CC BY
55
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019
Черанев В.В., Логинова М.А., Кутявина С.С., Смирнова Д.Н., Зорина Н.А., Минаева Н.В., Парамонов И.В.
ОПЫТ ВНЕДРЕНИЯ МЕТОДА ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ МОНИТОРИНГА
КОЛИЧЕСТВЕННОГО ХИМЕРИЗМА ПОСЛЕ АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КОСТНОГО МОЗГА
ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России», 610027, Киров, Россия
В ходе анализа данных литературы была сформирована панель олигонуклеотидов, включающая в себя праймеры и зонды к двадцати шести генетическим маркерам и к одному референсному гену. В результате оценки эффективности ПЦР в реальном времени на примере одного из маркеров (S0la) установлено оптимальное количество ДНК на реакцию (70 нг), обеспечивающее разрешающую способность методики не менее 0,1% с возможностью оценки линейного химеризма. Сформированная панель праймеров к генетическим полиморфизмам - InDel имеет высокую степень информативности для пар донор-реципиент Российской Федерации. За период с января 2018 по июнь 2019 года была проведена количественная оценка уровня линейного (CD3+, CD34+) и общего химеризма у 28 пациентов клиники института, получивших аллогенную трансплантацию ГСК. Результаты количественной оценки химеризма показаны на примере четырех пациентов.
Ключевые слова: мониторинг химеризма; ПЦР в реальном времени; генетические полиморфизмы InDel. Для цитирования: Черанев В.В., ЛогиноваМ.А., Кутявина С.С., СмирноваД.Н., ЗоринаН.А., МинаеваН.В., Парамонов И.В. Опыт внедрения метода InDel ПЦР в реальном времени для мониторинга количественного химеризма после аллогенной трансплантации костного мозга. Клиническая лабораторная диагностика. 2019; 64 (12): 762-768. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-12-762-768
Cheranev V.V., LoginovaM.A., KutyavinaS.S., SmirnovaD.N., ZorinaN.A., MinaevaN.V., ParamonovI.V. EXPERIENCE INTRODUCTION OF QUANTITATIVE ANALYSIS OF CHIMERISM AFTER ALLOGENIC STEM CELL TRANSPLANTATION BY REAL-TIME PCR WITH INDEL POLYMORPHISMS
FSBIS Kirov scientific-research institute of hematology and blood transfusion of FMBA of Russia, Kirov, 610027, Russian Federation
Using data obtained from domestic and foreign sources, we formed a set of primers and fluorogenic probes for analyzing twenty-six specific .sequence polymorphisms and one reference gene. In the course of evaluating the effectiveness of real-time PCR, using the example of one of the markers (S01a), we obtained the optimal amount of DNA per reaction (70 ng), providing a resolution of at least 0.1%% of the method with the ability to estimate linear chimerism. Formed panel ofprimers for genetic polymorphisms - InDel has a high degree of informational content for donor-recipient pairs of Russia. From January 2018 to June 2019, a quantitative assessment of the level of linear (CD3 +, CD34 +) and general chimerism was carried out for 28 patients of the clinic of the Institution. Finally, we analyzed patients who received allografts and present 4 different clinical situations that illustrate the informativity level of this method.
Keywords: quantitative assessment of chimerism; real-time PCR; InDel polymorphisms.
For dtation: Cheranev V.V., Loginova M.A., Kutyavina S.S., Smirnova D.N., Zorina N.A., Minaeva N.V., Paramonov I.V. Expiri-ence introduction of quantitative analysis of chimerism after allogenic stem cell transplantation by real-time PCR with InDel polymorphism. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika. (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2019; 64(12 ): 762-768. (inRuss.) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-12-762-768
For correspondence: Loginova M.A., PhD, head of Research Laboratory of applied immunogenetics; e-mail: mlogin2010@ gmail.com
Information about authors:
Cheranev V.V., http://orcid.org/0000-0001-5294-3033 Loginova M.A., http://orcid.org/0000-0001-7088-3986 Kutyavina S.S., http://orcid.org/0000-0002-2371-4044 Smirnova D.N., https://orcid.org/0000-0002-0090-1891 Zorina N.A., https://orcid.org/0000-0003-1948-209X Minaeva N.V., https://orcid.org/0000-0002-8479-3217 Paramonov I.V., http://orcid.org/0000-0002-7205-912X
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgment. The study was supported by a grant «UMNIK» (contract №14113ГУ/2019).
