенсивности флуоресценции (от англ. Median Fluorescence Intencity, MFl) осуществляли на гистограмме, соответствующей определенному каналу считывания, путем выделения регионом пика клеток, обладающих флуоресценцией.
Детекция люминесценции. Детекцию люминисценции (обусловленную продукцией клетками люциферазы, кодируемой pC4W-GL3) осуществляли из общего белка, полученного из клеточных лизатов. Клеточный лизат для определения концентрации белка и уровня люминесценции трансфицированных клеток через 48 ч. после транс-дукции готовили при мощи RLB буфера для лизиса клеток (Promega, Италия), согласно инструкции производителя. Из лунок осторожно удаляли питательную среду, а затем промывали PBS (phosphate buffered saline). Группы с гидрогелями промывали PBS несколько раз до полного удаления материала из лунок. Затем в лунки добавляли 1Х буфер для лизиса клеток в количестве 200 мкл на лунку. Тщательно перемешивали клетки в лизирующим растворе, затем содержимое лунок переносили в эппендорф, замораживали на льду в течении 20 мин. После этого эппендорфы оттаивали при комнатной температуре и центрифугировали полученную смесь при 12 000g в течение 2 мин. (в соответствии с протоколом Promega) с использованием центрифуги с охлаждением до 4С MIKRO 220 R (Hettich, США). супернатант, содержащий выделенный белок, переносили в новую пробирку и хранили при -80°С в низкотемпературном морозильнике DW-86L388 (Haier, США). Детекцию люминесценции и измерение количества белка проводили в клеточных лизатах. Для измерения концентрации тотального белка, выделенного из клеток, использовали метод бицинхониновой кислоты. Реакцию проводили с использованием коммерческого набора Pierce™ BCA Protein Assay Kit (ThermoScientific, США). Для приготовления рабочего раствора смешивали реагент А (раствор, содержащий бицинхониновую кислоту, карбонат натрия, тартрат натрия, бикарбонат натрия в 0,1 н NaOH pH 11,25) и Реагент Б (4% CuSO4x5H2O) в соотношении 50:1. Смешивали 12,5 мкл исследуемого образца и 100 мкл рабочего раствора в 96-луночном планшете. Смесь инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Затем вынимали образец из термостата, дожидались, когда температура образца сравняется с комнатной и измеряли уровень абсорбции при 562 нм с помощью Tecan F Plex. Количество белка калибровали при помощи стандартных титров из набора Quick start bovine serum albumin standart (Lot: 5000206, Bio-rad). Детекцию люминесценции проводили при помощи Tecan F Plex. На 1 лунку черного 96-луночного планшета добавляли 20 мкл исследуемого клеточного лизата и сразу вносили 100 мкл Luciferase Assay System (Promega, Италия). оценка люминесценции проводилась на 1, 2, 4, 5, 10, 15, 20, 30 мин. после добавления реагента.
Флуоресцентная микроскопия. Для детекции флюоресценции трансфицированных pEGFP-N2 клеток использовали лазерный конфокальный микроскоп Zeiss LSM780 (Carl Zeiss, Германия). Предварительно из лунок
с культурами клеток удаляли питательную среду, а затем промывали PBS (phosphate buffered saline), чтобы исключить артефакты от гелевых материалов.
Оценка биосовместимости in vitro
Первичную качественную оценку биосовместимости in vitro проводили в ходе выполнения эксперимента по определению эффективности доставки генных конструкций прототипами ген-активированных гелей с использованием световой микроскопии и сравнением с контрольными культурами клеток. Для основной оценки биосовместимости in vitro использовали отдельный эксперимент с использованием культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека (ММСК), предоставленных Рязанским государственным медицинским университетом им. И.П. Павлова.
Культивирование клеток. Размороженные культуры ММСК после отмывки от криоконсерванта культивировали в среде MesenCult (Stem Cell Technologies, Канада) при температуре 37°С и содержании СО2 5% в культу-ральных флаконах с площадью 75 см2. Первую смену среды осуществляли через 1 сут., затем через каждые 3-4 сут. При достижении 70-80% конфлюэнтности монослоя клетки снимали с поверхности культурального пластика с помощью 0,25% раствора Trypsin/EDTA (Stem Cell Technologies, Канада), ресуспендировали в культуральной среде MesenCult (Stem Cell Technologies, Канада) и расселяли в соотношении 1:3. Подсчет количества клеток проводили в камере Горяева. Необходимое количество клеток переносили в новый культуральный флакон и добавляли свежую культуральную среду (общий объем среды во флаконе Т25 — 5 мл, Т75 — 10 мл).
