Исследование экспрессии факторов транскрипции плюрипотентности в мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках из третьих моляров человека, трансфицированных плазмидой pBud-Sox2-Oct4 Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ фАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ

плюрипотентности в мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках из третьих моляров человека,

ТРАНСфИЦИРОВАННыХ ПЛАЗМИДОй PBUD-SOX2-OCT4

В.В. Соловьева 1, Н.Л. Блатт 1, Д.С. Гусева 23, М.Э. Ялвач 4 5, Ф. Шахин 4, Р.Р. Исламов 2, А.А. Ризванов 1

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

2 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия

3 Ганноверский медицинский университет, Гэнновер, Германия

4 Университет Едитепе, Стамбул, Турция

5 Детский госпиталь в Колумбусе, Колумбус, США

Expression of pluripotency transcription factors in human third molar tooth germ derived multipotent mesenchymal stromal cells transfected by plasmid pBud-Sox2-Oct4

W. Solovyeva 1, N.L. Blatt 1, D.S. Guseva 23, M.E. Yalvac 4 5, F. Sahin 4, R.R. Islamov 2, A.A. Rizvanov1

1 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia

2 Kazan State Medical University, Kazan, Russia

3 Hannover Medical School, Hannover, Germany

4 Yeditepe University, Istanbul, Turkey

5 Children's Hospital Columbus, Columbus, United States

В ходе работы была создана двухкассетная плазмидная конструкция на основе вектора pBudCE4 . 1, кодирующая факторы транскрипции S0X2 и 0СТ4 . Экспрессия рекомби-нантных генов подтверждена с помощью иммуноблотинга . Показано, что генетическая модификация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из зачатков третьих моляров человека, полученной рекомбинантной плазмидой приводит к увеличению уровня экспрессии не только факторов транскрипции S0X2 и 0СТ4 в исследуемых клетках, но и фактора транскрипции NAN0G . Анализ гистологических срезов подкожных им-плантатов Матригеля, содержащих флуоресцентно меченные ММСК, показал, что генетическая модификация не оказывает влияния на их жизнеспособность

Ключевые слова: экспрессионная плазмида, мульти-потентные мезенхимальные стромальные клетки, зачатки третьих моляров человека, факторы транскрипции, S0X2, 0СТ4, плюрипотентность, трансфекция .

in this study, the double expression cassette plasmid, based on pBudCE4 . 1 vector encoding transcription factors S0X2 and 0CT4 was constructed using standard gene engineering techniques . Expression of recombinant genes was confirmed by immunoblotting it is shown that genetic modification of multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC), isolated from human third molar tooth germs, with resulting recombinant plasmid increases the level of expression both, transcription factors S0X2 and 0CT4 in the treated cells, and also transcription factor NAN0G . Analysis of histological sections of subcutaneous Matrigel implants, containing fluorescently labeled MMsC, showed that genetic modification had no effect on cell viability

Keywords: expression plasmid, multipotent mesenchymal stromal cells, third molar dental follicles, transcription factors, S0X2, 0CT4, pluripotency, transfection .

Введение

Возможность возврата дифференцированных клеток в плюрипотентное состояние впервые была показана K . Takahashi и S . Yamanaka в 2006 г . путем репрограммирования с помощью факторов транскрипции [1]. В начале 2007 г . было опубликовано три независимых исследования, в которых авторы продемонстрировали, что трансфекция культуры фибробластов четырьмя факторами транскрипции 0CT3/4, S0X2, C-MYC и KLF4 приводит к репрограм-мированию клеток и индукции плюрипотентного состояния [2—4]. Описанный подход получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) имеет большой потенциал для развития клеточной терапии различных заболеваний человека . ИПСК обладают свойствами эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и в экспериментах in vitro способны спонтанно дифференцироваться в эмбриональные клетки эктодермы, эндодермы и производные мезодермы

На сегодняшний день для доставки кДНК генов факторов транскрипции в клетки-мишени применяют как вирусные векторные системы (в основном рекомбинантные ретровирусы), так и невирусные системы (например, доставка кДНК генов факторов

e-mail: Albert. Rizvanov@kpfu . ru

транскрипции в составе экспрессионных плазмид-ных векторов). Данные системы позволяют избежать онкогенных и иммуногенных свойств вирусных векторов, а также инсерционного мутагенеза .