Received 14.08.2019 Accepted 16.09.2019
Для корреспонденции: Логинова Мария Александровна, канд. биол. наук, зав. лаб. прикладной иммуногенетики; e-mail: mlogin2010@ gmail.com
Введение. Количественная оценка уровня химе-ризма после аллогенной трансплантации гемопоэ-тических стволовых клеток (ТГСК) является обязательным прогностическим инструментом, необходимым для оценки эффективности трансплантации, своевременной диагностики посттрансплантационных осложнений и коррекции терапии [1, 6, 9, 10]. В настоящее время для мониторинга химеризма применяют как гематологические (скрининг антигенов эритроцитов АВ0, резус и др.), так и генетические подходы (RFLP, XY FISH, STR-ПЦР и VNTR-ПЦР с последующим электрофорезом, количественная ПЦР с праймерами к InDel и SNP маркерам). Указанные методы мониторинга химеризма характеризуются различной технической сложностью выполнения анализа, чувствительностью и воспроизводимостью [8].
Наибольшую распространенность в настоящее время получили мультиплексная ПЦР с праймерами к STR (Short Tandem Repeat) маркерам и количественная ПЦР с праймерами к InDel (Insertion/Deletion polymorphism) или SNP (Single Nucleotide Polymorphism) маркерам [2-7]. Первый метод востребован по причине наличия стандартизированной панели праймеров [7], относительно высокой чувствительности (до 1%), простоты и скорости исполнения, кроме этого, он не требует большого количества ДНК (примерно 10 нг на реакцию) [8, 10]. Второй метод характеризуется всеми преимуществами первого, но при этом имеет большую чувствительность (до 0,01%), что в сумме с детекцией химеризма в отдельных клеточных линиях позволяет более точно оценить течение посттрансплантационного периода [8, 10].
Метод определения биаллельного InDel полиморфизма основан на детекции локусов генома человека, которые имеют два взаимоисключающих аллеля. Один аллель несёт инсерцию (In) и содержит дополнительный фрагмент ДНК, встроенный в геном. Второй - имеет делецию (Del) и не содержит дополнительной последовательности. Длина дополнительного фрагмента, содержащегося в локусах, может варьировать от 1 до 10000 пар оснований [13], но в качестве мишени для проведения количественной ПЦР, как правило, используются микро InDel (от 1 до 50 пар оснований) [15]. Частота распределения и, как следствие, информативность InDel маркеров различна в каждой популяции [2, 5, 11, 12], при этом различия столь существенны, что на основе данных маркеров проводятся филогенетические исследования [14].
Широкое распространение в практике получила панель праймеров и зондов, разработанная в 2002 г. M. Alizadeh и соавт. [2], в дальнейшем она была дополнена М. Koldehoff и соавт. [3]. На данный момент во многих работах проведена оценка информативности, указанной выше InDel панели, для различных популяций [2, 5, 11, 12], однако для российской популяции данные до сих пор отсутствуют.
Цель исследования — апробировать и внедрить в клиническую практику методику мониторинга посттрансплантационного химеризма методом InDel ПЦР в реальном времени.
Материал и методы. Биологический материал (периферическая кровь и костный мозг) для иссле-
clinical molecular studies
дования был получен от 31 пары реципиент/донор клиники ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России. 28 пациентам была проведена аллогенная ТГСК (для трех пациентов она не состоялась по разным причинам).
Сортировку клеточных линий (CD34+; CD3+) проводили с использованием магнитных частиц, конъю-гированных с антителами к соответствующим маркерам (Thermo Fisher Scientific, США). Препараты ДНК для оценки уровня химеризма были получены методом колоночной фильтрации с помощью наборов QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAgen, Германия), концентрацию и показатель чистоты ДНК, которых оценивали на спектрофотометре (Infinite 200 PRO, TECAN).
Панель праймеров и зондов для проведения In-Del ПЦР в реальном времени была сформирована на основании данных литературы [2-4]. Один праймер из пары был специфичен для аллеля, другой, как и зонд, отжигается на консервативном участке ДНК.