Оценка жизнеспособности и пролиферативной активности клеток под влиянием прототипов ген-активированных материалов. В ходе исследования ММСК размещали в 96-луночном культуральном планшете в количестве 1 х 104 клеток в 100 мкл питательной среды, инкубировали в СО2-инкубаторе 24 ч. На следующий день после рассева клеток меняли нормальную среду на среду с исследуемыми веществами. Экстракты тестируемых гелей в четырёх разведениях (10, 25, 50-кратное) вносили в 96-луночный планшет в объёме 100 мкл на лунку, предварительно удалив из лунки среду. Отрицательный контроль: среда + клетки; положительный контроль: среда + клетки + 3% раствор пероксида водорода. Планшет с внесенными соединениями помещали в СО2-инкубатор, где выдерживали 3 ч. Затем подготавливали рабочий раствор MTS: смешивали в определенных концентрациях растворы MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолиум) и PMS (феназин метосульфат). Затем вносили в каждую лунку по 20 мкл рабочего раствора МTS, инкубировали 1 ч. в условиях СО2-инкубатора. С помощью микропланшетного ридера Stat Fax 3200 (microplate reader) (Awareness tec^^^gy Inc. Palm City, FL 34990, USA) определили оптическую плотность каждой лунки при 492 нм, вычитая измеренное фоновое поглощение при 630 нм.
Оценка миграционной активности клеток под влиянием прототипов ген-активированных гелей. Культуры ММСК размещали в 12-луночном планшете (Corning, США) в количестве 105 на лунку и культивировали до образования монослоя с конфлуентностью 90%, после чего наносили повреждение монослоя шириной 1000 мкм. После нанесения повреждения питательную среду с открепленными клетками удаляли, промывали раствором DPBS, добавляли рабочий раствор исследуемых веществ в заданных концентрациях. Осуществляли фотофиксацию зон повреждений монослоя с помощью
инвертированного фазово-контрастного микроскопа Olympus СКХ 53 с камерой DeltaPix и ПО DeltaPix Image. Микрофотографии делали в трех полях зрения с интервалом — 24 ч. Каждые 48 ч. для чистоты поля зрения питательную среду заменяли на новую. Фотографирование выполняли до момента восстановления целостности монослоя. Обработку изображений производили с помощью программного обеспечения ImageJ [ImageJ bundled with 64-bit Java 1.8.0_112 imagej.nih. gov], измеряли не менее 8 поперечных горизонтальных расстояний от самых удаленных и самых приближенных точек повреждения. Данные заносились в таблицу для дальнейшего статистического анализа.
Статистический анализ
На первом этапе для статистического анализа полученных данных были использованы описательные методы: определение среднего значения, медианы, среднего квадратического отклонения, стандартной ошибки среднего значения, межквартильного размаха, нижнего и верхнего квартилей. Затем было выполнено определение соответствия распределения количественных признаков в каждой группе закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка для выбора критериев для дальнейшего анализа. Учитывая непараметрическое распределение количественных признаков для одновременного сравнения четырех групп был использован непараметрический критерий Краскелла-Уоллиса, а для выявления различий между двумя группами по-отдельности — U-критерий Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Для внутригрупповых значений на разных сроках наблюдения применяли критерий Вилкоксона. Во всех случаях уровень статистической значимости различий был принят за p<0,05.
Результаты и обсуждение
Все гидрогели без технических сложностей равномерно смешивались с водными растворами плазмидных ДНК заданных концентраций, что позволяло изготавливать прототипы ген-активированных гидрогелей для запланированных исследований.
