CC BY
29УДК 541.14 Alexander I. Ponyaev, Jana S. Glukhova
PHOTOPHYSICAL AND PHOTOCHEMICAL PROPERTIES OF XANTHENE DYES
St. Petersburg State Institute of Technology (Technical University), Moskovsky Pr., 26, St Petersburg, 190013, Russia e-mail: [email protected]
Photophysical and photochemical properties of xanthene dyes are analyzed. Sulphoderivative analogues of fluorescein are studied by the flash photolysis method. It is shown that the substitution of a carboxyl group by a sulphogroup in a phthalic fragment of fluorescein affects only slightly the absorption and fluorescence spectra and also the efficiency of photocatalytic decomposition of water to hydrogen, that distinguishes them from the fluorescein derivatives with a sulfur atom instead of an oxygen atom in the xanthene fragment.
Keywords: fluorescence, sulphogroup, photoinduced form, triplet, radical, flash photolysis, kinetics.
DOI 10.15217Zissn1998984-9.2016.37.23
Введение
Аккумуляция Солнечной энергии, в том числе, в форме разложения воды до экологически чистого топлива - водорода, является глобальной научной задачей [13]. Водород интересен как наиболее экологически чистое, наиболее энерговыделяемое топливо и как ценное химическое сырье [4-6].
В настоящее время предложено несколько основных путей для разложения воды под действием солнечного излучения. Термохимические - используют тепло, полученное за счет солнечной энергии. Электрохимические - используют электроэнергию, полученную от других источников. В тоже время сама природа подсказывает фотохимический путь разложения воды. В природном фотосинтезе хлорофилл зеленых листьев при поглощении солнечного света обеспечивает восстановление углекислого газа до органических соединений и окисление воды до кислорода [7 - 9].
Для фоторазложения воды до водорода и кислорода были предложены схемы искусственного фотосинтеза, в основе которых лежит запасающая энергию света каталитическая реакция переноса электрона [7 - 13]:
В дальнейшем происходят темновые реакции с восстановлением воды до водорода и окислением воды до кислорода:
2А- + 2Н2О ^ 2А + Н2 +2ОН-4Д++ 2Н2О ^ 4Д + О2 + 4Н+
+ 547.816
А.И. Поняев1, Я.С. Глухова2
ФОТОФИЗИЧЕСКИЕ И ФОТОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КСАНТЕНОВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр. 26, Санкт-Петербург, 190013, Россия e-mail: [email protected]
Проанализированы фотофизические и фотохимические свойства ксантеновых красителей. Методом импульсного фотолиза исследованы сульфопроизводные аналоги Флуо-ресцеина. Показано, что замена карбоксильной группы на сульфогруппу во фталевом фрагменте Флуоресцеина практически не влияет на спектры поглощения, флуоресценции, эффективность фотокаталитического разложения воды до водорода, что отличает их от производных Флуоресцеина с атомом серы вместо атома кислорода в ксантеновом фрагменте.
Ключевые слова: флуоресцеин, сульфогруппа, фотоин-дуцированная форма, триплет, радикал, импульсный фотолиз, кинетика.
Молекулярные системы, преобразующие энергию света в энергию каталитической реакции восстановления воды до молекулярного водорода на первом этапе [14 - 17] включали индивидуальные: сенсибилизатор, переносчик электрона, катализатор и необратимо расходуемый, «жертвенный» донор электрона. В такой трехкомпонент-ной системе наиболее изученным фотокатализатором является трис(2,2'-биспиридин)рутения (II) [15 - 19]:
В такой системе возбужденное триплетное состояние комплекса рутения {kRu(bpy)32+) взаимодействует с дикатионом метилвиологена (MV2+). В результате переноса электрона образуется монокатион-радикал метилвио-логена (МУ+), который на платиновом катализаторе восстанавливает воду с образованием, в конечном счете, молекулярного водорода:
Основным недостатком изученных систем является узость спектрального диапазона поглощения Солнечного излучения трис(2,2'-биспиридин)рутением (II). Комплекс рутения поглощает свет в узкой, коротковолновой области спектра (457 нм) и попытки батохромного сдвига полосы его поглощения за счет структурных изме-
1 Поняев Александр Иванович, д-р хим. наук, профессор, кафедра теоретических основ материаловедения, e-mail: [email protected] Alexander I. Ponyaev, Dr Sci. (Chem.), Professor Theory of Materials Science Department
2 Глухова Яна Сергеевна, инженер, кафедра теоретических основ материаловедения, e-mail: [email protected] Jana S. Glukhova, engineer Theory of Materials Science Department
Дата поступления - 9 октября 2016 года
нений, результата практически не дали. Система к тому же весьма чувствительна к колебаниям параметров среды и рН. Серьезным недостатком такой системы является то, что переносчик электрона (дикатион метилвиологена), гидрируется в восстановительной водородной атмосфере и снижает ресурс работы системы [7].
Таким образом ясно, что возможности данной системы фотовосстановления воды ограничены и необходим поиск других практически приемлемых фотокатализаторов. Японские ученые [20] предложили гомогенные двухкомпонентные системы с ксантеновыми красителями как с сенсибилизаторами, что позволило упростить систему и обойтись без промежуточного переносчика электрона. В такой системе краситель может совмещать функции сенсибилизатора и переносчика электрона. Это совмещение возможно благодаря тому, что дианион ксантенового красителя в триплетном состоянии восстанавливается до радикала (дианион-радикала), живущего достаточно долго, чтобы продиффундировать к катализатору и обладающего потенциалом, достаточным для восстановления воды. В работе [20] впервые для фоторазложения воды использовались известные ксантеновые красители: Флу-оресцеин, Эозин, Бенгальская Роза, Эритрозин.
Флуоресцеин: R = Н; Эозин: R = Вг; Эритрозин: R = J; Бенгальская Роза
Одна из наиболее полных схем фотопревращений этого класса соединений включает следующие реакции:
1. Поглощение света. Ксантеновые красители ряда Флуоресцеина поглощают в зависимости от строе-
ния и рН в области 450-550 нм. Например, Хмакс. поглощения Флуоресцеина 491 нм, Эозина 516 нм (е = 74000 л/ мольсм, вода рН 5), Бенгальской Розы 545 нм (е = 68000 л/мольсм, вода рН 5).
КрБ° ^ КрБ1 2. Безызлучательная дезактивация. Для Флуоресцеина и Эозина квантовый выход безызлучатель-ной дезактивации в полярных средах практически равен нулю, увеличение квантового выхода замечено лишь для Флуоресцеина в диметилсульфоксиде, диметилформа-миде и формамиде. В метиловом спирте измерены константы скорости дезактивации к2 для Бенгальской Розы 3.6108, Эритрозина 6.8108, Эозина 4.4108
• КрБс+ А
Тем самым в двухкомпонентной системе была снята необходимость организации транспорта электрона от красителя-сенсибилизатора к переносчику как в случае трехкомпонентной системы и квантовый выход образования водорода определяется, главным образом, фотофизическими и фотохимическими свойствами красителя
Анализ совокупности свойств органических красителей показывает, что этим требованиям отвечают только некоторые ксантеновые и акридиновые красители [20-24]. Ксантеновые красители - один из старейших классов красителей, и они хорошо изучены и нашли применение в фотографии, в биологических исследованиях, как восстановительные индикаторы, как рабочее вещество в лазерах, как сенсибилизаторы генерирования син-глетного кислорода и др. Они интенсивно поглощают видимый свет, обладают жесткой структурой и интенсивно люминесцируют, введение тяжелых атомов в структуру молекулы позволяют увеличить заселение триплетных состояний, которые восстанавливаются и окисляются с образованием реакционноспособных катион- и анион-радикалов [25-30]. Ксантеновые красители довольно подробно описаны в литературе, но большинство исследователей ограничивались только производными Родамина, а среди производных Флуоресцеина наиболее изучены только 4 представителя: Флуоресцеин и его галоидпроизводные.
