CC BY
22
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН 2-20рУ~1
Статистическая обработка метода количественного определения а-аминокислот в таблетках и растительном сырье
Образец f <x>, % s2 s Р, % Дх Е, %
Таблетки глицина 5 99,13 0,93575 0,9673 95 2,49 2,51
Шрот яблок 5 0,1703 3,06-10-6 1,75-10-3 95 0,0045 2,64
Какаовелла 5 0,1907 4,69-10-6 2Д6-10-3 95 0,0056 2,9
Нами разработаны оптимальные условия выделения и очистки суммы аминокислот из растительного сырья. Кроме того, оптимизированы условия проведения нингидриновой реакции для количественного анализа а-аминокислот в исследуемых объектах.
Исходное сырье (шрот яблок, какаовелла) экстрагируется горячей водой. К полученному извлечению добавляется трехкратный объем 96 %-го этанола для осаждения балластных высокомолекулярных соединений и затем отстаивается в течение 10-12 ч при температуре 3-4 °С. Образующийся осадок отделяется центрифугированием, после чего извлечение сгущают до полного удаления спирта, перенося в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводя водой до метки. К 1,5 мл полученного водного извлечения добавляется 1,7 мл 0,2 %-го водного раствора нингидрина и нагревается при температуре 120 °С в течение 20 мин. После полного охлаждения продукт реакции необходимо разбавлять водой (2:1) и спустя 1 ч после начала реакции определять оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 400 нм. Параллельно проводится реакция свежеприготовленного 0,02 %-го раствора пролина с 0,2 %-м водным раствором нингидрина, после охлаждения продукт реакции разбавляется водой (2:1) и определяется оптическая плотность в аналогичных условиях. Следует отметить, что водные извлечения шрота яблок и какаовеллы
с нингидрином образуют стабильные продукты (за период 1-1,5 ч после начала реакции интенсивность светопоглощения снижается на 0,4 и 1,4% соответственно).
Количественное содержание суммы аминокислот в образцах шрота яблок составило 0,17 %, какаовеллы - 0,19 % в пересчете на пролин.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, на основании изучения спектральных характеристик продуктов нингидрино-вой реакции и последующей оптимизации условий ее проведения разработан простой, доступный и точный метод количественного определения а-аминокислот в лекарственных препаратах и растительном сырье.
ЛИТЕРАТУРА
1. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот Ó. и др. Справочник биохимика. - М., 1991. - 544 с.
2. Симонян А. В., Саламатов А. А, ПокровскаяЮ. С. и др. // Бюлл. ВНЦ РАМН и АВО. - 2004. - № 2. -С. 27-29.
3. ФСП 42-0025265-02-99. Глицин таблетки суб-лингвальные 0,1 г. - 07.06.2002.
4. Шилова И. В., Краснов Е. А., Пяк А. М. // Хим.-фарм. журн. - 2002. - Т. 36, № 11. - С. 36-38.
5. Kuryt T., Sawnor-Corszynska D. // Acta chroma-togr. - 2000. - № 10. - Р. 97-103.
УДК:546.46:541.48:616-092.4
ОСОБЕННОСТИ ТРЕВОЖНОГО ПОВЕДЕНИЯ У КРЫС В УСЛОВИЯХ АЛИМЕНТАРНОГО ДЕФИЦИТА МАГНИЯ
И ИХ КОРРЕКЦИЯ
М. В. Харитонова, М. С. Кравченко, А. А. Желтова
НИИ фармакологии и кафедра фармакологии ВолГМУ
Существует мнение, что нарушение гомеоста-за магния в организме играет немаловажную роль в патогенезе многих психических заболеваний, симптомами которых являются депрессия и повышенная тревожность [5, 9, 10]. Более того, после терапии магнием наблюдается стабилизация настроения у пациентов с биполярными расстройствами [2].