Решающее значение для поддержания плюрипотентности ЭКС имеют факторы транскрипции Б0Х2 и 0СТ4 . Показано, что при снижении уровня экспрессии 0СТ4 ЭСК дифференцируются в трофобласт-подобные клетки [5—6].

Ранее М . Е . Уа^ас с соавт . (2009) данной публикации показали, что пульпа зуба, в частности, пульпа зачатка третьего моляра человека (зуба мудрости), является источником «мультипотентных стволовых клеток» [7—8]. По своим морфологическим и фе-нотипическим свойствам эти клетки аналогичны мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам (ММСК) . Основным преимуществом для использования ММСК, выделенных из зачатков третьих моляров человека (ММСК-ЗТМ), является доступность биологического материала При определенных условиях культивирования ММСК-ЗТМ способны дифференцироваться в остеогенном, адипогенном, хондрогенном и нейрогенном направлениях, а также образовывать капилляро-подобные

структуры на Матригеле, что свидетельствует об их ангиогенном потенциале [8]. Эти свойства ММСК-ЗТМ открывают перспективы их использования в биомедицинских приложениях, таких как клеточной терапии и тканевой инженерии

Последние исследования показали, что предшественниками значительной популяции ММСК в процессе развития зуба и регенерации, включающей производящие клетки пульпы и одонтобласты, являются клетки глии периферических нервов [9] . Стоит отметить, что эти данные отличаются от ранее выдвинутой теории о происхождении стволовых клеток «мягких тканей» зуба из клеток нервного гребня [10].

Все эти свойства позволяют предположить, вероятно, более выраженный регенеративный потенциал ММСК-ЗТМ с целью стимуляции посттравматической нейрорегенерации и терапии нейродегенера-тивных заболеваний в сравнении с ММСК жировой ткани и костного мозга, на сегодняшний день считающихся наиболее перспективными и имеющих другое эмбриональное происхождение по сравнению с ММСК пульпы зубов

ММСК имеют потенциал трансдифференцировки в нейральную стволовую клетку Все эти свойства позволяют рассматривать ММСК зубов как один из источников клеточного материала для терапии ней-ротравм и нейродегенеративных заболеваний [11].

Ранее было показано, что ММСК-ЗТМ экспрес-сируют поверхностные антигены, характерные для ММСК, но не для гемопоэтических стволовых клеток [12]. Также было показано, что ММСК-ЗТМ имеют значительный уровень экспрессии мРНК генов с-тус и Ш-4 в сравнении с ЭСК человека [8].

В настоящем исследовании для повышения плюрипотентного потенциала ММСК, выделенных из зачатков третьих моляров человека, нами был сконструирован экспрессионный плазмидный вектор pBud-Sox2-Oct4, одновременно экспрессирующий факторы транскрипции SOX2 и 0СТ4. Исследована функциональность полученной экспрессионной плазмиды, а также жизнеспособность генетически модифицированных плазмидой pBud-Sox2-0ct4 ММСК-ЗТМ в подкожных имплантатах Матригеля® у лабораторных животных

Материал и методы

Создание экспрессионного плазмидного вектора

Клонирование генов sox2 и осЬ4 человека осуществляли в несколько этапов . На первом этапе была проведена ОТ-ПЦР-амплификация кДНК соответ-

ствующих генов с использованием специфических праймеров (табл . 1) и ДНК-полимеразы PrimeSTART (Takara bio inc . ) . В качестве источника РНК для ОТ-ПЦР амплификации гена oct4 использовали культуру ЭСК (линия hESM 01) [13]. В качестве матрицы для ПЦР-амплификации гена sox2 была использована плазмида с клонированной кДНК, любезно предоставленная проф . С . Л . Киселевым (Институт общей генетики им . Н . И . Вавилова, Москва).