Классическую ПЦР для поиска информативных маркеров проводили в термоциклере Verity (Thermo Fisher Scientific, США), согласно температурному профилю программы амплификации (1 цикл - 5 мин при 950C, 35 циклов - 15 с при 950C, затем 45 с при 600C). Каждая реакция содержала 1 мкл геномной ДНК, 5 мкл 2,5Х-реакционной смеси (нуклеотиды, буфер, ROX, Mg2+, HS-полимераза), 300 нМ каждого праймера. Детекцию результатов осуществляли с использованием метода электрофореза в 2% агарозном геле.
При проведении количественной ПЦР в режиме реального времени в качестве флуоресцентной метки зонда использовали 5'-FAM, в качестве гасителя флуоресценции зонда - 3-RTQ. Каждая реакция содержала 70 нг геномной ДНК, 10 мкл 2,5Х-реакционной смеси (нуклеотиды, буфер, ROX, Mg2+, HS-полимераза), 300 нМ каждого праймера для амплификации и 200 нМ специфичного зонда. Амплификацию и детекцию сигнала проводили на приборе ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия), согласно температурному профилю: 1 цикл - 5 мин при 950C, 40 циклов - 15 с при 950C, затем 45 с при 600C.
Эффективность ПЦР оценивали при помощи метода, описанного в работе М. Alizadeh и соавт. [2]. Для этого готовили 14 последовательных разведений (от 1:0 до 1:8000) ДНК пациента в ДНК донора, которые были использованы в качестве матрицы для 15 реакций (последняя выступала в качестве негативного контроля и содержала только ДНК донора). Для получения точного значения эффективности ПЦР по результатам реакции строилась прямая зависимости порогового цикла (Ct) от логарифма относительного количества ДНК пациента в реакции (рис. 1). Для подсчета эффективности использовали формулу:
E=10-1/s - 1,
где s - коэффициент угла наклона прямой.
Наличие информативного маркера подтверждали проведением ПЦР в реальном времени: маркер считали информативным, если его Ct был в пределах от 21 до 25. В случаях, когда Ct маркера было равно или выше 32, сигнал считали неспецифическим. В дальнейшем проводили ПЦР в реальном времени и оценку Ct для ин-
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Десятичный логафирм общего количества ДНК в реакции
Рис. 1. Оценка эффективности ПЦР, проведённая для референсного гена GAPDH.
Пациент А
Количество дней после аллоТГСК
—•— С034(+)-линейный химеризм —•— Общий химеризм Рис. 2. Мониторинг уровня химеризма для пациента А. после алло ТГСК.
формативного маркера и референсного гена (GAPDH) в трех повторах до трансплантации и после. Данные по С до аллоТГСК выполняли функцию калибровочного образца при расчетах. Нормализованное значение порогового цикла рассчитывали, как ДЦ = С (маркера) - С (референсного гена). Если исследуемый маркер проявлялся у пациента, и не проявлялся у донора, то такой маркер считали информативным для пациента и наоборот. При нахождении более чем 1 информативного маркера анализ проводился по всем найденным маркерам, но не более 3 маркеров для пары пациент/донор.
Анализ результатов проводили по формуле [2]: QU/QC = 100*(1+Е)- (ДСи - ДСС), где QU - количество ДНК в образце после аллоТГСК; QC - количество ДНК в образце до аллоТГСК; ДЦи - нормализованное значение С в образце после аллоТГСК; ДЦС нормализованное значение
С для калибровочного образца; Е - эффективность ПЦР информативного маркера.
Информативность каждого маркера рассчитывали, как отношение количества случаев, когда маркер был информативным, к общему количеству проанализированных пациентов и доноров.
Результаты. При проведении анализа литературных данных [2, 5, 11, 12] установлено, что для всех изученных популяций была показана низкая информативность маркера S05a. Для маркера АСЕ1428 - высокий уровень неспецифической амплификации [5]. По этим причинам от данных маркеров отказались на этапе формирования панели реагентов. Оценка работоспособности праймеров и ПЦР-микса была проведена при помощи рутинной ПЦР, оценка работоспособности зондов - при помощи ПЦР в реальном времени. В результате оценки работоспособности
зондов, праймеров и ПЦР-микса из финальной панели реактивов исключили маркер S06 из-за низкого уровня сигнала, который не позволял провести количественную оценку.