Важной проблемой, которую необходимо было решить на подготовительном этапе исследования, являлась потенциальная несовместимость гидрогелевых
матриксов-носителей, особенно содержащих микрочастицы фосфатов кальция, и методики оценки жизнеспособности клеток (MTS-тест). В ходе выполнения предварительного эксперимента с совместной инкубацией ММСК и прототипов ген-активированных гелей было выявлено, что гели нарушали светооптические свойства среды, что значительно затрудняло, и во многом делало невозможным проведение исследований с использованием микроскопа и микропланшетного ридера — теста на оценку миграционной активности клеток и одноступенчатого МТТ-теста. Кроме этого, образующий плотный осадок в случаях гелей с микрочастицами фосфатов кальция полностью покрывал всю поверхность монослоя клеток и лунки, физически затруднял миграцию клеток, в некоторых случаях приводил к полной гибели культуры. В этой связи, для получения релевантных результатов оптимальным стало приготовление экстрактов из исследуемых гелей. Экстракты готовили в соответствии с рекомендациями ГОСТ Р ИСО 10993-52009. 100 мкл геля смешивали с 1000 мкл питательной среды, инкубировали в орбитальном шейкере-инкубаторе 24 ч. при 37°С и 150 оборотах в мин., экстракцию проводили в стерильных, химически инертных закрытых контейнерах с соблюдением правил асептики в соответствии с ИСО 10993-12. Надосадочную жидкость в разведениях с культуральной средой (10, 25, 50-кратное] использовали для добавления к культивируемым клеткам.
Биосовместимость гелевых материалов in vitro
В экспериментах in vitro, выполненных как на культурах фибробластов (рис. 1], так и на ММСК жировой ткани человека было показано, что КГА и КФ, как и ген-активированные изделия на их основе при со-инкубировании в непосредственном контакте с клетками оказывали цитотоксический эффект, приводя большую часть культуры к гибели. Вероятно, этот эффект обусловлен влиянием микрочастиц кальция в данных модельных условиях.
При оценке влияния экстрактов исследуемых гидрогелей и ген-активированных материалов на их основе на жизнеспособность ММСК в культуре были получены следующие результаты. При качественной оценке, в 1 сутк. после добавления всех гидрогелей культуры были представлены преимущественно фибробласто-подобными клетками с неравномерной по плотности цитоплазмой, хорошо заметным крупным ядром. такие
Таблица. Прирост интенсивности клеточного дыхания под воздействием экстрактов ген-активированных гидрогелей в различных разведениях
Ген-активированные гидрогели
Разведения экстрактов ген-активированных гидрогелей
х10
х25
х50
х75
На основе КФ На основе ПГК-ПЭГ На основе ГК На основе КГА
21,6% 18,1% 13,5% 24,5%
26,6% 20,0% 13,5% 12,9%
30,9% 12,4% 19,4% 7,7%
55,2%
23,2% 5,8%
клетки активно пролиферирировали, перекрывая друг друга участками цитоплазмы. На 3 сут. наблюдались крупные, широко распластанные клетки полигональной, округлой или неправильной формы с множественными короткими отростками, четко очерченное ядро располагалось по центру каждой клетки. Оптически более плотная эндоплазма была овальной или веретеновидной формы, периферическая часть цитоплазмы прозрачная, иногда зернистая. Выявлялись делящиеся и многоядерные клетки. Учитывая, что к 4 сут. культивирования клетки практически достигали заполняли всю площадь культурального флакона, можно сделать вывод, что изменение морфологии и снижение пролиферативной активности связано, в первую очередь, с достижением высокой конфлюэнтности. Присутствие гидрогелей в рабочем разведении х10 значимого влияния на морфологию клеток не оказывало.
По данным MTT-теста, экстракты исследуемых гидрогелей во всех разведениях не оказывали цитоток-сического эффекта (табл.).
Все гидрогели достоверно увеличивали время удвоения клеточных популяций во всех разведениях (рис. 5), однако среди разных разведений статистически значимая разница не наблюдалась. Наименьшее влияние на скорость удвоения популяции ММСК оказал гель ГК, вероятно, ввиду отсутствия в своем составе твердой фракции, образующей осадок на поверхности клеток и флакона. Остальные гели оказывали сравнительно одинаковое влияние на клетки в соответствующих разведениях, однако наименьшее изменение скорости удвоения популяции наблюдалось в разведении х50.
По данным скарификационного теста, ни один из вариантов гидрогелевых матриксов-носителей или ген-активированных прототипов изделий на их основе не оказывал влияние на миграционную активность ММСК в скарификационном тесте.