Согласно литературным данным, различные соли магния обладают разной биодоступностью [4, 8], которая может повышаться при комбинации солей с пиридоксином. При исследовании скорости компенсации алиментарного дефицита магния неорганическими и органическими солями магния [7] было показано, что наиболее активными в этом отношении из органических со-
2-2007
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
лей является Mg L-аспарагинат, а из неорганических - Mg хлорид. Однако в литературе не описано влияние данных солей магния, в том числе и в комбинации с витамином В6, на поведение животных в сравнительном аспекте.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Сравнительное изучение влияние Mg L-аспа-рагината, Mg хлорида и их комбинаций с витамином В6 на поведение у крыс в условиях алиментарного дефицита магния.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты были выполнены на 79 белых беспородных крысах самцах с исходной массой 170-250 г. Животные были разделены на группы, первая из которых составляла группу контроля (n 8). Для моделирования патологических изменений у остальных крыс вызывали алиментарный дефицит магния с помощью магнийдефи-цитной диеты фирмы "ICN Biomedicals Inc." (Aurora, Ohio, США). Концентрацию магния в плазме крови и эритроцитах определяли спектрофо-тометрически по цветной реакции с титановым желтым [3]. После снижении концентрации магния ниже 1,4 ммоль/л в эритроцитах и ниже 0,7 ммоль/л в плазме исследуемые соли магния -Mg L-аспарагинат, Mg хлорид, их комбинации с витамином В6, а также препараты сравнения магне В6® (Mg лактат с витамином В6) и Mg сульфат -вводились перорально в дозе 50 мг элементарного магния на кг веса животного в течение 21 дня до полной компенсации уровня магния в плазме и эритроцитах. Витамин В6 добавлялся к субстанции Mg хлорида и Mg L-аспарагината в дозе 5 мг/кг.
Величину компенсации дефицита Mg (X) рассчитывали по формуле:
X =-
C — C
соли диеты
C -С
интактные дисгы
-х100%.
где Ссоли - концентрация Мд у животных после введения соли;
Сдиеты - концентрация Мд у животных, получавших Мд-дефицитную диету;
Сишактные - концентрация Мд у животных в ин-тактной группе.
Тревожность животных и транквилизирующее действие изучаемых солей магния оценивались с помощью метода приподнятого крестообразного лабиринта [11]. В течение двух минут наблюдения фиксировали следующие параметры: латентный период с момента высадки животного в центр лабиринта до захода в темный отсек, латентный период до первого выглядывания из темного отсека, время до выхода в светлый отсек, число посещений закрытых и открытых рукавов, время нахождения в них, количество фекальных болюсов. Увеличение количества выходов в открытые рукава и времени пребывания в них расценивалось как проявление транквилизирующего (антифобического) действия исследуемого соединения магния.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы '^а1Мюа 6.0" с использованием непараметрического метода сравнения независимых групп по критерию Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Через 50 дней магнийдефицитной диеты у животных отмечалось снижение массы тела, потускнение шерстяного покрова, снижение концентрации магния р<0,0001) в плазме крови [(0,567±0,029) мМ/л] и эритроцитах [(0,748± ±0,036) мМ/л] по сравнению с контролем -(1,20±0,030) и (1,83±0,026) мМ/л соответственно.
У магнийдефицитных крыс были обнаружены следующие поведенческие изменения. В "крестообразном лабиринте" (см. табл.) животные данной группы в 2 раза дольше оставались в центральной части установки (р 0,023); латентный период до выглядывания из темного отсека у них был в 3 раза дольше (р 0,063), а время до выхода в светлый отсек превышало в 2 раза аналогичный период (р 0,0005) у контрольной группы. Около 70 % животных, находящихся на магнийдефицитной диете, не выходили в светлые рукава. Время пребывания в светлых отсеках у диетных животных оказалось на 78,5 % меньше (р 0,003), чем у контрольных. Они в 4 раза чаще оставляли после себя болюсы (р 0,258).
После перорального введения изучаемых солей в течение 21 дня произошла компенсация дефицита магния в плазме крови и эритроцитах. По уровню магния в эритроцитах группы, получавшие соли магния, расположились в следующем порядке: Мд L-аспарагинат в комбинации с витамином В6 - (2,22±0,017) мМ/л > Мд хлорид в комбинации с витамином В6 - (2,19±0,023) мМ/л > > Магне В6® - (1,96±0,017) мМ/л > Мд L-аспа-рагинат - (1,92±0,034) мМ/л > Мд хлорид - (1,85± ±0,034) мМ/л > Мд сульфат - (1,69±0,013) мМ/л. При этом группы, получавшие Мд хлорид и Мд L-аспарагинат в комбинациях с витамином В6, статистически значимо отличались как от обоих препаратов сравнения, так и от Мд хлорида и Мд L-аспарагината. В свою очередь, Мд хлорид и Мд L-аспарагинат превосходили Мд сульфат (р<0,0001). Необходимо отметить, что, несмотря на статистически значимые межгрупповые различия, в группах животных, получавших препараты магния, все изменения были в пределах верхних границ физиологической нормы.