Все пары реципиент/донор были исследованы по 25 потенциально информативным локусам. Количество найденных информативных маркеров в неродственных парах реципиент/донор составляло от 4 до 13 (медиана - 8,5), в родственных - от 2 до 10 (медиана 5). Следует отметить, что информативных маркеров не было найдено лишь для одного донора.
Теоретически достижимая чувствительность данной методики составляет 0,01% выявляемых клеток [2,5]. Она напрямую зависит от количества ДНК, вносимой в реакцию. Как было ранее показано, максимальная чувствительность достигается при внесении в реакцию 250 нг [2] и 120 нг [5]. Следует отметить, что при внесении в реакцию 15 нг ДНК мониторинг химеризма также возможен, но чувствительность метода снижается до значения около 1% (в зависимости от информативного маркера) [11]. Эта проблема становится особенно актуальной при решении задач мониторинга химеризма в отдельных клеточных линиях, когда невозможно получить исследуемую пробу с высокой концентрацией ДНК (нг) [11]. При проведении оценки эффективности ПЦР при количестве исследуемой ДНК пациента 0,03 нг и ниже (0,042% от 70 нг собственной ДНК) пороговый цикл (С4) варьирует между дублями сильнее допустимого значения (0,5 цикла) [5]. Таким образом, если у пациента уровень собственных клеток опускается ниже 0,1%, то данная методика не позволяет провести количественную оценку уровня химеризма с достаточной точностью. На основании этого был сделан вывод, что чувствительность методики составляет не менее 0,1%.
Адаптированная нами методика определения количественного химеризма с использованием InDel ПЦР была внедрена в практику ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России. За период с января 2018 по июнь 2019 г. проведена количественная оценка уровня линейного (CD3+, CD34+) и общего химеризма для 28 пациентов клиники Учреждения, получивших аллогенную трансплантацию ГСК. Ниже представлены примеры использования метода в различных клинических ситуациях.
Случай 1. Пациент А., мужчина (41 год). Диагноз: опухоль из бластоидных плазмоцитоидных дендритных клеток. Проведена аллогенная ТГСК от полностью совместимого (10/10) неродственного донора. Мониторинг химеризма проводился на протяжении 265 дней. На рис. 2 изображены данные, полученные при мониторинге химеризма. На +34 сут после трансплантации выявлен высокий уровень собственных клеток как при оценке общего, так и линейного химе-ризма. На +125 сут наблюдалось дальнейшее повышение содержания собственных клеток в CD34+ - линии до 18,5%. После корректировки терапии на +229 сут уровень общего химеризма достиг предела чувствительности метода (менее 0,1%). Линейный химеризм (СD34+) после снижения на +265 сут установился на уровне 162 и 195 дней.
Случай 2. Пациент В., мужчина (21 год). Диагноз: острый миелоидный лейкоз М1-вариант. Проведена
clinical molecular studies
Информативность InDel маркеров для различных популяций
Информативность маркера в популяции, %
Маркер Ренн, Франция Эрланген, Германия Тайпей, Тайвань Минск, Беларусь Киров, Россия
S 01a 23,6 22,6 33,0 47,2 9,7
S 01b н/д 14,2 13,0 н/д 14,5
S 02 36,4 24,9 5,0 47,2 17,7
S 03 16,4 19,4 27,0 35,1 22,6
S 04a 23,6 20,0 28,0 51,4 12,9
S 04b 12,7 20,0 18,0 11,1 14,5
S 05a 1,8 0,0 0,0 н/д н/д
S 05b 27,3 24,4 44,0 35,0 16,1
S 06 31,0 25,0 44,0 27,0 н/д
S 07a 31,0 21,1 21,0 47,0 22,6
S 07b 21,8 24,8 36,0 40,5 14,5
S 08a 16,4 18,1 9,0 38,9 12,9
S 08b 20,2 18,4 45,0 32,4 12,9
S 09a 7,3 5,0 2,0 н/д 6,5
S 09b 14,5 23,7 34,0 30,6 21,0
S 10a 25,5 21,6 7,0 н/д 16,1
S 10b 20,2 21,1 29,0 25,0 9,7
S 11a 25,5 24,9 36,0 47,2 12,9
S 11b 7,3 15,0 9,0 25,0 6,5
ACE 1721 н/д н/д н/д 30,6 8,1
GST 194 н/д н/д н/д 22,2 14,5