о
3. Флуоресценция. Большинство ксантеновых красителей ряда Флуоресцеина обладают заметной флуоресценцией, при этом наиболее интенсивной - дианио-ны. Из литературных данных можно сделать вывод о тушащем влиянии тяжелого атома в структуре молекулы на квантовый выход флуоресценции: ффл. для Флуоресцеина 0.97, Эозина 0.24, Эритрозина 0.08, Бенгальской Розы 0.11. Хмакс. флуоресценции Флуоресцеина - 525 нм, Эозина - 550 нм, Бенгальской Розы - 571 нм. Время жизни синглетного возбужденного состояния тs составляет величину 0.1-4 нс в зависимости от структуры и растворителя. Замечено, что в протонодонорных растворителях для Розы Бенгальской т^ в 5 раз меньше, чем в апротонных. Время жизни падает с ростом числа галогенов в структуре молекулы, как в серии с бромом, так и с иодом (при этом тs в иодсодержащих соединениях всегда меньше, чем у бромсодержащих).
КрБ
■ КрЧку, фл
4. Тушение возбужденного синглетного состояния акцепторами и донорами электрона. Для Эозина в воде к4=1.41010 М-1с-1 при тушении фенолом.
5. Интеркомбинационная конверсия. Внутренний эффект тяжелого атома приводит к существенному увеличению фТ: так, для Флуоресцеина (вода, рН = 9) фТ 0.07, для Эозина 0.71, для Эритрозина 0.95, Розы Бенгальской 0.76. Константа скорости интеркомбинационной конверсии для Эритрозина 1.4109 с-1, Розы Бенгальской 1.7109 с-1 (МеОН), Эозина 5.8107 с-1 (вода).
6. Безызлучательная дезактивация триплетного возбужденного состояния. Константа скорости этого процесса для Бенгальской Розы и Эритрозина в метаноле -103 с-1, для Бенгальской Розы в воде при рН 5 - 2104 с-1, для Эозина в тех же условиях 5103 с-1, для Флуоресцеина 1.5104 с1.
Крт
- КрБ°+ Д
7. Фосфоресценция. В жидких растворах при комнатной температуре практически не наблюдается. Есть данные о фосфоресценции Эритрозина, зарегистрированной методом импульсного фотолиза в области 700 нм.
8. Замедленная флуоресценция типа Е. Впервые наблюдалась на примере Эозина - имеет спектр обычной флуоресценции, но аномально большое время жизни.
к
Кр7
■ KpSl -> Kps° + /п/фЛ.
9. Триплет-триплетное поглощение. Для ксанте-новых красителей ряда Флуоресцеина зарегистрированы спектры триплет-триплетного поглощения в области 400-600 нм. У Флуоресцеина в воде Хмакс. T-T поглощения 520 нм (sT-T=8103 М-1см-1), у Эозина в воде Хмакс. T-T 459, 540 нм (sT-T 459 нм =4.4104 М-1см-1), у Бенгальской Розы в воде-580 нм (st-t=1.4104 М-1см-1) и 587 нм в метаноле (et-t=6.3103 М-1см-1). В работе [30] для Эозина и Эритро-зина зарегистрировано триплет-триплетное поглощение в ИК области. В работе [31] для тетрахлор-Флуоресцеи-на методом импульсного фотолиза изучено триплет-три-плетное поглощение в высшие возбужденные состояния, зарегистрированы полосы с Хмакс.343, 375, 400, 424, 580, 800 нм.
Крт1 -> KpTi
10. Триплет-триплетная аннигиляция. Имеет место при высоких концентрациях триплетов. Значение константы скорости процесса kw, описываемого уравнением 10 для Флуоресцеина (вода, рН 12) равно 1010 М-1с-1, для Эозина в воде (рН 9.1) 510""
11. Концентрационное тушение и эксимер-ная фосфоресценция. Измеренная величина константы скорости для Флуоресцеина в воде (рН12) составляет 108 М-1с-\ Эозина (рН 9) 3108 М-1с-\ Эритрозина (рН 9) 2.2108 М-1с-1.
17, 18. Триплет-триплетный перенос энергии. Константа скорости переноса энергии с Эозина на антрацен составляет в этаноле 5.1108 лмоль-1с-1, с Эритрозина на антрацен 7.3109 лмоль-1с-1.
Кр + Ат Крт1 + Ат ^ Кр\ А,
12. Безызлучательная дезактивация при взаимодействии с кислородом. Константа скорости тушения триплетов кислородом для Флуоресцеина равна 1.6109 л-моль-1с-1, для Эозина 1.1109 лмоль-1с-1 в воде.
KpTl + 02 -> Kps° + Д
13. Тушение триплетных состояний в результате переноса электрона на кислород. Для Эозина k13=3108 М-1с-1. Квантовый выход окислительного обесцвечивания Эозина 310-4.
Двухкомпонентные гомогеннокаталитические системы в силу своей относительной простоты могут быть использованы как модельные для более сложных систем и в них в наиболее яркой форме проявляются особенности присущие именно красителю - как основному компоненту фотокаталитической системы. Многочисленные мыслимые аналоги производных Флуоресцеина с химических и особенно с фотофизических и фотокаталитических позиций изучались недостаточно. Реакционная способность красителей под действием света в двухкомпонентной фотокаталитической системе, как видно из схемы, в значительной мере определяется эффективностью заселения триплетных состояний и образования радикалов.
Анализ литературных источников и наши экспериментальные данные и возможности по изучению триплетов и радикалов, позволяют предложить молекулярный инжиниринг систем на основе ксантеновых красителей для потенциально высокой эффективности фоторазложения воды до водорода под действием солнечного излучения. Существуют два основных пути увеличения заселенности триплетных состояний: с использованием триплетного сенсибилизатора (внешнего или внутреннего) и путем введения в структуру молекулы тяжелых атомов.
Ранее мы показали [33-36], что введение в ксан-теновый фрагмент Флуоресцеиновых производных (1-3) более тяжелого атома серы вместо атома кислорода (46), увеличивает квантовый выход триплетов и фотоводорода. Наибольший выход фотоводорода был получен в 2-х компонентной системе на основе тетрабромтиофлу-оресцеина (5).
С целью проследить влияние атома серы в фе-нильном фрагменте на фотофизические и фотокаталитические свойства и увеличить растворимость в воде было изучено сульфопроизводное Флуоресцеина (7) и его те-трабромпроизводное (8).
14. Образования синглетного кислорода. Константы скорости в метиловом спирте 1.2109 М-1с-1 для Бенгальской Розы, 1.2109 М-1с-1 для Эритрозина. Квантовый выход образования синглетного кислорода 0.4 для Эозина, 0.6 для Эритрозина, 0.76 для Бенгальской Розы.
KpTi +02^> Kps° + 0'2
15, 16. Тушение триплетного состояния акцепторами и донорами электрона. Методам импульсного фотолиза исследованы спектры поглощения катион и анион-радикалов производных Флуоресцеина в видимой и ИК области. Хмакс. анион-радикала Флуоресцеина - 394 нм (е=5104 лмоль-1см-1), Эозина - 405 нм (s=3.8104 лмоль-1 см-1), Эритрозина - 415 нм. Подробно изучен механизм образования соответствующих радикалов, который включает образование промежуточных триплетных эксиплек-сов [32]. Квантовый выход образования анион-радикала Ф^Кр- = 0.001 для Флуоресцеина, 0.05 для Эозина и 0.004 для Бенгальской Розы.