В тесте "крестообразный лабиринт" латентный период пребывания в центре у животных, получавших соли магния, сокращался. Этот показатель достоверно отличался от аналогичного периода для диеты на 59,8 % (р 0,003) и 57,9 % (р 0,003) для групп Мд L-аспарагината и Мд хлорида в комбинациях с пиридоксином, на 47,9% (р 0,029) для магне В6 и 55 % (р 0,025) для Мд сульфата. Латентный период до выглядывания из темного отсека после введения солей магния также восстанавливался. Лидерами по влиянию на данный параметр были Мд L-аспарагинат и
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
Мд хлорид в комбинациях с витамином В6 и маг-не В6. Увеличивалось число посещений темных и светлых отсеков. Удлинялось время пребывания в светлых рукавах лабиринта, особенно в группах солей, комбинированных с пиридоксином. Время нахождения в темных рукавах не изменялось.
В целом, результаты наших экспериментов согласуются с данными, полученными другими исследователями [15]. В данное время обсуждается вопрос о том, какие именно биохимические механизмы вовлечены в патогенез аффективных расстройств и на какие из них действует магний. Существуют различные точки зрения относительно механизма влияния дефицита магния на поведенческие реакции. Так, снижение уровня внеклеточного магния облегчает активацию NMDA-рецепторов, что ведет к повышению возбудимости нейронов в области гиппокампа и голубого пятна [6]. NMDA-опосредованная гиперактивность, как полагают Я. Shiekhattar и G. Aston-
2-20071
Jones (1992) [14], является одной из составляющих патогенеза депрессий и тревожности. Поэтому антагонисты NMDA-рецепторов или высокие дозы солей магния могут проявлять антиде-прессантную активность и анксиолитический эффект [13]. В наших экспериментах исследуемые соли магния проявили наибольшую активность в комбинации с пиридоксином. Гомеостаз магния и пиридоксина тесно взаимосвязаны. С одной стороны, пиридоксин обеспечивает транспорт магния в клетку и его депонирование, с другой -магний входит в состав щелочной фосфатазы, необходимой для поступления пиридоксальфос-фата в ткани [16]. Пиридоксин также является кофактором для реакций синтеза многих нейро-медиаторов (серотонина, норадреналина, дофамина, ГАМК) [3]. Этим можно объяснить тот факт, что в наших исследованиях соли, комбинированные с витамином В6, проявили максимальный эффект.
Влияние солей магния при иероральиом введении (50 мг элементарного магния на кг массы) на повеление магнийдефипитных крыс в тесте "крестообразный лабиринт", М±т
Группа Латентный период нахождения в центре, с Латентный период до выглядывания из темного отсека, с Время до выхода в светлый отсек, с Количество посешений темных отсеков Количество посе-шений светлых отсеков Время пребывания в светлом отсеке, с Время пребывания в темном отсеке, с Количество болюсов
Интактные 7,86± 1,76 (n=8) 30,57± 5,59 (n=8) 55,43± 4,14 (n=8) 1,57± 0,22 (n=8) 1,00± 0,00 (n=8) 9,71± 1,74 (n=8) 102,43± 2,53 (n=8) 0,71± 0,39 (n=8)
Диета 15,82± 2,24* (n=10) 79,18± 14,96* (n=10) 110,82± 4,64* (n=10) 1,00± 0,00* (n=10) 0,36± 0,16* (n=10) 2,09± 1,01** (n=10) 102,09± 2,53 (n=10) 2'64±1,03 (n=10)
Mg L-аспара-гинат в комбинации с витамином В6 6,36± 1 44** (n=11) 28,34± 1 32**'^' '(л=11) 27,27± 2 89*'**'+'^'# '(л=11) 2,46± 0,22*'**+'Т (n=11) 1,82± 0,28** (n=11) 18,55± 1 81*'**'+'т'# (n=11) 95,09± 2 32*'**'^ (n=11) 0,55± 0,33 (n=11)
Mg хлорид в комбинации с витамином В6 6,67± 1,34** (n=9) 31,89± 1 07**,^,# ' (n=9) 41,44± 2 17*'**'Т'§я,# ' (n=9) 1,78± 0,34** (n=9) 1,56± 0,26** (n=9) 9'44± 1 08**'§'+'# ' (n=9) 103'89± 1,72§ (n=9) 1,11± 0,48 (n=9)