MID402 н/д н/д н/д н/д 9,7
MID668a н/д н/д н/д н/д 19,4
MID668b н/д н/д н/д н/д 8,1
MID836a н/д н/д н/д н/д 19,4
MID836b н/д н/д н/д н/д 11,3
MID847 н/д н/д н/д н/д 11,3
Медиана 21,0 21,1 27,5 35,0 12,9
первая аллогенная ТГСК от полностью совместимого (10/10) неродственного донора. При анализе химериз-ма на +27 сут выявили более 80% собственных клеток и крайне низкую концентрацию ДНК (С=3 нг/мкл), выделенную из общей популяции клеток костного мозга, что было обусловлено первичным неприживлением трансплантата. Далее была проведена вторая алло-генная ТГСК от гаплоидентичного (5/10) родственного донора. На +32 сут после аллоТГСК наблюдаемый уровень собственных клеток составлял менее 0,8% в общей популяции и 3,2% в CD34+-линии. Далее наблюдалось медленное снижение уровня содержания собственных клеток при мониторинге линейного и общего химеризма (рис. 3). На +159 день мониторинга содержание собственных клеток достигло отметки ниже чувствительности метода (менее 0,1%) при оценке общего и 0,175% при оценке линейного (CD34+) химеризма. На +187 день наблюдалось нарастание уровня собственных клеток в общей популяции и CD34+ - линии. Корректировка терапии способствовала восстановлению донорского химеризма на +209 сут.
Случай 3. Пациент С., мужчина (27 лет). Диагноз: острый лимфобластный лейкоз про-Т-вариант. Про-
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
10,0% т
Пациент В
1,0% •■
0,1%
Д32;3,2%Д61-3 1% д ' ' Д96; 2,6% •_______ Д187; 1,3? Д209'0 7%
:: Д32; 0,8% Д --1—1—1—1— ' Д96; 1,1% 51; 0,7% Д130;С —1-1-1-1— Д159;0,25б / \ \Д130; 0,1%/ / ),1% \ -Д159;0Д°/ —I—1 \ 4 1—1—1— Ц187; 0,7% Д209;0,1% — 1 1-1-1
100 150
Количество дней после аллоТГСК
• СВ34(+)-линейный химеризм • Общий химеризм
Рис. 3. Мониторинг уровня химеризма для пациента В. после аллоТГСК.
Пациент С
1,0%
0,1%
д :; Д27; 5, 27; 9,9%
Э% \ Д91;2,' /Д91; 1, \% 3% — 25; 1,5%
-11111 111М 0,43; ^ Д43; 0,3% 1111М111 М1111 |||| Ц25;0,1? 1 ' | | | \Д154 £ М1111 ; о,5% 154; 0,4% 11111
20 40 60 80 100 120 Количество дней после аллоТГСК
140
160
180
■ С034(+)-линейный химеризм
-Общий химеризм
Рис. 4. Мониторинг уровня химеризма для пациента С. после аллоТГСК.
ведена аллогенная ТГСК от гаплоидентичного (5/10) родственного донора. На +24 сут наблюдаемый уровень собственных клеток составлял 5% в общей популяции и 9,9% в CD34+-линии. Затем на +41 сут наблюдалось быстрое снижение уровня собственных клеток (рис. 4). На 43 день мониторинга значение собственных клеток достигло отметки 0,31% при оценке общего и 0,25% при оценке линейного (CD34+) химеризма. В дальнейшем процент собственных клеток не превышал 3% как в общей популяции клеток костного мозга, так и в CD34+-линии.
Случай 4. Пациент D., мужчина (38 лет). Диагноз: хронический лимфолейкоз. Проведена аллогенная ТГСК от полностью совместимого (10/10) неродственного донора. На +21 сут наблюдаемый уровень собственных клеток составлял около 40% в общей популяции, CD34+-линии и CD3+-линии. На +70 день мониторинга содержание собственных клеток в костном мозге снизилось до 27% при оценке общего
и 33% при оценке линейного (CD34+) химеризма. Далее на +76 день после аллогенной ТГСК был выполнен повторный анализ химеризма с использованием в качестве исследуемого материала периферической крови. Уровень собственных клеток общей популяции составил 33%, в свою очередь уровень в CD3+-линии составил 9,1% (рис. 5). Указанная картина характерна для острой реакции трансплантат против хозяина [16,17], что подтверждалось клиническими проявлениями. На +128 день после трансплантации уровень собственных клеток пациента в периферической крови составил около 34% в общей популяции и 30% в CD3+-линии.