1 R = H Флуоресцеин
2 R = Br Эозин
3 R = J Эритрозин
O -O R R
4 R^
5 R=Br
6 R=J
7 R=^
8 R=Br
Электронные спектры поглощения дианионов красителей (7, 8) в 0,1 н. NaOH близки соответственно Флуоресцеину (1) и Эозину (2) (рисунок 1). Это неудивительно, так как фенильный фрагмент развернут относительно ксантенового ядра и сопряжение в них чрезвычайно мало.
А,. НМ
Рисунок 1. Электронные спектры поглощения в 0,1н. NaOH:
1 - сульфофлуоресцеина (7), 2 - тетрабромпроизводного (8);
3 Эозина
Оба соединения обладают заметной флуоресценцией. Квантовые выходы также близки к Флуоресце-иновым аналогам ффл.(7) = 0,95, ффл (8) = 0,35. Стоксов сдвиг составляет 20-25 нм.
При импульсном фотовозбуждении лампами ИФП-5000 через стеклянный светофильтр (X > 320 нм) водных растворов (рН~12) красителей (7, 8) происходят процессы аналогичные наблюдаемым для производных Флуоресцеина (1-3) [28] и тиофлуоресцеина (4-6) [33]. При импульсном фотовозбуждении красителей (7, 8) регистрируются окрашенные в видимой области спектра ко-роткоживущие анион- и катион-радикалы, образующиеся в результате гибели триплетов, поглощающих в более длинноволновой области (рисунок 2).
При малой концентрации исходного красителя оптическая плотность анион-радикала, генерированного по реакции Кр+донор электрона (аскорбиновая кислота), стремится к насыщению при увеличении концентрации аскорбиновой кислоты. Если предположить, что предельное значение оптической плотности определяется 100 %-ным переходом триплетов в анион-радикальную форму, а концентрацию триплетов приравнять исходной концентрации красителя при высоких энергиях возбуждения, то можно определить нижний предел значения коэффициента экстинкции анион-радикала. При этих допущениях коэффициент экстинкции Кр-* для соединения (7) равен 1,4104 л моль-1см-1 и для соединения (8) - 3,8104 л-моль-1-см-1. Кинетика гибели анион-радикала красителя (8) (Хмакс. 393нм) подчиняется уравнению второго порядка. С учетом полученного значения коэффициента экстинкции Кр-* значение константы скорости второго порядка диспропорционирования анион-радикалов составляет 1,2108 л моль-1см-1. Отличие полученной константы скорости от диффузионной (более чем на порядок) обусловлено тройным отрицательным зарядом на реагирующих частицах и, как следствие, электростатическим отталкиванием. С использованием полученных значений коэффициентов экстинкции анион-радикалов и экспериментально регистрируемых значений оптической плотности фотогенерированных анион-радикалов вычислили выход последних на «вспышку». При одинаковых условиях возбуждения (энергия вспышки, геометрия системы, спектральный состав возбуждающего источника) выход анион-радикала генерированного по реакции Кр + Аскорбиновая кислота в 3 раза выше, чем по сумме реакций КрТ1 + КрТ1 и КрТ1 + КрЭ0 . Так при исходной концентрации красителя (8) 210-6 мольл-1 и добавлении аскорбиновой кислоты той же концентрации, концентрация анион-радикала за вспышку в первом случае составляет 510-7 мольл-1, а во втором 1,610-7 мольл-1. Для соединения (7) оба эти значения в тех же условиях в 2,5 раза
А, нм
Рисунок 2. Дифференциальные спектры поглощения короткоживущих продуктов фотолиза сульфопроизводных (7, 8) после импульсного фотовозбуждения в 0.1 н. ШОН: 1 - сульфофлуоресцеин (7), со 410-5 М; 2 - тетрабромсульфофлуоресЦеин (8), со 7,210-6 М. (о) - через 100 мкс после начала вспышки, (•) - через 500 мкс после начала вспышки, (V) - через 100 мкс после начала вспышки. Е = 125 Дж
Квантовый выход триплетных состояний для соединений (7, 8) проводили методом сравнения со стандартом, в качестве которого был выбран Эозин. При одинаковых условиях возбуждения (интенсивность и спектральный состав источника, геометрия системы) справедливо выражение [37]:
Хфт = стфт ( стет ■ ю ■ сту/ХЕт ■ ■ Ху)
здесь индексы х и ст относятся к исследуемому веществу и стандарту: у - доля поглощенного света; Ет - соответствующий коэффициент экстинкции триплет-триплетного поглощения и D - его оптическая плотность.
Подставляя в выражение для хфт полученные экспериментальные данные для Эозина и сульфокрасите-лей (7, 8) вычислили фт = 0,05±0,02 для соединения (7) и фт = 0,6±0.1 для соединения (8). Полученные значения близки значениям фт для Флуоресцеина (1) и Эозина (2), соответственно. При этом сумма квантовых выходов флуоресценции и триплетов также близка к единице, что говорит о практическом отсутствии безызлучательных процессов для этих соединений.
Таким образом, атом серы в сульфогруппе практически не влияет на фотофизические параметры ксан-теновых красителей и это отличает его от атома серы в ксантеновом фрагменте.
На рисунке 3 приведена зависимость количества, выделившегося водорода для соединений (7, 8) по сравнению с Флуоресцеином и Эозином.
VHj. МЛ
Время, ч
Рисунок 3. Кинетика выделения водорода в системе: краситель (10-3 М), триэтаноламин (10-1 М), Pt, стабилизированная поливинилпирролидоном: 1 - Эозин (2), 3 - тетрабромсульфофлуоресцеин (8) 4 - Флуоресцеин (1), 2 - сульфофлуоресцеин (7)
Видно, что введение сульфогрупп почти не сказывается на фотокаталитической активности этих соединений. Так как эффективность заселения триплетов и образования радикалов для сульфосоединений близки Флуоресцеиновым аналогам, поэтому неудивительно, что красители (7, 8) и в каталитической системе ведут себя аналогично Флуоресцеину и Эозину.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации и гранта Российского фонда фундаментальных исследований (16-08-01299-а).
Литература
1. Сиваш А.А. Аккумуляция солнечной энергии: фотосинтез или искусственные системы // Биотехнология. 2012. Т. 5. № 6. С. 27-38.
2. Funk James E. Thermochemical hydrogen production: past and present // Int J Hydrogen Energy. 2001. Vol. 26. № 3. P. 185-190.
3. SteinfeldAldo Solar thermochemical production of hydrogen - a review // Solar Energy. 2005. Vol. 78. Issue 5. P. 603-615.
4. Zhang Fan, Zhao Pengcheng, Niu Meng, Maddy Jon The survey of key technologies in hydrogen energy storage // International Journal of Hydrogen Energy. 2016. Vol. 41. Issue 33. P. 14535-14552.
5. Nowotny J., Sorrell C.C., Bak T., Sheppard L.R. Solar-hydrogen: Unresolved problems in solid-state science // Solar Energy. 2005. Vol. 78. Issue 5. P. 593-602.
6. Aneke Mathew, Wang Meihong Energy storage technologies and real life applications - A state of the art review // Applied Energy. 2016. Vol. 179. P. 350-377.
7. Энергетические ресурсы сквозь призму фотохимии и катализа: Пер. с англ. / Под ред. М. Гретцеля. М.: Мир, 1986. 632 с.