На следующем этапе путем инкубации с GoTaq полимеразой (Promega) к 3' концам ПЦР-продуктов были добавлены аденозины После очистки ПЦР продуктов проводили TA-клонирование в вектор pGEM®-T Easy (Promega) в соответствии с инструкцией производителя . кДНК генов sox2 и oct4 из полученных плазмид pGEM-Sox2 и pGEM-0ct4 субклонировали в экспрессионный плазмидный вектор pBudCE4 . 1 (Life Technologies) путем рестрикционного расщепления ферментами Kpni/Xhoi и Sali/Xbai (Promega), соответственно . Правильность сборки плазмидной конструкции pBud-Sox2-0ct4 подтверждали секвенированием с помощью стандартных вектор-специфичных прай-меров на автоматическом секвенаторе ABi Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) .

Культуры клеток

ММСК были выделены из непрорезавшихся зачатков третьих моляров, извлеченных хирургическим путем у здоровых добровольцев (11—17 лет) как часть подготовительного лечения по ортодонти-ческим причинам Выделение ММСК проводили по методике, описанной ранее [7—8].

Для подтверждения функциональности плазмиды pBud-Sox2-0ct4 в работе использовали иммортали-зированную линию первичных эмбриональных клеток почки НЕК293 человека (human embryonic kidney 293 cells) (ATCC Number: CRL-11268) .

Культуры клеток ММСК-ЗТМ и НЕК293 поддерживали в среде DMEM (invitrogen, США), с содержанием сыворотки крови плодов коровы (fetal bovine serum, FBS) в конечной концентрации 10% (Sigma, США), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США) и 2 мМ L-глутамина (Sigma, США) . Инкубацию проводили при 37°С во влажной атмосфере и 5% содержанием СО2 .

Для генетической модификации клеток НЕК293 и МСК-ЗТМ экспрессионной плазмидой pBud-Sox2-0ct4 использовали трансфекционный агент TurboFect (Thermo Fisher Scientific, США) согласно инструкции производителя

Таблица 1. Праймеры, используемые для ОТ-ПЦР-амплификации специфических генов

Название Нуклеотидная последовательность 5'^3' Комментарии

hSox2-ORFF-KpnI CACgGtaCCacCATGTACAACATGATGG Прямой/Первый раунд ОТ-ПЦР

hSox2-ORFR-Stop-XhoI TCCtcgagTCACATGTGTGAGAGGGGCAG Обратный/Первый раунд ОТ-ПЦР

hOct4-6F(1st) GCAAGCCCTCATTTCACC Прямой/Первый раунд ОТ-ПЦР

hOct4-1384R(1st) TGTGTCCCAGGCTTCTTTATT Обратный/Первый раунд ОТ-ПЦР

hOct4v1-ORFF-BamHI-SalI GGGgatCcgtCgaCaCCATGGCGGGA Прямой/Второй раунд ПЦР

hOct4v1-ORFR-Stop-XbaI-EcoRI CCCCATTCCTAGAgaattctctAgaTCAGTTTGAATGC Обратный/Второй раунд ПЦР

Иммуноблоттинг (вестерн блот анализ)

Электрофорез белков лизатов клеток HEK293, трансфицированных плазмидой pBud-Sox2-0ct4, в полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли [14]. Вестерн блот анализ белков был проведен с применением первичных поликлональных антител кролика к 0CT4 (0ct-3/4(H-134), sc-9081, Santa Cruz Biotechnology, разведение 1:500), по-ликлональных антител козла к S0X2 (Sox-2(Y-17), sc-17320, Santa Cruz Biotechnology, разведение 1:500) и вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (Anti-Goat igG-HRP #A5420, Anti-Rabbit igG-HRP #A0545, Sigma-Aldrich, разведение 1:2000). Визуализацию иммунного преципитата проводили с помощью набора для хемилюми-несцентной детекции белка Amersham™ ECL™ Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Германия). Люминесценцию детектировали на приборе ChemiDoc™ XRS+ System (Bio-Rad, Сингапур)

Анализ экспрессии мРНК генов факторов транскрипции в генетически модифицированных ММСК-ЗТМ

Через 48 ч . после трансфекции клеточный осадок собирали с помощью центрифугирования . Общую РНК из клеточных осадков выделяли с помощью набора High Pure RNA isolation Kit (Roche) согласно инструкции фирмы производителя мРНК, выделен-

ная из ЭСК человека hESM 01, была любезно предоставлена проф . С . Л . Киселевым (Институт общей генетики им . Н . И . Вавилова, Москва) [13]. Синтез кДНК осуществляли с помощью набора 0mniscript Reverse Transcriptase Kit (Qiagen, США), согласно инструкции фирмы производителя