Обсуждение. Результаты сравнения значений информативности InDel маркеров, полученных для пар реципиент/донор клиники учреждения, с данными других исследований [2, 5, 11, 12] представлены в таблице.
Из данных, представленных в таблице видно, что пары маркеров S09a и S09b, S11a и S11b показа-
Russian clinical laboratory diagnostics. 2019; 64(12)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-12-762-768
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
\ 35%
15% 10%
5%
Пациент D
:: Д26; 42%
Д26; 39% : : Д26; 36 % •— Д70; 33% Д5 L28; 34%
Д76; 33%
ill Э5; 22% У Д128:309
Д70; 27% >ЙГ-Д105;22%
Д76; 9 10% /
Ц105; 20%
-—1—1—1—1— 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 —i—i—i—i— 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 —1—i—1—1—1
20 40 60 80 100
Количество дней после аллоТГСК
120
140
■ С034(+)-линейный химеризм —•— СйЗ(+)-линейный химеризм -Общий химеризм
Рис. 5. Мониторинг уровня химеризма для пациента D. после аллоТГСК.
ли идентичное соотношение информативности внутри локуса для всех популяций; информативность пар маркеров S01a и S01b, S04a и S04b, S07a и S07b изучаемой популяции оказалась противоположна результатам, полученным ранее для других популяций. Данные по группе парных маркеров S08a и S08b, S10a и S10b имели значительное отличие только по сравнению с данными для тайваньской популяции.
Для оценки соотношения информативности маркеров, при исследовании которых не детектировался второй аллель, проводили сравнение с медианой информативности всех маркеров. В результате было установлено, что маркеры S02 (за исключением тайваньской популяции), S05b, GST194 и ACE1721 обладают схожей информативностью относительно медианы во всех популяциях. Для маркера S03 было установлено значение сильно выше медианного, по сравнению с данными предыдущих исследований, что свидетельствует о высокой информативности маркера для изучаемой выборки.
Часть маркеров (S01a, S09a, S10b, S11b, ACE1721, MID402, MID 668b, MID836b, MID847) обладает невысокой информативностью, по отношению к медиане. В связи с этим было решено выделить эти маркеры в подгруппу низкоинформативных, остальные - в подгруппу высокоинформативных. Использование на первом этапе высокоинформативной подгруппы позволит сократить временные и материальные затраты на этапе поиска маркеров, приемлемых для конкретной пары реципиент/ донор. Если этих маркеров будет недостаточно (менее 3 информативных для пациента), то необходимо будет провести поиск по низкоинформативной подгруппе.
Выводы.
Сформированная панель InDel маркеров для мониторинга количественного химеризма успешно апробирована и внедрена в клиническую практику в ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России.
Все маркеры по информативности были разделены на высокоинформативные (информативность не менее 12,9%) - 16 маркеров, низкоинформативные (информативность менее 12,9%) - 9. Учёт информативности потенциальных маркеров позволяет сократить материальные и временные затраты на этап поиска информативных маркеров.
Снижение чувствительности метода до 0,1% не сказалось на прогностической способности метода. При необходимости чувствительность может быть повышена за счет увеличения количества ДНК, используемого в исследовании.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование выполнено при поддержке гранта «УМНИК» (Договор №14113ГУ/2019 (код 0047159)).
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-4, 6-9, 11-17 см. REFERENCES)
5. Лавриненко В.А., Савицкая Т.В., Волочник Е.В., Марейко Ю.Е., Алейникова О.В. Количественный анализ химеризма после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток молекулярно-генетическими методами. Онкогематология. 2014; 9 (2): 29-36. 10. Блау О.В. Химеризм после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Клиническая онкогематология. 2013; 6(1): 34-9.
REFERENCES
1. Lukanov T., Ivanova-Shivarova M., Naumova E. Chapter 4. Monitoring of Chimerism Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. In: Stem Cells in Clinical Practice and Tissue Engineering, Rijeka: IntechOpen; 2018: 77-93.