8. Фотокаталитическое преобразование солнечной энергии. Часть 1. Химические и биологические методы / Под ред. К.И. Замараева. Новосибирск: Наука, 1985. 200 с.
9. Фотокаталитическое преобразование солнечной энергии. Часть 2. Молекулярные системы для разложения воды / Под ред. К.И. Замараева. Новосибирск: Наука. 1985. 248 с.
10. Kudo A., Kato H., Tsuji I. Strategies for the development of visible-light-driven photocatalysis for water splitting // Chem. Lett. 2004. Vol. 33. № 12. P.1534-1539.
11. Harriman A. Artificial photosynthesis // J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry. 1990. Vol. 51. № 1.
P. 41-43.
12. Light-induced charge separation in biology and chemistry / Ed. H.Gerischer, J.J. Katz N.Y.: Verlag chemie, 1982. 562 p.
13. Infelta P.P. Photochemical water cleavage: A simple kinetic analysis // J. Photochem. 1982. Vol. 20. № 3. P. 181-196.
14. Корякин Б.В., Джабиев Т.С., Шилов А.Е. Фото-сенсибилизированное восстановление воды в растворах красителей. Модель бактериального фотосинтеза // Докл. АН СССР. 1977. Т. 233. Вып. 4. С. 620-622.
15. Gratzel M. Artificial photosynthesis: Water cleavage into hydrogen and oxygen by visible light // Acc. Chem. Res. 1981. Vol. 14. № 12. P. 376-384.
16. Gratzel C. K., Gratzel M. Hydrogen evolution from the photolysis of alcoholic benzophenone solution via redox catalysis // J. Amer. Chem. Soc. 1979. Vol. 101. № 26. P. 7741-7743.
17. Kiwi J., Gratzel M. Hydrogen evolution from water induced by visible light mediated by redox catalysis // Nature. 1979. Vol. 281. P. 657-658.
18. Brugger P.-A., Gratzel M. Light-induced charge separation by functional micellar assemblies // J. Amer. Chem. Soc. 1980. Vol. 102. № 7. P. 2461-2463.
19. Kiwi J., Gratzel M. Colloidal redox catalysts for evolution of oxygen and for ligth-induced evolution of hydrogen from water // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1979. Vol. 18. № 8. P. 624-626.
20. Hashimoto K., Kawai T., Sakata T. The mechanism of photocatalitic hydrogen production with halogenated Fluorescein derivatives // Nouveau Journal de Chimie. 1984. Vol. 8. № 11. P. 693-700.
21. Oncescu T., Srefan M., Contineany M., lonescu S.G. Optimization of hydrogen production from water using proflavine as photosensitizer // Rev. Roum. de Chimie. 1987. Vol. 32. № 9-10. P. 953-960.
22. Kalyanasundaram K., Gratzel M. Proflavine -sensitized photoproduction of H2 from water with electron-donors and colloidal redox catalyst // J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1979. P. 1137-1138.
23. Micic O.I., Nenadovic M.T. Photolyt^ and radiolytic studies of redox processes in aqueous solutions of Acridine Yellow // J. Chem. Soc. Farad. Trans. I. 1981. Vol. 77. № 4. P. 919-925.
24. Chan Man Sze, Bolton J.R. Structures, reduction potentials and absorption maxima of synthetic dyes of interest in photochemical solar energy storage studies // Solar energy. 1980. Vol. 24. № 6. P. 561-574.
25. Neckers D.C. Rose Bengal // J. Photochem. Photobiol. A:Chemistry. 1989. Vol. 47.N 1. P. 1-29.
26. Теренин А.Н. Фотоника молекул красителей и родственных органических соединений. М.-Л.: Наука, 1967. 616 с.
27. Чибисов А.К. Триплетные состояния и процессы переноса электрона в пигментах и красителях: дис-....д-ра хим. наук. М., 1973. 215 с.
28. Коробов В.Е., Чибисов А.К. Первичные процессы в молекулах красителей // Успехи химии. 1983. Т. 52. Вып. 1. С. 43-71.
29. Korobov V.E., Chibisov A.K. Primary processes in the photochemistry of Rhodamine Dyes // J. Photochem. 1978. Vol. 9. № 5. P. 411-424.
30. Захарова Г.В., Чибисов А.К. Спектры три-плет-триплетного поглощения эозина и эритрозина и их полуокисленной формы в ближней ИК-области // Химия выс. энергий. 1984. Т. 18. № 6. С. 552-554.
31. Kamat P.V., Fox M.A. Photophysics and photochemistry of xanthene dyes in polymer solutions and films // J. Phys. Chem. 1984. Vol. 88. № 11. P. 2297-2302.
32. Майер В.Э., Кузьмин В.А., Левин П.П., Хан-нанов Н.К., Шафирович В.Я. Фотохимические реакции ксантеновых красителей и порфиринов цинка с виологе-нами // Химическая физика. 1989. Т. 8. № 9. С. 1191-1196.
33. Ельцов А.В., Поняев А.И., Мартынова В.П. Производные тиофлуоресцеина - эффективные катализаторы генерирования водорода // Журн. орг. химии. 1990. Т. 60. Вып. 3. С. 708.
34. Ельцов А.В., Смирнова Н.П., Поняев А.И. Генерирование водорода при фотокаталитическом разложении воды с использованием в качестве сенсибилизатора ксантеновых красителей. Журн. орг. химии. 1988. Т. 58. Вып. 4. С. 928-929.
35. Поняев А.И., Мартынова В.П. Получение во-
дорода для топливных элементов путем фотокаталитического разложения воды солнечным светом // Известия СПбГТИ(ТУ). 2012. № 17(43). С. 53-55.
36. Ponyaev A.I., Glukhova Y.S. Photocatalysis of hydrogen evolution from water by used thioxanthene dyes // 12th European Congress on Catalysis - Europa Cat-XII, 30 August - 4 September 2015, Kazan, Р. 898-899.
37. Экспериментальные методы химической кинетики / Под ред. Н.М. Эмануэля, М.Г.Кузьмина. М.: МГУ, 1985. 384 с.
УДК 547.316
Tatiana A. Bispen, Igor G. Maslennikov, Dmitryi D. Moldavsky, Ivan M. Fenichev
PRODUCTION OF RERFLUOROETHYL-ISOPROPYLKETONE FROM HEXAFLUOROPROPENE
FGUP RNC «Pricladnaya khimia», Krilenko st., 26 «A», St. Petersburg, 199226, Russia
St. Petersburg State Institute of Technology (Technical University), 26, Moskovsky Pr., St Petersburg, 190013, Russia e-mail: [email protected]
Preparation of perfluoroethylisopropylketone from commercially available hexafluoropropene (HFP) is described. Oxidation of HFP in the presence of chlorine is used to obtain the hexafluoropropene oxide without isolation which is necessary for the reaction.
Key words: perfluoroethylisopropylketone, hexafluoropropene, hexafluoropropene oxide, oxidation
Т.А. Биспен1, И.Г.Масленников2, Д.Д. Молдавский3, И.М.Феничев4
ПОЛУЧЕНИЕ ПЕРФТОРЭТИЛ-ИЗОПРОПИЛКЕТОНА ИЗ ГЕКСАФТОРПРОПЕНА
ФГУП Российский научный центр «Прикладная химия» ул. Крыленко, 26 лит «А», Санкт-Петербург, 193232, Россия Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр., 26, Санкт-Петербург, 190013, Россия e-mail: [email protected]
Описано получение перфторэтилизопропилкетона из про-мышленно доступного гексафторпропена. Необходимую для реакции окись гексафторпропена без выделения получают окислением исходного гексафторпропена в присутствии хлора.