Праймеры и пробы TaqMan для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) были разработаны с использованием программы PrimerExpress (Applied Biosystems, США) на основании нуклеотидных последовательностей генов-мишеней, полученных из базы данных GeneBank Пробы для ПЦР-РВ содержали 5'-концевую флуоресцентную метку FAM и 3'-концевой гаситель RTQ-1 Синтез праймеров и проб осуществляла компания Синтол (Москва, Россия) (табл . 2). Для ПЦР-РВ по технологии TaqMan применяли 2,5х реакционную смесь (Синтол, Россия) в соответствии с инструкцией производителя ПЦР-РВ для количественного анализа экспрессии мРНК генов факторов транскрипции и b-actin проводили на оборудовании iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США), как описано ранее [8]. Реакции ПЦР-РВ выполняли в дубликатах

Статистический анализ

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента в программе Excel 2007 . Уровень экспрессии мРНК генов факторов транскрипции в ЭСК считали за 100% .

Название Нуклеотидная последовательность 5'^3'

h-p-Actin-TMprobe CCAGCCATGTACGTTGCTATCCAGGC

h-p-Actin-TM-F GCGAGAAGATGACCCAGGATC

h-p-Actin-TM-R CCAGTGGTACGGCCAGAGG

h-Oct4-TMprobe621 TCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGT

h-Oct4-TM499F CGACCATCTGCCGCTTTG

h-Oct4-TM664R GCAAGGGCCGCAGCTTA

h-c-Myc-TMprobe1494 TACGCAGCGCCTCCCTCCACTC

h-c-Myc-TM1472F CGTCTCCACACATCAGCACAA

h-c-Myc-TM1539R TCTTGGCAGCAGGATAGTCCTT

h-Klf4-TMprobe1414 CCGGTTCCTGCATGCCAGAGGA

h-Klf4-TM1387F CGCTCCATTACCAAGAGCTCAT

h-Klf4-TM1463R CGATCGTCTTCCCCTCTTTG

h-Nanog-TMprobe453 TGCAGAGAAGAGTGTCGCAAAAAAGG

h-Nanog-TM431F CCAAAGGCAAACAACCCACTT

h-Nanog-TM499R TCTTGACCGGGACCTTGTCT

h-Sox2-TMprobe763 CCGGCGGAAAACCAAGACGCT

h-Sox2-TM717F TGCGAGCGCTGCACAT

h-Sox2-TM809R GCAGCGTGTACTTATCCTTCTTCA

Таблица 2. Праймеры и пробы для ПЦР в режиме реального времени

Трансплантация клеток лабораторным

животным

Все процедуры с животными проводили в соответствии с правилами, рекомендованными Физиологической секцией Российского национального комитета по биологической этике . Лабораторные крысы Rattus norvegicus линии Wistar были приобретены в питомнике лабораторных животных «Пущи-но» (Московская область). Животные содержались в питомнике Казанского государственного медицинского университета с неограниченным доступом к корму и воде

Перед трансплантацией ММСК-ЗТМ метили флуоресцентным красителем PKH67 (зеленый спектр флуоресценции) в соответствии с инструкциями производителя (Sigma-Aldrich, США), который позволяет идентифицировать трансплантированные клетки в гистологических срезах . Используемый флуоресцентный краситель позволяет проводить окрашивание мембран живых клеток (витальный краситель) без существенного влияния на их жизнеспособность и другие биологические свойства

Генетически модифицированные ММСК-ЗТМ вводили крысам подкожно в виде суспензии в Ма-тригеле — компонент базальной мембраны, секрети-руемый клетками мышиной саркомы Энгельбрета — Хольма — Сварма . Эта смесь является аналогом внеклеточного матрикса и используется в экспериментальной биологии в качестве субстрата для культивирования клеток [15].