Эффективность поступления
плазмидной ДНК ген-активированных
гелей в клетки-мишени in vitro
По данным проточной цитофлуориметрии уровень аутофлуоресценции контрольной культуры фибробластов (без каких-либо дополнительных компонентов) и клеток, в среду которых был внесен трансфицирующий агент, составил 0,04% и 0,06%, соответственно. Количество клеток, акцептировавших маркерную pEGFP-N2, введенную в растворе без дополнительных компонентов, не превысило 0,03%. При этом использование Lipofectamine® 3000 обеспечивало экспрессию трансгена у 29,34% клеток (рис. 2). При люминисцентном исследовании, в случае интактных фибробластов уровень сигнала составил 126,08±15,65; в группе с Lipofectamine® 3000 без плазмидной ДНК — 93,46±27,41; при введении в среду раствора pC4W-GL3 без трансфицирующего агента — 20,4±11,24; а в случае применения маркерной плазмиды
с Lipofectamine® 3000 — 104 091,94±4325,35 RLU (p<0,05). Таким образом, обе маркерные плазмиды при использовании агента, усиливающего их доставку в клетки, обеспечивали экспрессию трансгена.
Из пяти исследованных гидрогелей и ген-активированных прототипов на их основе 3 варианта в данной экспериментальной модели (прямой контакт исследуемого материала с монослоем клеток) не оказали цитотоксический эффект — К, ГК и ПГК-ПЭГ. В случае других двух гидрогелей — КГА и КФ, — характеризовавшихся наличием в своем составе твердых микрочастиц, количество выживших клеток через 48 ч. со-инкубирования было недостаточным для выполнения проточной цитоф-луориметрии. В случае ген-активированного гидрогеля на основе ПГК-ПЭГ проточную цитофлуориметрию выполнить не удалось. Однако все культуры были использованы для люминисцентного исследования, предполагающего предварительный лизис клеток и, тем самым, позволяющего оценить доставку маркерной pC4W-GL3 во все клетки, в том числе погибшие в ходе исследования. Цитотоксический эффект КГА и КФ был подтвержден и при качественной оценке клеточных культур (см. рис. 1).
Было установлено, что ген-активированные гели на основе ГК и К в данных условиях без применения трансфицирующего агента практически не обеспечивали доставку генных конструкций, флуоресценция определялась лишь от 0,15% и 0,29% клеток, соответственно. При этом люминисцентный сигнал составил 32 540± 145,03 RLU и 25 311,52±678,14 RLU, соответственно (p=0,572). Если принять уровень люминис-цении от контрольной культуры фибробластов, транс-фицированных pC4W-GL3 в присутствии Lipofectamine® 3000, за 100%, то в случае ген-активированного геля на основе ГК количество продуцированной трансфици-рованными клетками люциферазы составило 31,26%, а в группе с ген-активированным гидрогелем на основе К — 24,31%. При этом, уровень люминисценции в случае ген-активированных гидрогелей на основе КГА, ПГК-ПЭГ и КФ не превышал 200 RLU.
Таким образом, в условиях in vitro при со-инкубации фибробластов с ген-активированными гелями в непосредственном контакте только варианты на основе ГК и К не оказывали негативного влияния на культуры и в присутствии трансфицирующего агента обеспечивали доставку генных конструкций в клетки. При этом, факт низкого уровня трансфекции без использования Lipofectamine® 3000, по всей видимости, обусловлен как короткими сроками проведения исследования (более длительные сроки наблюдения в условиях прямого контакта гидрогеля с клетками не выполнимы в виду необходимости замены среды и неизбежного изъятия части материалы в неконтролируемом количестве при ее замене), так и отсутствием условий для миграции клеток в структуру материала, что является важным аспектом для пассивной
Рис. 2. Количество фибробластов, испускающих флуоресцентный сигнал, соответствующий ЕвРР в присутствии различных исследуемых веществ: А — интактные фибробласты; Б — Lipofectamiгe® 3000, В — рЕвРР; Г — рЕвРР + Lipofectamiгe® 3000; Д -К + Lipofectamiгe® 3000; Е — К + рЕвРР; Ж — К + рЕвРР + Lipofectamiгe® 3000; З — ГК + L¡pofectam¡гe® 3000; И — ГК + рЕвРР; К — ГК + рЕвРР + Lipofectamiгe® 3000. Проточная цитофлуориметрия
доставки генных конструкций. При этом полученные результаты по эффективности доставки генных конструкций из гидрогелей на основе К и ГК коррелируют с результатами других исследований [13, 14].