Ключевые слова: перфторэтилизопропилкетон, гексаф-торпропен, окись гексафторпропена, окисление
В прошлом века начали применять в качестве средств пожаротушения перфторированные органические соединения. Одним из эффективных средств выступили перфторированные кетоны и, в частности, перфторэтилизопропилкетон, C2F5-CO-CзF7-i (1). Этот кетон выпускается в ряде стран мира (например, в США и Китае). В России на заводе РНЦ «Прикладная химия» организовано опытное производство этого продукта [1].
В основу получения (1) положено взаимодействие фторангидрида перфторпропионовой кислоты (2) с гексафторпропеном (3):
Схема 1
Исходный фторангидрид (2) является продуктом каталитической изомеризации окиси гексафторпропена (4):
(схема 2) и синтез (1) ПФЭИПК (схема 1) совмещены. Выход целевого перфторэтилизопропилкетона (1) достигает 93 %. После щелочной промывки сырца, его сушки и ректификации получается продукт, содержащий не менее 97 % основного вещества (1) и около 2,5 % димера гексафторпропена, С6Fl2 (5). Полученный продукт (российское торговое название Хладон ПФК-49) по своим пожаротушащим свойствам соответствует зарубежным аналогам.
Тем не менее, несмотря на простоту и эффективность данной технологии, увеличение масштабов производства затруднено из-за малого объема производства в России соединения (2). Поэтому в данной работе в качестве сырья для получения целевого продукта (1) была использована смесь (3) и (4). При этом окись гексафтор-пропена (4) была получена окислением части (примерно 40-49 %) исходного соединения (3).
Таким образом, для получения целевого продукта по данной схеме в качестве исходного фторсодержащего компонента требуется лишь продукт (3). Фактически использованная схема состоит из двух стадий:
первая - окисление части гексафторпропена (3) до окиси гексафторпропена (4)
Схема 2
В качестве катализатора используется фторид цезия (CsF) на активном угле БАУ-2. Процесс изомеризации
Схема 3
и вторая - взаимодействие образовавшейся смеси продуктов с получением целевого соединения - перфторэти-лизопропилкетона (1)
1 Биспен Татьяна Алексеевна, науч. сотр., РНЦ «Прикладная химия» Tatiana A. Bispen, researcher, RNC "Pricladnaya khimia
2 Масленников Игорь Георгиевич, д-р хим. наУк, профессор, каф. химии и технологии синтетических биологически активных веществ СПбГТИ(ТУ), e-mail: [email protected]
Igor G. Maslennikov, Dr. Sci. (Chem.), Professor, Department of Chemistry and Technologyof Synthetic Biologically Active Substances, St. Peterburg State Institute of Technology (Technical University),
3 Молдавский Дмитрий Дмитриевич, д-р техн. наук, вед. науч. сотр., РНЦ «Прикладная химия» Dmitryi D. Moldavskyi, Dr.Sci. (Eng.), leading researcher, RNC "Pricladnaya khimia"
4 Феничев Иван Михайлович, канд.хим.наук, ст. науч. сотр., РНЦ «Прикладная химия» Ivan М. Fenichev, Ph.D (Chem.),senior researcher, RNC "Pricladnaya khimia"
Дата поступления - 23 ноября 2016 года
Схема 4
Важно подчеркнуть, что для получения целевого продукта (1) не требуется разделения исходной смеси (3) и (4), что является сложной технологической задачей из-за близости температур кипения этих соединений (т. кип. (3) - - 29,1 °С [3], т. кип. (4) - -28 °С [2]).
Обсуждение результатов
Окисление (3) кислородом осуществляется в присутствии инициатора окисления. Из испытанных веществ, возможных для использования в качестве инициатора, нами был выбран хлор, как доступный и хорошо изученный продукт, обеспечивающий необходимую конверсию (3). Было установлено, что при этом хлор взаимодействует с (3) с образованием 1,2-дихлоргек-сафторпропана CClF2-CClF-CFз (6) (хладон 216), т. кип. 35,7 °С [3].
В таблице приведены результаты, полученные при окислении (3) кислородом в присутствии хлора.
Таблица. Окисление гексафторпропена (3) в присутствии хлора
№ Концентрация хлора, % об. Темп., °С Отношение О2 : 3 объемное Скорость подачи О2, мл/мин Состав реакционной смеси, % об. Выход 4, %
О2 СОР2 4 3 6 Примеси
1 0,7 165 3 : 1 75 36,0 2,0 5,2 51,1 2,2 0,5 8,1
2 0,7 195 3 : 1 75 34,8 4,3 23,0 31,1 2,2 0,6 35,3
3 0,7 225 3 : 1 75 33,7 11,8 17,3 32,4 2,2 0,6 26,1
4 0,7 195 3 : 1 75 38,6 13,3 15,0 30,5 2,2 0,4 24,4
5 0,7 195 2,5 : 1 62,5 32,7 4,5 26,8 33,5 2,0 0,5 39,8
6 0,7 195 3 : 1 75 38,6 3,0 13,2 38,5 2,1 0,6 21,5
7 0,7 195 3 : 1 75 35,0 4,6 21,7 32,4 2,0 0,3 33,4
8 0,7 195 2,7 : 1 69 38,6 2,8 23,6 30,5 2,0 0,5 38,4
9 0,7 192 2,2 : 1 56,5 30,0 7,3 25,3 34,9 2,0 0,5 36,1
Из приведенных в таблице данных (п. 5) следует, что наилучшие результаты были получены при 195 °С , концентрации хлора 0,7 % объемных и отношении О2 : (3) = 2,5 : 1,0. При этом получен максимальный в данной серии опытов выход (4) равный 39,8 %. Состав реакционной смеси (% об) : карбонилфторида - 4,5; (4) - 26,8; (3) - 33,5; (6) - 2,0; неидентифицированных примесей - 0,5.
Эта смесь без разделения использовалась для получения целевого продукта (1) . Однако в условиях его синтеза (110-120 °С, катализатор CsF на активированном угле) карбонилфторид может взаимодействовать с (3), образуя перфтордиизопропилкетон (7) [4]
Схема 5
Несмотря на то, что соединение (7) представляет определенный интерес как растворитель и пожаротуша-щий агент, в данном процессе он является нежелательной примесью. На его образование расходуется значительное количество (3). Другие примеси, содержащиеся в полученной смеси ((6), кислород и неидентифицированные соединения), влияния на синтез целевого продукта (1) не оказывают. Поэтому нежелательной примесью, главным образом, является карбонилфторид. Для его удаления смесь промывают щелочью. При этом происходит разрушение карбонилфторида с образованием нелетучих солей:
Схема 6
Смесь, полученная в опыте № 5 (таблица), поступала в ловушку, охлаждаемую до -165 - -170 °С. При этом удалялась большая часть кислорода. После этого смесь нагревалась до 0 °С, пропускалась через колонку, заполненную 7 % раствором NaОН, и для осушки направлялась в колонку, заполненную цеолитом СаА. Очищенную и осушенную смесь, имеющую состав (% об.) кислород - 0,1, (3) - 55,4, (4) - 44,3, (б) - 0,1, неидентифицированные
примеси - 0,1, конденсировали в ловушку, охлаждаемую до -65 °С и использовали для синтеза (1).
Синтез целевого продукта проводили в двух последовательных реакторах, заполненных катализатором CsF (10 % мас.) на активном угле БАУ-2. Температура в первом реакторе составляла 55 ± 2 °С, а во втором -120 ± 5 °С.