Для 1 инъекции 400 мкл холодного (4°С) Матри-геля (Matrigel™ Matrix, BD Biosciences, США) смешивали со 100 мкл суспензии клеток в культуральной среде. Инъекции проводили инсулиновым шприцем с иглой толщиной 23G таким образом, чтобы Матри-гель успевал полимеризоваться под кожей и образовывал желеобразный имплантат . Через 72 ч . после трансплантации импланты Матригеля изымали под наркозом (хлоралгидрат 6,4% раствор внутрибрю-шинно из расчета 400 мг/кг массы животного) и замораживали в жидком азоте в среде для заморозки тканей Richard-Allan Scientific™ Neg-50™ Frozen Section Medium (Thermo Fisher Scientific, США) для последующего приготовления срезов толщиной 5 мкм на криостате Microm HM560 (Thermo Scientific inc . ).

Флуоресцентный анализ

Перед флуоресцентным анализом срезы фиксировали в 10% забуференном формалине (Sigma-Aldrich, США) в течение 30 мин . при комнатной температуре Далее срезы обрабатывали 0,1% раствором Тритона Х100 на TBS буфере в течение 20 мин Для визуализации ядер клеток срезы обрабатывали флуоресцентным красителем 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPi, Sigma-Aldrich) в течение 10 мин . при комнатной температуре После отмывки в TBS срезы заключали в среду, поддерживающую флуоресценцию, Mounting Medium Vectashield™ (Vector Laboratories inc . ). Готовые препараты хранили при +4°С в темноте Полученные препараты анализировали при помощи инвертированного флуоресцентного микроскопа AxioOberver . Z1 (Carl Zeiss, Германия) с использованием программного обеспечения AxyoVision Rel . 4 . 8 .

Результаты и обсуждение

Факторы транскрипции S0X2 и 0СТ4 являются ключевыми регуляторами плюрипотентности . Коэк-спрессия S0X2 и 0СТ4 начинается уже на стадии ранней морулы . Эти факторы обнаружены во внутренней клеточной массе бластоцисты Экспрессия обоих факторов происходит и в эпибласте [16]. Было показано, что ЭКС теряют способность к поддержанию плюрипотентности после нокдауна генов sox2 и oct4 путем РНК-интерференции [17]. Недавние исследования показали, что трансфекция стволовых клеток, выделенных из жировой ткани, с помощью кДНК генов sox2 и oct4 усиливает пролиферативную активность клеток и сокращает время перехода клеток от G1 до S клеточного цикла . Кроме того у клеток со сверхэкспрессией факторов транскрипции S0X2 и 0СТ4 способность к дифференцировке в адипоген-ном и остеогенном направлениях была выше, чем у контрольной группы клеток [18]. В связи с этим, для экспериментов по репрограммированию клеток мы создали экспрессионный плазмидный вектор, кодирующий кДНК генов sox2 и oct4.

В результате ПЦР-амплификации и последующих этапов клонирования получен экспрессионный двухкассетный плазмидный вектор pBud-Sox2-0ct4 (рис . 1) . Правильность сборки рекомбинантной плазмиды подтверждена рестрикционным анализом и секвенированием (информация не приведена) Преимуществом данного вектора является одновременная и независимая экспрессия трансгенов, контролируемая промоторами CMV и EF-1a .

Рис. 1. Схема двухкассетного плазмидного вектора pBud-Sox2-Oct4, сконструированного на основе вектора pBudCE4.1. Вектор одновременно и независимо экспрессирует факторы транскрипции SOX2 и й^4

Для подтверждения экспрессии рекомбинантных генов полученной двухкассетной плазмидой проводили трансфекцию клеток НЕК293 с использованием трансфекционного агента ТuгboFect . Анализ белковых лизатов генетически модифицированных клеток НЕК293 показал наличие специфичных белковых полос на мембране с молекулярными массами 34 кДа и 48 кДа, что соответствует ожидаемым размерам факторов транскрипции S0X2 и 0СТ4,

соответственно (рис . 2) . Таким образом, показано, что полученная двухкассетная генетическая конструкция рВиС-Бох2-0й4 экспрессирует факторы транскрипции Б0Х2 и 0СТ4 .