Заключение
Таким образом, экстракты исследованных гидро-гелевых матриксов-носителей и ген-активированных материалов на их основе не оказывали цитотоксических эффектов на культуры клеток in vitro, однако при непосредственном контакте материалов на основе КФ и КГА цитотоксическое влияние наблюдалось. Эффективность трансфекции в случае гидрогелей на основе К и ГК без использования трансфицирующего агента оказалась низкой, а при его использовании — 24 и 31%,
соответственно. При этом другие варианты гидрогелей доставку плазмидных ДНК не обеспечивали, возможно, в виду цитотоксических эффектов.
Для всесторонней оценки уровня доставки генных конструкций требуется выполнение исследований in vivo.
Благодарности
Работа выполнена за счет средств граната Российского научного фонда по контракту № 18-7510085 от 08.08.2018 года Авторы выражают благодарность к. м. н. П.И. Макаревичу, заведующему лабораторией генно-клеточной терапии медицинского научно-образовательного центра МГУ им. М.В. Ломоносова за предоставление маркерной плазмидной ДНК с геном Luc.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Lev R., Seliktar D. Hydrogel biomaterials and their therapeutic potential for muscle injuries and muscular dystrophies. J.R. Soc. Interface. 2018; 15(138): pii: 20170380.
2. Ruvinov E., Tavor Re'em T., Witte F., Cohen S. Articular cartilage regeneration using acellular bioactive affinity-binding alginate hydrogel: A 6-month study in a mini-pig model of osteochondral defects. J. Orthop. Translat. 2018; 16: 40-52.
3. Li L., Yu F., Zheng L. et al. Natural hydrogels for cartilage regeneration: Modification, preparation and application. J. Orthop. Translat. 2018; 17: 26-41.
4. Mandla S., Davenport Huyer L., Radisic M. Review: Multimodal bioac-tive material approaches for wound healing. APL Bioeng. 2018; 2(2): 021503.
5. Деев Р.В., Дробышев А.Ю., Бозо И.Я. Ординарные и активированные остеопластические материалы. Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова 2015; 1: 51-69.
6. Komatsu K., Shibata T., Shimada A., et al. Cationized gelatin hydrogels mixed with plasmid DNA induce stronger and more sustained gene expression than atelocollagen at calvarial bone defects in vivo. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2016; 27(5): 419-30.
7. Mulder G., Tallis A.J., Marshall V.T., et al. Treatment of nonhealing diabetic foot ulcers with a platelet-derived growth factor gene-activated matrix (GAM501): results of a phase 1/2 trial. Wound Repair Regen. 2009; 17(6): 772-9.
8. Blume P., Driver V.R., Tallis A.J., et al. Formulated collagen gel accelerates healing rate immediately after application in patients with diabetic neuropathic foot ulcers. Wound Repair Regen. 2011; 19(3): 302-8.
9. Shapiro G., Lieber R., Gazit D. et al. Recent Advances and Future of Gene Therapy for Bone Regeneration. Curr. Osteoporos. Rep. 2018; 16(4): 504-11.
10. Bozo I.Y., Deev R.V., Drobyshev A.Y. et al. World's First Clinical Case of Gene-Activated Bone Substitute Application. Case Rep. Dent. 2016; 2016: 8648949.
11. Деев Р.В., Дробышев А.Ю., Бозо И.Я. и др. Создание и оценка биологического действия ген-активированного остеопластического материала, несущего ген VEGF человека. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2013; 8(3): 78-85.
12. Червяков Ю.В., Староверов И.Н., Власенко О.Н. и др. Пятилетние результаты лечения больных хронической ишемией нижних конечностей с использованием генной терапии. Ангиология и сосудистая хирургия 2016; 22(4): 38-45.
13. Villate-Beitia I., Truong N.F., Gallego I. et al. Hyaluronic acid hydrogel scaffolds loaded with cationic niosomes for efficient non-viral gene delivery. RSC Adv. 2018; 8(56): 31934-42.
14. Tokatlian T., Cam C., Segura T. Non-viral DNA delivery from porous hyaluronic acid hydrogels in mice. Biomaterials 2014; 35(2): 825-35.
Поступила: 10.04.2019
