CC BY
22
ФАРМАКОЛОГИЯ. ТОКСИКОЛОГИЯ -^-
УДК 616.151.5-092.9:546.46:615.356
ВЛИЯНИЕ МАГНИЯ L-ACПAPAГИHATA И ЕГО KOМБИHAЦИИ С ВИTAМИHOМ В6 HA ПРОЦЕССЫ AГPЕГAЦИИ ТРОМБОЦИТОВ ЖИВОТНЫХ В УСЛОВИЯХ МAГHИЙДЕФИЦИTHOЙ ДИЕТЫ
И. ^ Иежица, М. С. Кравченко, A. A. Спасов, М. В. Харитонова, A. Ю. Стуковина, Л. В. Hаyменко
Кафедра фармакологии и НИИ фармакологии ВолГМУ
Впервые о возможном угнетающем действии магния (Mg) на свертывающую систему крови сообщил Shionoya в 1927 г. [9]. С тех пор было проведено множество исследований с целью объяснения механизма влияния магния на процессы свертывания крови, агрегацию тромбоцитов и фиб-ринолиз. Так, в условиях гипомагнезиемии у животных отмечены увеличение АДФ-индуцирован-ной и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов, снижение уровня антитромбина-3, протеина S, тромбоксана В2, протеина С и эндотелина-1 [8, 10, 11].
Несмотря на возрастающий интерес к роли магния в патогенезе гемобиологических нарушений, к настоящему времени в сравнительном аспекте влияние различных магниевых солей на процессы агрегации тромбоцитов в условиях дефицита магния не изучалось.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Оценить влияние Mg L-аспарагината и комбинации Mg L-аспарагината с витамином В6 на процессы агрегации тромбоцитов животных при пероральном введении в условиях алиментарного дефицита магния.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты были выполнены на 91 белой беспородной крысе-самце с исходной массой 170-250 г. Первая "интактная" группа животных составляла контроль. Для моделирования гемо-биологических изменений у остальных крыс вызывали алиментарный дефицит магния с помощью специальной магнийдефицитной диеты фирмы "ICN Biomedicals Inc." (Aurora, Ohio, США). Состав диеты полностью соответствовал рекомендациям Специализированного Комитета по Стандар-
там США в исследованиях питания [6]. Весь рацион готовился на деионизированной воде, эту же воду в ходе эксперимента использовали в качестве питьевой воды для животных, находящихся на диете. Интактные животные получали воду (содержание магния 20 мг/л) и полноценную диету, содержащую 0,5 г элементарного магния на кг диеты.
Скорость и глубину развития гипомагнезие-мии контролировали, определяя содержание магния в плазме и эритроцитах животных спектро-фотометрическим методом по цветной реакции с титановым желтым [5]. При снижении концентрации магния ниже 1,4 ммоль/л в эритроцитах и ниже 0,7 ммоль/л в плазме считалось, что у животных развилась гипомагнезиемия средней тяжести. После чего исследуемые соли магния - Мд Ь-аспа-рагинат и Мд L-аспарагинат в комбинации с витамином В6 и препарат сравнения "Магне В6®" (Мд лактат с витамином В6) - вводились перо-рально (в дозе 50 мг элементарного магния на кг веса животного) в течение 20 дней до полной компенсации уровня магния в плазме и эритроцитах. Витамин В6 добавлялся к субстанции Мд Ь-аспарагината в дозе 5 мг/кг веса животного, таким образом, соотношение пиридоксина и элементарного магния составляло 1:10. Забор крови для определения концентрации магния в плазме и эритроцитах проводили сразу после установления выраженного дефицита магния, а затем на 1, 3, 6, 9, 13 и 20-й день введения солей магния.
После 20-дневного курса введения солей магния у животных под эфирным наркозом производился забор крови из брюшной аорты. Кровь стабилизировали 3,8%-м раствором цитрата натрия в соотношении 1:9. Агрегацию тромбоцитов исследовали на богатой тромбоцитами плазме [4] с помощью двухканального лазерного анализатора
2-2007
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
агрегации тромбоцитов (модель 220 LA) научно-произодственной фирмы "Биола" (Россия) по методу G. Born (1962) в модификации 3. А. Габба-сова и соавт. (1989) [7]. Подсчет количества тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме проводился в камере Горяева при помощи микроскопа "Биолам ЛОМО" (г. Санкт-Петербург) (окуляр х7; объектив х40) в 10 больших квадратах [1].
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы "Statistica 6.0" с использованием непараметрического метода сравнения независимых групп по Краскел-Уоллис и Манн-Уитни [2].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В проведенных исследованиях было показано, что к 8-й неделе магнийдефицитной диеты у животных отмечалось статистически значимое уменьшение уровня магния в эритроцитах в среднем на 56 % и в плазме в среднем на 47 % (р< 0,05), потускнение шерстного покрова и понижение веса в среднем на 30,18 % (р<0,05).