А

Sox2

Б

Oct4

Рис. 2. Экспрессия рекомбинантных факторов транскрипции SOX2 (панель А, 34 кДа) и 0СТ4 (панель Б, 48 кДа) в клетках НЕК293, трансфицированных плазмидой рВиё^ох2-ОсЬ4:

1 — клетки НЕК293, трансфицированные плазмидой рВиё^ох2-ОсЬ4;

2 — нетрансфицированные клетки НЕК293. Вестерн блот анализ

В ходе работы были выделены ММСК из зачатка третьего моляра человека («зуба мудрости») . Известно, что для эффективного препрограммирования клетки необходим высокий уровень экспрессии четырех факторов транскрипции: С-МУС, KLF4, Б0Х2 и 0СТ4. Ранее было показано, что ММСК-ЗТМ имеют значительный уровень экспрессии мРНК генов с-тус и Ш4 в сравнении с ЭСК человека [8] Для повышения плюрипотентного потенциала ММСК-ЗТМ была проведена их генетическая модификация полученной генетической конструкцией рВиС-Бох2-0^4 .

Результаты количественного анализа экспрессии мРНК генов Ь-асЫп, осЬ4, с-тус, Ш4, папод, sox2 в ММСК-ЗТМ до и после генетической модификации плазмидой рВиС-Бох2-0й4 представлены на рис . 3.

Рис. 3. Уровень экспрессии мРНК генов папод, осЬ4, с-тус, sox2, №4 в ММСК-ЗТМ, трансфицированных плазмидой pBud-Sox2-Oct4. Уровень экспрессии мРНК генов факторов транскрипции в ЭСК принят за 100%:

1 — нетрансфицированные ММСК-ЗТМ;

2 — ММСК-ЗТМ, трансфицированные плазмидой pBud-Sox2-Oct4. ПЦР-РВ

Анализ проводили методом ПЦР-РВ . ММСК-ЗТМ, трансфицированные плазмидой pBud-Sox2-0ct4, показали значительное увеличение уровня мРНК генов sox2 и oct4, что свидетельствует о функциональности полученной целевой генетической конструкции in vitro . Также показано, что генетическая модификация ММСК-ЗТМ плазмидой pBud-Sox2-0ct4 приводит к увеличению экспрессии мРНК гена nanog . Это согласуется с данными, полученными нами при генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови человека плазмидой pBud-Sox2-0ct4 . В результате трансфекции кДНК генов sox2 и oct4 наблюдалось увеличение уровня мРНК не только трансгенов, но и эндогенных мРНК генов klf4 и nanog [19].

Фактор транскрипции NAN0G является ранним регулятором плюрипотентности и трансрипционно регулируется непосредственно S0X2 и 0CT4 . Факторы транскрипции S0X2, 0CT4 и NAN0G совместно регулируют многие гены, такие как yesl, fgf4, utfl, fbx15, zic3 и zfp206 [20]. Этим можно объяснить, что эктопическая экспрессия факторов транскрипции S0X2 и 0CT4 в ММСК-ЗТМ привела к увеличению экспрессии эндогенного уровня NAN0G . Это может свидетельствовать о запуске перепрограммирования ММСК-ЗТМ

С целью исследования влияния генетической модификации на морфологию и жизнеспособность клеток, ММСК-ЗТМ были трансплантированы лабораторным крысам в составе Матригеля . Для идентификации ММСК-ЗТМ в имплантатах Матригеля клетки перед трансплантацией метили витальным флуоресцентным красителем PKH67 Флуоресцентный анализ гистологических срезов имплантатов через 72 ч после трансплантации показал наличие жизнеспособных ММСК-ЗТМ (рис . 4).

Рис. 4. Имплантаты из Матригеля® , содержащие клетки:

А — ММСК-ЗТМ, генетически модифицированные плазмидой pBud-Sox2-Oct4; Б — нетрансфицированные ММСК-ЗТМ. Флуоресцентная микроскопия, докраска ядер DAPI (синий). Окр.: РКН67 (зеленый). Ув. х200

Таким образом, генетическая модификация МСК-ЗТМ созданной рекомбинантной плазмидой рВис-Бох2-0й4 приводит к увеличению экспрессии мРНК трансгенов sox2 и о^4, а также мРНК гена папод. Данный факт может свидетельствовать о запуске процессов репрограммирования клеток, повышая их потенциал к дифференцировке в различных направлениях В связи с большим интересом к разработке генных и клеточных технологий для регенеративной медицины, подобные способы временной (транзи-торной) модуляции клеточного фенотипа могут лечь в основу новых методов лечения заболеваний человека

1

2

Благодарности

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №15-04-07527. Анализы выполнены в лаборатории лазерной конфокальной микроскопии Междисциплинарного центра аналитической микроскопии на приборе LSM 780 компании CARL ZEISS. Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и субсидии, выделенной Казанскому

федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. Работа частично выполнена на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета при финансовой поддержке государства в лице Миноб-рнауки России (Ю RFMEFI59414X0003) и Научно образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.

