CC BY
29
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XV, № 3, 2019
В связи с этим, разработка методики количественной оценки уровня химеризма с высокой чувствительностью после аллогенной ТГСК представляется актуальной задачей.
Цель исследования. Разработать методику количественной оценки уровня линейного и общего химеризма после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток методом InDel ПЦР в реальном времени.
Материалы и методы. Материалом для исследования служили биологические образцы пациентов и доноров — периферическая кровь и костный мозг. Сортировку клеточных линий (CD34+; CD3+) проводили с использованием магнитных частиц, конъюгированных с антителами к соответствующим маркерам (Dynabeads, Thermo Fisher Scientific). Препараты ДНК для оценки уровня химеризма были получены методом колоночной фильтрации с помощью наборов QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAgen, Германия). Для проведения количественной ПЦР в режиме реального времени в качестве флуоресцентной метки зонда использовали 5'-FAM, в качестве гасителя флуоресценции зонда — 3'-RTQ. Детекцию сигнала проводили на приборе ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия).
Результаты. Мониторинг количественного химеризма включает в себя три последовательных этапа: 1) поиск информативных маркеров (InDel) для пациента и донора (позволяет выявлять маркеры, обнаруживаемые у пациента, но не детектируемые у донора, и наоборот); 2) оценка эффективности ПЦР в реальном времени (проводится в случае выявления лишь одного информативного маркера); 3) собственно анализ уровня химеризма после ТГСК. В ходе анализа данных литературы была сформирована панель олигонуклеотидов, содержащая
праймеры и зонды к двадцати шести маркерам и к одному референсному гену. Для каждого маркера была проведена оценка работоспособности праймеров и зондов, в ходе которой из первоначально сформированной панели был исключен один маркер (S06). Далее была оценена эффективность ПЦР в реальном времени для одного из маркеров (S01a) при различных количествах ДНК, вносимых в реакцию (250 нг, 200 нг, 150 нг, 100 нг, 50 нг, 25 нг). В ходе этого эксперимента было получено оптимальное количество ДНК на реакцию (70 нг), обеспечивающее разрешающую способность методики не менее 0,1 % с возможностью оценки линейного химеризма. В связи с тем, что для подсчета результатов используется экспоненциальная зависимость между количеством специфичной ДНК в пробе и пороговым циклом информативного маркера (Ct), а при измерении высоких значений уровня химеризма усиливается влияние случайных факторов и погрешности в оценке порогового цикла (Ct), это приводит к получению недостоверных результатов (завышению или занижению). По этой причине ограничением данного метода является невозможность точной оценки высокого уровня химеризма (60 % и более), что требует применения других методик (STR-ПЦР, FISH и т.д.).
Выводы. 1. Разработана методика количественной оценки общего и линейного химеризма методом ПЦР в реальном времени с использованием панели праймеров к генетическим полиморфизмам — InDel. 2. Методика характеризуется высокой чувствительностью (до 0,1 % собственных клеток пациента), что позволит выявлять возможный рецидив заболевания на ранних сроках.
В. В. Черанев, М. А. Логинова, Д. Н. Смирнова, С. С. Кутявина, И. В. Парамонов
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови» Федерального медико-биологического агентства, Киров
МОНИТОРИНГ ПОСТТРАНСПЛАНТАЦИОННОГО ХИМЕРИЗМА МЕТОДОМ INDEL ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
Введение. Успех аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) во многом определяется взаимодействием трансплантата и организма реципиента. Нежелательными клиническими проявлениями такого взаимодействия являются «реакция
трансплантат против хозяина», развитие посттрансплантационного рецидива, отторжение и др. Мониторинг химеризма после аллогенной ТГСК важен для оценки эффективности трансплантации, выявления ранних рецидивов и своевременной коррекции терапии. В настоящее
Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием
«АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ»
время для определения маркеров донорского химеризма применяют как традиционные (скрининг антигенов эритроцитов АВО, Резус и др.), так и классические (цитогенетические или молекулярно-генетические). Определение полиморфизма InDel-локусов с использованием количественной ПЦР является наиболее чувствительным методом оценки донорского химеризма.
Цель исследования. Апробировать и внедрить в клиническую практику методику мониторинга посттрансплантационного химеризма методом InDel ПЦР в реальном времени.
Материалы и методы. Исследование включало 26 онкогематологических больных, для всех из них был подобран потенциальный родственный/неродственный донор; для 21 из них была проведена аллогенная ТГСК (для 13 — родственная, для 8 — неродственная). Материалом для исследования служили биологические образцы пациентов и доноров — периферическая кровь и костный мозг. Сортировку клеточных линий (CD34+; CD3+) осуществляли с использованием магнитных частиц, конъю-гированных с антителами к соответствующим маркерам (Dynabeads, Thermo Fisher Scientific). Препараты ДНК для оценки уровня химеризма были получены методом колоночной фильтрации с помощью наборов QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAgen, Германия). Оценку уровня химеризма проводили методом InDel ПЦР в реальном времени с использованием панели, состоящей из 25 полиморфизмов и одного референсного гена. Для проведения количественной ПЦР в режиме реального времени в качестве флуоресцентной метки зонда использовали 5'-FAM, в качестве гасителя флуоресценции зонда — 3'-RTQ. Детекцию сигнала проводили на приборе ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия).
Результаты. В ходе проведенного исследования установлено, что для всех 26 пар донор-реципиент были найдены информативные маркеры: не менее трех для родственных алло-ТГСК и не менее шести для неродственных.
Санкт-Петербург 30-31 мая 2019 г.
Информативность каждого маркера была подтверждена с использованием классической ПЦР и ПЦР в реальном времени. Все маркеры по частоте встречаемости в качестве информативных были разделены на высокоинформативные (частота информативности более 10 %) — 7 маркеров, среднеинформативные (частота информативности от 5 до 10 %) — 14, низкоинформативные (частота информативности менее 5%) — 4. Это позволит в дальнейшем сократить материальные затраты на этап поиска информативных маркеров пар донор-реципиент за счет сокращения панели анализируемых полиморфизмов до высокоинформативных. Нами было проведено сравнение эффективности ПЦР идентичного информативного маркера для 5 пациентов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эффективность прохождения ПЦР варьируется в зависимости от пары донор-реципиент, и при необходимости значение эффективности ПЦР должно быть рассчитано для каждого случая отдельно. За период с января 2018 по март 2019 года была проведена количественная оценка уровня линейного (CD3+, CD34+) и общего химеризма для 21 пациента клиники Учреждения. У двух из них наблюдался рецидив заболевания, у одного — неприживление трансплантата; во всех случаях уровень собственных клеток реципиента превышал 90 %.
Выводы. 1. За период с января 2018 по март 2019 апробирована и внедрена в клиническую практику Учреждения методика мониторинга посттраснплантационного химеризма методом 1^е1 ПЦР в реальном времени. 2. Сформированная панель биомаркеров имеет высокую степень информативности для пар донор-реципиент нашего региона. 3. Внедренная методика обладает высокой чувствительностью и точностью при уровнях химеризма до 10 % и выше 90 %, в остальных случаях целесообразно использовать другие методики, например, STR-ПЦР.