Выход целевого продукта (1) составил 93 %. Структура полученного продукта подтверждена при помощи спектра ЯМР1!^:
1
СР,-СБ, — С-СБ 4
1
Хим.сдвиг -5(СС^), м.д.; КССВ J, Гц: 5р1 72,5 (д.т.), J(F1-F4) 6,8, J(F1-F3) 2,9; 5р2 80,8 (д.), J(F2-F4) 6.4; 5р3 119,1 (д.кв.), J(F3-F4) 28,7, J(F3-F1) 2,8; 5р4 189,2 (т.ск.), J(F4-F9) 28,8, J(F4-F1) 6,8. Полученные параметры спектров ЯМР совпадают с литературными [4].
В масс-спектре пик, соответствующий молекулярному иону отсутствовал. Присутствовали пики, соответствующие следующим ионам: F3C - 69 т.е.; F3CCF2 - 119 т.е.; FCCFзCFз - 169 т.е.; FзCCF2CO - 147 т.е.; COFCCFзCFз - 197 т.е.
ИК-спектры показали интенсивную полосу поглощения при 1780 см-1, соответствующую валентным колебаниям карбонильной группы во фторкетонах.
Описание эксперимента
Состав реакционных смесей определялся на га-зо-жидкостном хроматографе "Кристалл 2000М" с детектором по теплопроводности, колонка - силохром +20 % а,а,а-трисбетацианэтоксиацетофенон, длина колонки - 2 м. Структура (1) подтверждена методами хрома-томасс-спектрометрии, ИК-спектроскопии и спектрами ЯМР19Р ИК-спектры снимались на инфракрасном спек-
трометре Prestige-21" фирмы SHIMADZU, спектральный диапазон 4000-400 см-1. Газовый хроматомасс-спек-трометр QP-2010 фирмы «SHIMADZU», диапазон масс 1,5-1090 е.м., способ ионизации - электронный удар. Спектры ЯМР1Е^ снимались спектрометре Вгикег Spektro-spin АМ 500, рабочая частота 470,6 МГц.
Окисление (3) проводили в стальной (12Х18Н10Т) колонне диаметром 40 мм и длиной 750 мм, на 90 % заполненной фторопластовой стружкой и перфторполиэфиром (т. кип. 180 °С при 1 мм рт. ст.). В нижнюю часть колонны при 195 °С подавали соединение (3) и кислород, содержащий 0,7 % об. хлора, со скоростью 25 и 69 мл/мин соответственно. Продукты реакции, выходящие из верхней части колонны, охлаждали и конденсировали в стальной ловушке при -160 - -170 °С (температура поддерживалась испарением жидкого азота). Через 4 ч температуру в реакторе доводили до комнатной. Получали 39,5 г смеси, состав которой приведен в таблице (п. 5).
Полученную смесь очищали при = 0 °С в стальной колонне (диаметр 30 мм, длина 550 мм), содержащей фторопластовую стружку и 7 %-ный водный раствор едкого натра. Очищенную смесь осушали в аналогичной колонне, заполненной цеолитом СаА. Состав очищенной и осушенной смеси указан выше.
Очищенную и осушенную смесь (3) (55,4 %) и (4) (44,31 %) со скоростью 30 мл/мин направляли в два последовательных трубчатых стальных реактора диаметром 30 мм и длиной 500 и 800 мм соответственно, заполненных активным углем БАУ-2, содержащим 10 % мас. CsF. В первом реакторе (изомеризаторе) поддерживалась температура 55±2 °С, а во втором - 120±5 °С. Реакционная смесь из второго реактора направлялось в стальной
конденсатор, объемом 100 мл, охлаждаемый до -50 °С. Через 3 ч опыт прекращали, отогревали ловушку и анализировали её состав. Сырец целевого продукта (1) (30 г) имел состав, (% моль): кислород - 0,05; (3) - 12,7; (1) -84,15; (5) - 2,9; неидентифицированные примеси - 0,1.
Сырец, полученный после четырех опытов (120 г) промывали 8 %-ным раствором Na2CO3, отделяли нижний слой и сушили его цеолитом СаА. Полученные 110 г обработанного сырца ректифицировали на насадоч-ной колонне (диаметр 18 мм, высота 600 мм), заполненной спиралями Левина (диаметр 2,5 мм). Получили 90 г (1) с содержанием целевого вещества 97,2%.
Выводы
Описана возможность получения перфторэтили-зопропилкетона (1) на основе только гексафторпропена (3). При этом исходный (3) частично окисляется до (4) и полученная смесь без разделения используется для получения целевого кетона.
Литература
1. Феничев И.М. Разработка методов и технологии получения перфторэтилизопропилкетона: дис. ... канд. хим. наук. СПб, 2013. 160 с.
2. Кнунянц И. Л., Шокина В.В., Галахов И.В. Пер-фторированные а-окиси // Химия гетероциклических соединений. 1966. № 6. С. 873-878.
3. Максимов Б.Н., Барабанов В.Г., Серушкин И.Л. [и др.]. Промышленные фторорганические продукты: справ. изд. Л.: Химия, 1990. 464 с.
4. Jon L. Howell, Chadron M. Friesen [etal.]. Reactions of poly(hexafluoropropylenen oxide) perfluoroisopropyl // Journal of Fluorine Chemistry. 2008. 129. Р. 178-184.
УДК
Mikhail A. Pushkarev, V.P. Morozkina, Tatiana B. Lisitskaya, Grigorii V. Kozlov
OPTIMIZATION OF CULTURE MEDIA FOR LIPASE PRODUCERS RHODOCOCCUS EQUI
St. Petersburg State Technological Institute (Technical University), Moscovsky pr., 26, St. Petersburg, 190013, Russia e-mail: [email protected]
The aim of this work was to investigate the influence of growth medium composition on biosynthesis of Rhodococcus equi lipase, which was selected as a potential and promising lipase producer. Optimization was carried out in two steps: (1) by using Plackett-Burman design for the primary exclusion of negligible factors, and (2) by using Box-Behnken design to identify the influence of important factors (medium components) and their combinations. The result was an optimized growth medium composition that allowed an increased yield of lipase activity 3,27 times higher as compared to the initial medium
Keywords: Rhodococcus equi, lipase, optimization of culture media, Plackett-Burman plan, Box-Behnken plan
663.15
М.А. Пушкарев1, В.П. Морозкина2, Т.Б. Лисицкая3, Г.В. Козлов4
ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ПРОДУЦЕНТА ЛИПАЗЫ
RHODOCOCCUS EQUI
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр., 26, Санкт-Петербург, 190013, Россия e-mail: [email protected]
Целью работы являлось изучение влияния состава питательной среды на биосинтез липаз культурой Rhodococcus equi, отобранной нами раннее в качестве перспективного продуцента, и его оптимизация.
Оптимизация осуществлялась в два этапа с использованием плана Плакетта-Бермана для первичного отсева несущественных факторов и плана Бокса-Бенкена для выявления степени влияния значимых факторов (компоненты среды) и их сочетаний.
В результате был получен состав среды, позволяющий повысить активность липазы в 3,27 раз по сравнению с исходной средой
Ключевые слова: Rhodococcus equi, липаза, оптимизация питательных сред, план Плакетта-Бермана, план Бокса-Бенкена
Введение
Липазы (триацилглицерид ацилгидролазы, КФ 3.1.1.3) относятся к сериновым гидролазам. В водной среде липазы катализируют гидролиз триацилглицеридов до диглицеридов, моноглицеридов, свободных жирных кислот и глицерина. В отличие от эстераз, липазы активируются только при адсорбции на межфазной вода-масло поверхности, и не гидролизуют растворенный субстрат в гомогенной среде, где нет поверхности раздела [1]. Эсте-разы, напротив, демонстрируют нормальную кинетику Михаэлиса-Ментен в гомогенных растворах [2]. Истинные липазы способны расщеплять эфиры глицерина и длин-ноцепочечных жирных кислот, таких как триолеин и три-пальмитин [3].