В условиях алиментарного дефицита магния у животных наблюдалось повышение тромбоген-ного потенциала крови. При добавлении индуктора АДФ в концентрации 0,5 мкмоль индекс агрегации статистически значимо увеличивался на 55,45 %, что свидетельствует о повышенной стимуляции обратимой первичной волны агрегации тромбоцитов. Процессы полной активации тромбоцитов, выделения гранулярного содержимого и тем самым включения отсроченной вторичной волны агрегации тромбоцитов исследовали при добавлении АДФ-индуктора в концентрации 5,0 мкмоль. При этом наблюдалось достоверное увеличение степени агрегации на 66,19 %. В кол-лаген-индуцированной агрегации в группе маг-нийдефицитных животных степень агрегации повысилась на 63,21 % (р<0,05), что указывает на
увеличение сосудистого механизма агрегации тромбоцитов. Количество тромбоцитов крови магнийдефицитных крыс по отношению к интакт-ной группе достоверно не изменялось (см. табл.).
При пероральном введении исследуемых солей магнийдефицитным животным наблюдалось восстановление уровня магния в плазме и эритроцитах. Рассчитанные методом регрессионного анализа сроки полной компенсации алиментарного дефицита магния в эритроцитах для группы животных, получавших Мд L-аспарагинат в комбинации с витамином В6, соответствовали 5 суткам, Мд L-аспарагинат и магне В6® - 11 суткам.
К 20-му дню введения солей магния наблюдалось снижение тромбогенного потенциала крови животных. При этом в наибольшей степени отмечено ингибирование процессов коллаген-индуци-рованной агрегации тромбоцитов, что можно объяснить выраженным влиянием магния на фиб-риногенез. Так, в группе животных, получавших Мд L-аспарагинат в комбинации с витамином В6, степень агрегации максимально снизилась на 72,39 % (р<0,05), в группах Мд L-аспарагината и магне В6® - на 19,60 и 13,87 % соответственно по сравнению с магнийдефицитными животными. При этом по данному показателю Мд L-аспара-гинат с витамином В6 статистически значимо превосходил другие исследуемые соли магния.
В группе животных, получавших комбинацию Мд L-аспарагината с витамином В6, отмечалось ингибирование процесса агрегации (АДФ в концентрации 5 мкмоль) на 30,50 % (^0,05), в группах Мд L-аспарагината и магне В6® - на 12,59 и 18,25 % соответственно, что свидетельствует об уменьшении тромбогенного потенциала у животных в данных группах. При добавлении АДФ-индуктора в концентрации 0,5 мкмоль наблюдалось уменьшение внутренней секреторной активности тромбоцитов в группах, получавших соли магния.
Влияние органических солей магния при пероральном введении (50 мг/кг элементарного Мд) на агрегапию тромбоцитов магнийдефицитных животных, индуцированную коллагеном и АДФ, М±т
Группа АДФ (5 мкмоль) АДФ (0,5 мкмоль) Коллаген Тромбоциты
Степень агрегации, max д% Индекс агрегации д% Степень агрегации, max д% Тыс. в 1 мкл д%
Интактные 34,67±2,45 (n 22) - 1,93±0,35 (n 24) - 2,37±0,22 (n 26) - 1074,78±2,89 (n 23) -
Диета 53,90±7,35* (n 5) 55,45 3,20±1,01* (n 10) 66,19 3,87±0,76* (n 6) 63,21 1159,84±73,20 (n 8) 7,91
Mg L-аспара-гинат в комбинации с витамином В6 37,46±4,55** (n 7) 8,04 2,02±0,29** (n 6) 4,52 1,07±0,37*'**'§"1 ' (n 7) 54,93 1060,08±72,70 (n 6) 1,37
Mg L- аспарагинат 47,12±4,36* (n 6) 35,89 1,63±0,61** (n 8) -15,39 3,11±0,61 (n 7) 31,22 1177,16±56,04 (n 8) 9,53
Магне В6® 44,06±11,51 (n 5) 27,09 2,32±1,22 (n 6) 20,42 3,33±0,81 (n 6) 40,58 1062,50±28,82 (n 6) 1,14
Kruskal-Wallis test H(4,N=45) = 7,562591 p 0,1090 H(4,N=54)=5,768095 p 0,2172 H(4,N=52) = 15,24153 p 0,0042 H(4,N=51) = 4,576338 p 0,3336
- отличия достоверны от интактной группы; диету; § - достоверно от группы животных, получав тат с витамином В6).
отличия достоверны от группы животных, получавших магнийдефицитную
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
Так, в группе Мд Ь-аспарагината индекс агрегации снизился на 65,30% (^0,05), а в группах Мд Ь-аспарагината с витамином В6 и магне В6® -на 37,11% (^0,05) и 27,54% соответственно относительно группы магнийдефицитных животных. Статистически значимых различий по данным показателям между исследуемыми солями магния обнаружено не было.