Mg L-аспа-рагинат 11,44± 5,02 (n=9) 35,33± 1,28**,+,т (n=9) 27,22± 6 70*'**'+'Т,# ' (n=9) 2,22± 0,52*'** (n=9) 1,33± 0,25** (n=9) 14,67± 2,28**'#'Т (n=9) 93,89± 6,22т (n=9) 0,33± 0,18 (n=9)
Mg хлорид 9,73± 1,71 (n=11) 37,36± 1,10+-т (n=11) 46,27± 1,80**'Т (n=11) 1,55± 0,17** (n=11) 1,55± 0,16** (n=11) 9,27± 0 71**'+,f (n=11) 101,00± 1,64 (n=11) 0,46± 0,17 (n=11)
магне В6® 8,25± 3,19** (n=11) 31,08± 1,22**,f (n=11) 39,42± 3,65*'** (n=11) 1,83± 0,36** (n=11) 1,33± 0,20** (n=11) 14'00± 1 07**,i (П=11) 97,75± 3,07т (n=11) 0,33± 0,27 (n=11)
Магния сульфат 7,11± 2,66** (n=9) 40,78± 1,24 (n=9) 54,89± 3,20** (n=9) 1,11± 0,12 (n=9) 1,11± 0,12** (n=9) 7'00± 0,83** (n=9) 105,89± 3,03 (n=9) 0,89± 0,37 (n=9)
Kruskal-Wallis test H(7,N=79)= 12,98182 p=0,0726 H(7,N=79)=3 3,02198 p=0,0000 H(7,N=79)= 55,07888 p=0,0000 H(7,N=79) =24,67945 p=0,0009 H(7,N=79) =30,00712 p=0,0001 H(7,N=79) =49,09410 p=0,0000 H(7,N=79) = 12,72464 p=0,0791 H(7,N=79) =9,986785 p=0,1894
* - отличия достоверны от контроля; ** - отличия достоверны от группы животных с экспериментальной патологией; § - достоверно от группы животных, получавших Мд L-аспарагинат с витамином В6; 1 - достоверно от группы животных, получавших Мд L-аспарагинат; # - достоверно от группы животных, получавших Мд хлорид; " - достоверно от группы животных, получавших Магне В6® (Мд лактат с витамином В6); ^ - отличия достоверны от группы животных, получавших Мд сульфат.
I 2-2GG7 БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе исследований было подтверждено, что дефицит магния у крыс приводит к повышению уровня тревожности. Также было установлено, что при пероральном введении солей магния происходит компенсация дефицита магния. По эффективности коррекции дефицита соли можно расположить в следующем порядке: Mg L-аспа-рагинат в комбинации с витамином Вб > Mg хлорид в комбинации с витамином Вб > магне Вб® > > Mg L-аспарагинат > Mg хлорид > Mg сульфат. В тесте "крестообразный лабиринт" под действием солей магния уменьшалась продолжительность латентного периода до выглядывания из темного отсека, увеличивалось число посещений темных и светлых рукавов лабиринта. При этом лидерами по большинству показателей оказались Mg L-аспа-рагинат и Mg хлорид в комбинациях с витамином Вб которые по эффективности оказались со-
В®
б
и значительно превзошли Mg сульфат. ЛИТЕРАТУРА
1. Меньшиков В. В. Лабораторные методы исследования в клинике. - М.: Медицина, 1987.
2. Chouinard G., Beauclair L., Geiser R., et al. // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. - 1990. -Vol. 14. - P. 171-180.
3. Dakshinamurti K., Paulose C. S., Viswanathan M., et al. // Neurosci. Biobehav. Rev. - 1988. - Vol. 12. -P. 189-193.
4. Firoz M., Graber M. // Magnes. Res. - 2001. -Vol. 14, № 4. - P. 257-262.
5. Grimaldi B. L. // Med. Hypotheses. - 2002. -Vol. 58. - P. 47- 60.
6. Grunze H., Waiden J. // Magnes. Res. - 1997. -Vol. 10. - P. 119-126.
7. Iezhitsa I. N., SpasovA. A., Kravchenko M. S., et al. // J. Japan. Soc. Magnes. Res. - 2006. - Vol. 25, № 2. - P. 99 (153).
8. Kiss Z. // Magnes. Res. - 2006. - Vol. 19, № 1. -P. 72.
9. Murck H. // Nutr. Neurosci. - 2002. - Vol. 5. -P 375- 389.
10. Murck H. // Acta Neuropsychiatry. - 2003. -Vol. 15. - P. 227-241.
11. Peiiow S., Chopin P., File S, et al. // J. Neurosci. Res. Method. - 1985. - Vol. 14, № 3. - P. 149-167.
12. Planeiis E., Lerma A., Sanchez-Morito N., et al. // J. Am. Coll. Nutr. - 1997. - Vol. 16, № 4. - P. 352-356.
13. PoieszakE., SzewczykB., Kedzierska E., et al. // Pharmacol. Biochem. Behav. - 2004. - Vol. 78 - P. 7-12.
14. Shiekhattar R., Aston-Jones G. // Synapse. -1992. - Vol. 10. - P. 103-109.
15. SingewaldN., Sinner C., Hetzenauer A., et al. // Neuropharm. - 2004. - Vol. 47. - P. 1189-1197.