Липазы находят широкое применение в пищевой, молочной, масложировой промышленности, при производстве бумаги, как добавка к моющим средствам, в косметической и фармацевтической отраслях [3]. Перспективным направлением использования липаз является органический синтез («Зеленая химия»), в частности, получение биодизельного топлива. Для широкого применения липаз есть ряд предпосылок:
- помимо гидролиза жиров, липазы катализируют широкий ряд реакций - этерификация, трансэтерифика-ция, аминолиз и др.;
- широкий спектр субстратов;
- протекание каталитической реакции в гетеро-
генной среде; для них характерна такая особенность, как межфазная активация;
- устойчивость ко многим органическим растворителям;
- наличие липаз с различной регио- и жирнокис-лотной специфичностью.
Однако при их использовании приходится учитывать некоторые аспекты [4], накладывающие определенные технологические и экономические ограничения на применение биокатализа, что делает актуальным поиск новых продуцентов липаз и совершенствование технологий их производства.
Целью работы являлось изучение влияния состава питательной среды на биосинтез липаз культурой Rhodococcus equi, отобранной нами в ходе скрининга культур [5], хранящихся в коллекции кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета).
Материалы и методы исследования
Оптимизацию состава питательных сред проводили в два этапа: первый этап - отсеивающий эксперимент (план Плакетта-Бермана), второй этап - эксперимент на основе плана поверхности отклика (план Бокса-Бенкена) с помощью пакета прикладных программ <^ТАТ^ТЮА». Уровень доверительной вероятности принимали равным 95 %.
1 Пушкарёв Михаил Алексеевич, ассистент, каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: [email protected] Mikhail A. Pushkarev, assistant, Department of Technology of Microbiological Synthesis
2 Морозкина студ. каф. технологии микробиологического синтеза Morozkina, stud. Department of Technology of Microbiological Synthesis
3 Лисицкая Татьяна Борисовна, канд. техн. наук, зав. каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: [email protected] Tatiana B. Lisitskaya, PhD (Eng.), Head Department of Technology of Microbiological Synthesis
4 Козлов Григорий Владимирович, канд. биол. наук, доцент каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: [email protected] Grigorii V. Kozlov, PhD (Biol.), Associate professor, Department of Technology of Microbiological Synthesis
Дата поступления - 2 декабря 2016 года
В таблице 1 представлена матрица планирования эксперимента по Плакетту-Берману для семи компонентов питательной среды.
В качестве откликов определялась липолитиче-ская активность культуральной жидкости (как объемная, так и удельная).
Таблица 1. Таблица отсеивающего эксперимента (по Плакетту-Берману)
Концентрация компонентов среды, г/л
№ среды Масло подсолнечное Твин-80 Пептон Дрожжевой экстракт 0 0- 1 ^ 0 г 1 г I о' со ст
1 2,50 2,50 1,50 1,50 1,50 1,50 0,25
2 7,50 2,50 1,50 0,50 0,50 1,50 0,75
3 2,50 7,50 1,50 0,50 1,50 0,50 0,75
4 7,50 7,50 1,50 1,50 0,50 0,50 0,25
5 2,50 2,50 4,50 1,50 0,50 0,50 0,75
6 7,50 2,50 4,50 0,50 1,50 0,50 0,25
7 2,50 7,50 4,50 0,50 0,50 1,50 0,25
8 7,50 7,50 4,50 1,50 1,50 1,50 0,75
9 5,00 5,00 3,00 1,00 1,00 1,00 0,50
На втором этапе оптимизации состава питательной среды был проведен эксперимент на основе плана Бокса-Бенкена, в котором варьировались компоненты питательной среды, отобранные на первом этапе как наиболее значимые (таблица 2).
Таблица 2. План эксперимента по Боксу-Бенкену
Концентрация компонентов среды
№ среды Масло, г/л Соотношение твин-80 : масло Пептон, г/л
1 1,0 1,0 0,5
2 1,0 1,0 2,5
3 1,0 3,0 0,5
4 1,0 3,0 2,5
5 4,0 1,0 0,5
6 4,0 1,0 2,5
7 4,0 3,0 0,5
8 4,0 3,0 2,5
9 1,0 2,0 1,5
10 4,0 2,0 1,5
11 2,5 1,0 1,5
12 2,5 3,0 1,5
13 2,5 2,0 0,5
14 2,5 2,0 2,5
15 2,5 2,0 1,5
16 2,5 2,0 1,5
В соответствии с планами (таблицы 1 и 2) готовили жидкие питательные среды. Среды стерилизовали в автоклаве при избыточном давлении 0,7 атм в течение 30 мин.
Для подготовки посевного материала для глубинного процесса культивирования штамм Rhodococcus equi выращивали в пробирках на скошенном агаре аналогичного состава при температуре 28-30 °С. Выращивание проводили до полного зарастания поверхности агара в течение двух суток. Биомассу переносили смывом в колбы Эрленмейера с жидкой питательной средой и культивировали одни сутки при температуре 28-30 °С. Глубинную культуру использовали в качестве посевного инокулюма. На 100 мл питательной среды вносили 5 мл инокулюма.
Глубинное культивирование проводили в колбах Эрленмейера объёмом 0,75 л со 100 мл среды на роторной качалке (230 мин-1) при 28-30 °С.
Клетки бактерий отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при относительном ускорении 4800 д в течение 15 мин. В полученном суперна-танте определяли активность липолитических ферментов и концентрацию белка.
Концентрацию белка в культуральной жидкости определяли модифицированным методом Лоури [6]. Эк-стинкцию раствора измеряли на фотометре КФК-3 при длине волны 750±3 нм. Концентрацию белка в исследуемом растворе определяли по калибровочному графику.
Определение липолитической активности осуществляли по гидролизу п-нитрофенилпальмитата. Суть метода заключается в определении активности липаз, как количестве микромолей п-нитрофенола, отщепившегося в процессе гидролиза п-нитрофенилпальмита-та за 1 мин при 30 °С [7-9]. Оптическую плотность растворов измеряли на фотометре КФК-3 при длине волны 405±3 нм.
Концентрацию вещества в исследуемом растворе определяли по калибровочному графику.
Результаты и обсуждение
Первым этапом оптимизации являлся отсев факторов, влияние которых на результат эксперимента несущественно.
При планировании отсеивающего эксперимента полный или дробный факторный анализ обычно применяется при необходимости проанализировать 2-4 фактора. Если анализируемых факторов больше 5, то используют дробный факторный план эксперимента или план Плакетта-Бермана [10, 11]. Плакетт и Берман показали, что полная факторная модель может быть разбита так, чтобы получить насыщенные планы, в которых число опытов кратно 4, а не степени 2. Такие планы иногда называют планами с матрицей Адамара. Они являются насыщенными, поскольку вся информация в них используется для оценки параметров, не оставляя степеней свободы для оценки эффекта ошибок. Общее число опытов должно быть не меньше числа исследуемых факторов. План Плакетта-Бермана позволяет тестировать наибольшее число главных эффектов при наименьшем числе наблюдений [11, 12]. Эквивалентом для планов 3(к-р) являются так называемые планы Бокса-Бенкена [12, 13]. План Бокса-Бенкена получают соответствующей комбинацией факторного плана 2к со сбалансированным неполноблочным планом [14].