Полученные данные соответствуют ранее проведенным исследованиям. Так, по имеющимся литературным данным [8, 10, 11], дефицит магния приводит к увеличению процессов АДФ- и кол-лаген-индуцированной агрегации тромбоцитов, а при введении солей магния магнийдефицитным животным отмечается восстановление данных показателей. На уровне пре-мРНК магний регулирует образование фибронектина (адгезивный экс-трацеллюлярный белок), который усиливает адгезию и требуется для активации тромбоцитов, нейтрофилов и эндотелиоцитов. При этом магний напрямую не влияет на связывание фибро-нектина с эндотелиоцитами, а действует как антагонист, препятствуя кальций-индуцированному связыванию [12]. Таким образом, магний опосредованно препятствует образованию агрегатов тромбоцитов, которые могут, с одной стороны, способствовать внутрисосудистому свертыванию с высвобождением большого количества тромбо-цитарных факторов свертывания и биологически активных веществ, а с другой стороны, закупоривая мелкие сосуды, вызывать стаз в системе микроциркуляции [3].
2-20071
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, на основании проведенного исследования можно сделать вывод о том, что Мд Ь-аспарагинат и его комбинация с пиридок-сином восстанавливают процессы агрегации тромбоцитов. При этом исследуемые соли по активности оказались сопоставимыми с препаратом ®
сравнения магне В6 , нормализуя нарушения у животных с дефицитом магния.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баркаган 3. С., Балуда Б. П. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. - Томск, 1980. - 71 с.
2. Гланц С. Медико-биологическая статистика: пер. с англ. - М.: Практика, 1998. - 459 с.
3. Иконникова Е. И., Черноусова Л. А., Мошки-на И. Р. // Клинич. лаб. диагностика. - 1999. - № 6. -С. 20-21.
4. Люсов Б. А., Савенков М. П. // Кардиология. -1998. - № 5. - С. 5-8.
5. Меньшиков Б. Б. Лабораторные методы исследования в клинике. - М.: Медицина, 1987.
6. Bieri J. G. // J. Nutr. - 1980. - Vol. 110. - Р. 1726.
7. Born G. V. // Nature (Lond). - № 194. - P. 927929.
8. Kh R., Khullar M, Kashyap M, et al. // J. Hyper-tens. - 2000. - Vol. 18, № 7. -Р. 919-926.
9. Sacha T, Skotnicki A. B. // Przegl. Lek. - 1997. -Vol. 54, № 2. - P. 122-125.
10. Scheibe F., Haupt H., Vlastos G. A. // Eur. Arch. Otorhinolaryngol. - 2000. - Vol. 257, № 7. -Р. 355-361.
11. Seelig M. S. // J. Am. college Nutrition. - 1993. -Vol. 12. - P. 442-458.
12. Serebruany V. L., Herzog W. R., Edenbaum L. R., et al. // Magnes Res. - 1996. - Vol. 9, № 3. - P. 155-163.
УДК 547.551.42
ПРЕПАРАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ГИДРОХЛОРИДА №(2,6-ДИМЕТИЛФЕНИЛ)-2-(ЭТИЛАМИНО)АЦЕТАМИДА (MEGX)
А. А. Озеров, Н. В. Рогова, Л. А. Смирнова, К. А. Кузнецов, Е. Г. Глухова, А. И. Луганченко, С. С. Лемишко
Лаборатория медицинской химии ВНЦ РАМН и ABO, кафедра фармацевтической и токсикологической химии ВолГМУ
И-(2,6-Диметилфенил)-2-(этиламино)ацетамид (моноэтилглицин-ксилид - MEGX) является одним из наиболее широко применяющихся маркеров активности изофермента цитохорма Р450 -CYP3A4, ответственного за метаболизм около 60 % современных лекарственных средств [3]. MEGX-тест характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и значительной прогностической ценностью при диагностике хронической патологии печени [4] и оценке лекарственного взаимодействия за счет индукции или ингибиро-вания CYP3A4 [2]. Однако в отличие от готовых тест-систем, основанных на использовании MEGX, сама субстанция MEGX не поставляется ведущими производителями химических реактивов и реа-
гентов для биохимических анализов, что побудило нас к разработке простого и технологичного метода получения MEGX для нужд собственных клинических исследований.
Синтез гидрохлорида MEGX был осуществлен нами по адаптированной схеме, предложенной для получения ксикаина (лидокаина) [1]. На первой стадии синтеза 2,6-диметиланилин подвергали ацилированию хлорангидридом хлоруксусной кислоты в среде безводной уксусной кислоты. Полученный 2-хлор-Н-(2,6-диметилфенил)ацетамид аминировали избытком моноэтиламина в среде 95 %-го этанола при температуре 100 °С и после выделения MEGX-основания превращали его в конечный гидрохлорид обработкой метанольным