ЛИТЕРАТУРА:

I. Takahashi K ., Yamanaka S . Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors . Cell 2006;126(4): 663-76 .

2 . Maherali N ., Sridharan R ., Xie W . et al ., Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution . Cell Stem Cell 2007; 1(1): 55-70 .

3 . Okita K ., Ichisaka T ., Yamanaka S . Generation of germline-compe-tent induced pluripotent stem cells . Nature 2007; 448(7151): 313-7 .

4 . Wernig M . , Meissner A ., Foreman R . et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state . Nature 2007; 448(7151): 318-24 .

5 . Nichols J . , Zevnik B . , Anastassiadis K . et al . Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4 . Cell 1998; 95(3): 379-91.

6 . Niwa H ., Miyazaki J ., Smith A. G . Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells . Nat . Gen . 2000; 24(4): 372-6 .

7 . Yalvac M . E ., Ramazanoglu M ., Gumru O . Z. et al . Comparison and optimisation of transfection of human dental follicle cells, a novel source of stem cells, with different chemical methods and electro-poration . Neurochem . Res . 2009; 34(7): 1272-7 .

8 . Yalvac M . E . , Ramazanoglu M ., Rizvanov A .A . et al . Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo- and neurogenesis . Pharmacogenom . J . 2010 . 10(2): 105-13 .

9 . Kaukua N . , Shahidi M . K . , Konstantinidou C . et al . Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system . Nature 2014; 513(7519): 551-4 .

10 . Thesleff I ., Sharpe P . Signalling networks regulating dental development . Mech . Dev. 1997; 67(2): 111-23 .

II. Yalvac M . E ., Rizvanov A .A ., Kilic E . et al . Potential role of dental stem cells in the cellular therapy of cerebral ischemia . Curr . Pharm . Des . 2009; 15(33): 3908-16 .

12 . Соловьева В . В . , Блатт Н .Л ., Шафигуллина А. К . и др . Исследование эндогенной секреции сосудистого эндотелиального фактора роста мультипотентными мезенхимными стромальными клетками из зачатков третьих моляров человека . Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012; VIK3): 155-58 .

13 . Lagarkova M . A. , Volchkov P .Y ., Lyakisheva A .V . et al . Diverse epigenetic profile of novel human embryonic stem cell lines . Cell Cycle 2006; 5(4): 416-20 .

14 . Laemmli U . K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 . Nature 1970; 227(5259): 680-5

15 . Hughes, C . S . , Postovit L . M ., Lajoie G . A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture . Proteomics 2010; 10(9): 1886-90 .

16 . Rizzino A . Sox2 and Oct-3/4: a versatile pair of master regulators that orchestrate the self-renewal and pluripotency of embryonic stem cells . Wiley Interdiscip . Rev . Syst . Biol . Med . 2009; 1(2): 228-36 .

17 . Matin M . M . , Walsh J . R ., Gokhale P . J . et al . Specific knockdown of oct4 and beta2-microglobulin expression by RNA interference in human embryonic stem cells and embryonic carcinoma cells Stem Cells 2004; 22(5): 659-68

18 . Han S . M . , Han S . H . , Coh Y . R . et al . Enhanced proliferation and differentiation of oct4- and Sox2-overexpressing human adipose tissue mesenchymal stem cells . Exp . Mol . Med . 2014; 46: e101.

19 . Guseva, D ., Rizvanov A .A ., Salafutdinov I . I . et al . Overexpression of oct4 and sox2 transcription factors enhances differentiation of human umbilical cord blood cells in vivo Biochem Biophys . Res . Commun . 2014; 451(4): 503-9 .

20 . Rodda D . J ., Chew J . L ., Lim L . H . et al . Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2 . J . Biol . Chem . 2005; 280(26): 24731-7 .

Поступила: 11.12.2014