На основе полученных результатов эксперимента по плану Плакетта-Бермана были выявлены наиболее значимые компоненты питательной среды, влияющие на биосинтез липазы культурой Rhodococcus equi. Факторы были ранжированы по оценке эффектов (диаграммы Парето представлены на рисунках 1 и 2), что позволило установить наиболее значимые компоненты питательной среды, влияющие на биосинтез липазы культурой Rhodococcus equi (концентрация пептона, масла и твина-80), а так же исключить те, влияние которых на результат не достоверно при заданном уровне доверительной вероятности.
Рисунок 1. Диаграмма Парето объемной активности культуральной жидкости Rhodococcus equi
Рисунок 2. Диаграмма Парето удельной активности культуральной жидкости Rhodococcus equi Вторым этапом являлось изучение влияния на липазную активность выбранных на первом этапе значимых факторов и их сочетаний. Использовали трехуровневый план Бокса-Бенкена с 16 опытами (таблица 2). Концентрация остальных компонентов оставалась неизменной, (г/л): дрожжевой экстракт - 0,50, КН2РО4 - 1,50, N^N03 - 0,50, MgSO4•7H20 - 0,75. По результатам эксперимента (таблица 3) были построены диаграммы Парето (рисунки 3 и 4), демонстрирующие значимость оценок эффектов трех факторов и их сочетаний.
Таблица 3 Влияние компонентов на активность липаз Rhodococcus equi
№ Масло, г/л Соотношение твин-80 / масло, г/г Пептон, г/л Объемная активность, ед.акт./мл Удельная активность, ед.акт./мг
1 1,0 1,0 0,5 0,29 0,72
2 1,0 1,0 2,5 1,02 1,50
3 1,0 3,0 0,5 0,34 0,77
4 1,0 3,0 2,5 2,04 2,66
5 4,0 1,0 0,5 0,72 1,52
6 4,0 1,0 2,5 0,79 0,97
7 4,0 3,0 0,5 0,12 0,22
8 4,0 3,0 2,5 0,88 0,88
9 1,0 2,0 1,5 1,14 1,98
10 4,0 2,0 1,5 0,39 0,65
11 2,5 1,0 1,5 0,37 0,69
12 2,5 3,0 1,5 0,34 0,59
13 2,5 2,0 0,5 0,13 0,35
14 2,5 2,0 2,5 1,05 1,32
15 2,5 2,0 1,5 0,24 0,43
16 2,5 2,0 1,5 0,15 0,27
(3)Пептон(|_) (1)Масло(Ц 2|_ЬуЗ|_ 1|_ЬуЗ|_ 1|_Ьу2|_ Масло(О) Пептон(О) (2)Твин-80 / Масло(1_) Твин-80 / Масло(О)
3,26 -3,17 ■3,15 3,13
р=,05
Оценка эффекта (абсолютное значение)
Рисунок 3. Диаграмма Парето влияния трех факторов на объемную активность культуральной жидкости Rhodococcus equi
Рисунок 4. Диаграмма Парето влияния трех факторов на удельную активность культуральной жидкости Rhodococcus equi
Из рисунков 3 и 4 следует, что наиболее значимы следующие факторы: концентрация пептона концентрация масла ф) и сочетание факторов - концентрация масла и соотношение Твин-80/масло, концентрация масла и пептона, соотношение Твин-80/масло и концентрация пептона.
Для визуализации математической модели влияния трех компонентов питательной среды на биосинтез липаз были построены поверхности отклика (рисунки 5 и 6). 5а, 6а - влияние концентрации масла и соотношения твин-80/масло, концентрация пептона 2,5 г/л; 5б, 6б - влияние концентрации масла и концентрации пептона, соотношение Твин-80/масло 3/1; 5в, 6в - влияние соотношения твин-80/масло и концентрации пептона, концентрация масла - 1 г/л. Модель показала, что оптимальными значениями факторов являются: концентрация масла - 1 г/л; соотношение Твин-80/масло - 3/1; концентрация пептона - 2,5 г/л. Таким образом, оптимальный состав среды для биосинтеза липазы культурой Rhodococcus equi таков (г/л): Масло - 1; Твин-80 - 3; пептон - 2,5; дрожжевой экстракт - 0,50; КН2РО4 - 1,50; N^N03 -0,50; MgS04•7H20 - 0,75; Вода водопроводная - до 1 л.
Рисунок 5. Зависимость объемной активности культуральной жидкости от концентрации масла, соотношения твин-80/масло и концентрации пептона
Рисунок 6. Зависимость удельной активности культуральной жидкости от концентрации масла, соотношения твин-80/масло и концентрации пептона
При культивировании на данной среде Rhodococcus equiудельная липазная активность в 3,27 раз выше, чем при использовании среды исходного состава.
Выводы
Посредством планов Плакетта-Бермана и Бок-са-Бенкена был оптимизирован состав питательной среды для биосинтеза липазы культурой Rhodococcus equi. При культивировании на данной среде показано превышение удельной активности липазы в 3,27 раз по сравнению с исходной средой.
Литература
1. Martinelle M, Holmquist M., Hult K. On the interfacial activation of Candida antarctica lipase A and B as compared with Humicola lanuginosa lipase // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1995. Т. 1258. №. 3. С. 272-276.
2. Verger R., De Haas G.H. Interfacial enzyme kinetics of lipolysis // Annual review of biophysics and bioengineering. 1976. Т. 5. №. 1. С. 77-117.
3. Sharma R., Chisti Y., Banerjee U.C. Production, purification, characterization, and applications of lipases // Biotechnology advances. 2001. Т. 19. №. 8. С. 627-662.
4. Гарабаджиу А.В., Галынкин В.А., Карасёв М.М., Козлов Г.В., Лисицкая Т.Б. Основные аспекты использования липаз для получения биодизеля (обзор) // Известия СПбГТИ(ТУ). 2010. № 7. С. 63-67.
5. Пушкарев М.А., Лисицкая Т.Б., Галынкин В.А., Гарабаджиу А.В., Козлов Г.В. Скрининг продуцентов липаз// Известия СПбГТИ(ТУ). 2014. № 27 (53). С. 43-46.
6. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. Р. 265-275.
7. Kumar D. [et al.]. Application of a statistically enhanced, novel, organic solvent stable lipase from Bacillus safensis DVL-43 // International Journal of Biological Macromolecules. 2014. V. 66. P. 97-107.
8. Kishan G. [et al.]. Statistical optimization of critical medium components for lipase production from Yarrowia lipolytica (MTCC 35) // Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. 2013. V. 11. P. 111-116.
9. Winkler U.K. [et al.]. Glycogen, hyaluronate, and some other polysaccharides greatly enhance the formation of exolipase by Serratia marcescens // Journal of Bacteriology. 1979. V. 138. P. 663-670.
10. Engineering Statistics Handbook.: http://www. itl.nist.gov/div898/handbook/index.htm. (дата обращения: 23.04.2015).
11. Plackett R.L., Burman J.P. The Design of Optimum Multifactorial Experiments // Biometrika. 1946. Vol. 33. P. 305-325.
12. StatSoft.: http://www.statsoft.ru/home/textbook/ default.htm. (дата обращения: 23.04.2015).
13. BoxG.E.P., Behnken D.W. Some new three level designs for the study of quantitative variables // Technometrics. 1960. Т. 2. №. 4. С. 455-475.
14. Р 50.1.040-2002 Статистические методы. Планирование экспериментов. Термины и определения Введены в действие Постановлением Госстандарта России от 2.10.2002: https://znaytovar.ru/gost/2ZR_5010402002_ Statisticheskie m.html