2. Alizadeh M., Bernard M., Danic B., Dauriac C., Birebent B., Lapart C. et al. Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction. Blood. 2002; 99(12): 4618-25.
3. Koldehoff M., Steckel N.K., Hlinka M., Beelen D.W., Elmaagacli
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
A.H. Quantitative analysis of chimerism after allogeneic stem cell transplantation by real-time polymerase chain reaction with single nucleotide polymorphisms, standard tandem repeats, and Y-chromo-some-specific sequences. Am. J. Hematol. 2006; 81(10): 735-46.
4. Scheffer P.G., van der Schoot C.E., Page-Christiaens G.C., Bossers
B., van Erp F., de Haas M. Reliability of fetal sex determination using maternal plasma. Obstet Gynecol. 2010; 115(1): 117-26.
5. Lavrinenko V.A., Savitskaya T.V., Volochnik E.V., Mareyko Yu.E., Aleynikova O.V. Quantitative analysis of chimerism after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation with molecular genetic methods. Onkogematologiya. 2014; 9 (2): 29-36. (in Russian)
6. Bader P., Niethammer D., Willasch A., Kreyenberg H., Klingebiel T. How and when should we monitor chimerism after allogeneic stem cell transplantation? Bone Marrow Transplant. 2005; 35(2): 107-19.
7. Lion T., Watzinger F., Preuner S, Kreyenberg H., Tilanus M., de Weger . et al. The EuroChimerism concept for a standardized approach to chimerism analysis after allogeneic stem cell transplantation. Leukemia. 2012; 26: 1821-8.
8. Gineikiene E., Stoskus M., Griskevicius L. Recent advances in quantitative chimerism analysis. Expert Rev. Mol. Diagn. 2009; 9(8): 817-32.
9. Jacque N., Nguyen S., Golmard J.L., Uzunov M., Garnier A., Leblond V. et al. Chimerism analysis in peripheral blood using indel quantitative real-time PCR is a useful tool to predict post-transplant relapse in acute leukemia. Bone Marrow Transplant. 2015; 50(2): 259-65.
10. Blau O.V. Chimerism following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Klinicheskaya оnkogematologiya. 2013; 6(1): 34-9. (in Russian)
11. Bach C., Tomova E., Goldmann K., Weisnbach V, Roesler W., Mackensen A., et al. Monitoring of Hematopoietic Chimerism by Real-Time Quantitative PCR of Micro Insertions/Deletions in Samples with Low DNA Quantities. Transfus. Med. Hemother. 2015; 42(1): 38-45.
12. Chen D.P., Tseng C.P., Wang W.T., Wang M.C., Tsai S.H., Sun C.F.. Real-time biallelic polymorphism-polymerase chain reaction for chimerism monitoring of hematopoietic stem cell transplantation relapsed patients. Clin. Chim. Acta. 2011; 412 (7-8): 625-30.
13. Mullaney J. M., Mills R. E., Pittard, W. S. Devine S. E. Small insertions and deletions (INDELs) in human genomes. Human Molecular Genetics. 2010; 19 (2): 131-6.
14. Vali U., Brandstrom M., Johansson M., Ellegren H. Insertion-deletion polymorphisms (indels) as genetic markers in natural populations. BMC Genetics. 2008; 9(1): 8.
15. Gonzalez K.D., Hill K.A., Li W., Scaringe W.A., Wang J.C., Gu D. et al. Somatic microindels: analysis in mouse soma and comparison with the human germline. Hum. Mutat. 2007; 28 (1): 69-80.
16. Breuer S., Preuner S., Fritsch G, Daxberger H., Koenig M., Po-etschger U. et al. Early recipient chimerism testing in the T- and NK-cell lineages for risk assessment of graft rejection in pediatric patients undergoing allogeneic stem cell transplantation. Leukemia. 2012; 26(3): 509-19.
17. Martinez-Laperche C., Noriega V., Kwon M., Balsalobre P., Gonzalez-Rivera M., Serrano D. et al. Achievement of early complete donor chimerism in CD25-activated leukocytes is a strong predictor of the development of graft-versus-host-disease after stem cell rans-plantation. Experimental Hematology. 2015; 43(1): 4-13.
Поступила 14.08.19 Принята к печати 16.09.19
