CC BY
9УДК 634.8:581.16.04
Батукаев А. А., Шишхаева М. Г., Батукаев М. С. Batukaev A. A., Shishaev M. G., Batukaev M. S.
ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И АДАПТАЦИЯ РАСТЕНИЙ ВИНОГРАДА IN VITRO К УСЛОВИЯМ IN VIVO
OPTIMIZATION OF NUTRIENT MEDIUM COMPOSITION AND ADAPTATION OF GRAPES PLANTS IN VITRO TO CONDITIONS IN VIVO OPTIMIZATION OF NUTRITIONAL MEDIUM COMPOSITION AND ADAPTATION OF VINTAGES IN VITRO TO IN VIVO CONDITIONS
Основная цель исследований заключалась в совершенствовании технологий клонального микроразмножения с использованием регуляторов роста. В эксперимент были включены следующие сорта: Августин, Молдова, Восторг, Мускат итальянский, Ранний Магарача, Подарок Магара-ча, Виорика.
В качестве регуляторов роста в питательную среду добавляли ауксины и цитокинины в различных концентрациях и сочетаниях. Проведенные эксперименты показали, что регенерация побегов из изолированных апексов происходила при всех концентрациях 6-БАП, кроме добавки препарата в количестве 5,0 мг/л, когда верхушки сразу начинали чернеть и гибли.
Эффективное влияние 6-БАП оказал в диапазоне концентрации 0,5-1,0 мг/л. Тем не менее, следует отметить наибольший прирост микропобегов, который был зафиксирован в варианте с концентрацией 1,0 мг/л. Для ускорения процесса удлинения микропобегов параллельно проводили изучение действия гибберелловой кислоты в различных концентрациях в сочетании 6-БАП. Как показал опыт, при сочетании 0,5 мг/л 6-БАП + 1,0 мг/л ГК был достигнут наилучший результат.
Исследования, проведенные применением индо-лил-масляной кислоты (ИМК) на укоренение побегов растений винограда in vitro при повторном черенковании показали, что через 15 дней после применения, наибольшее число корней образовалось в варианте опыта при концентрации ИМК 2,0 мг/л. В дальнейшем корнеобразование продолжалось, и через 30 дней количество корней увеличилось. Параллельно начался интенсивный рост растений, удлинялись черешки листьев, разрасталась листовая пластинка, вытягивался стебель.
Присутствие кинетина в питательной среде в комбинации с 6-БАП положительно влияло на развитие эксплантов. Так, на фоне концентрации 6-БАП 0,5 мг/л присутствие кинетина (0,5 мг/л) обеспечило максимальный коэффициент размножения для испытываемых сортов винограда (Августин, Надежда АЗОС).
The main goal of the research was to improve clone micropropagation technologies with the use of growth regulators. The following varieties were included in the experiment: Augustin, Moldova, Delight, Muscat Italian, Early Magaracha, Gift of Ma-garach, Viorica.
As the growth regulator, auxins and cytokinins were added to the nutrient medium in various concentrations and combinations. The experiments showed that regeneration of shoots from isolated apexes occurred at all concentrations of 6-BAP, in addition to the addition of the preparation in the amount of 5,0 mg/l, when the tips immediately began to stagnate and died.
The effective effect of 6-BAP was in the concentration range of 0,5-1,0 mg/l. Nevertheless, it should be noted the largest increase in micro-races, which was recorded in the version with a concentration of 1,0 mg/l. To accelerate the process of elongation of micro-surges, a parallel study was made of the effect of gibberellic acid in various concentrations in combination with 6-BAP. Experience has shown that when a combination of 0,5 mg/l of 6-BAP + 1,0 mg/L HA was achieved the best result.
Investigations were carried out using indolyl-butyric acid (IMC) on the rooting of shoots of grapes in vitro during repeated cuttings showed that 15 days after application, the greatest number of roots was formed in the experiment variant at an IMC concentration of 2,0 mg/l. Later, the root formation continued, and after 30 days the number of roots increased. In parallel, intensive growth of plants began, lobes of leaves extended, a leaf blade grew, and a stem extended.
The presence of kinetin in nutrient medium in combination with 6-BAP positively influenced on the development of explants. So, against the background of the concentration of 6-BAP 0,5 mg/l, the presence of kinetin (0,5 mg/l) ensured the maximum reproduction rate for the tested grapes (Augustine, Nadezhda AZOS).
Ключевые слова: виноград, сорта, размно- Key words: grapes, varieties, reproduction, nu-
жение, питательная среда, регуляторы роста, trient medium, growth regulators, in vitro, in vivo. in vitro, in vivo.
Батукаев А. А. -
доктор сельскохозяйственных наук, профессор, ФГБОУ ВО «Чеченский государственный университет», г. Грозный E-mail: [email protected]
Шишхаева М. Г. -
сарший научный сотрудник, ФГНУ ФАНО «Чеченский НИИ сельского хозяйства», г. Грозный E-mail: [email protected]
Батукаев М. С. -
старший преподаватель, ФГБОУ ВО «Чеченский государственный университет», г. Грозный
E-mail: [email protected]
Batukaev A. A. -
Doctor of Agricultural Sciences, Professor, FSBEI HE «Chechen State University», Grozny E-mail: [email protected]
Shishhaeva M. G. -
Senior Researcher, FGBNU FANO «Chechen Research Institute of Agriculture», Grozny E-mail: [email protected]
Batukaev M. S. -
Senior Lecturer, FSBEI HE «Chechen State Uni-
versity», Grozny
E-mail: [email protected]
Введение. Виноград - одна из самых распространенных сельскохозяйственных культур, играющая существенную роль в мировой экономике. Увеличение производства винограда требует не только расширения площадей, но и разработки и совершенствования технологий, обеспечивающих ускоренное размножение перспективных сортов.
Современное виноградарство России должно базироваться на производстве сертифицированного посадочного материала. Производство посадочного материала высших категорий в РФ отсутствует [7].
Основная цель исследований заключалась в совершенствовании технологий клонального микроразмножения с использованием регуляторов роста. Задача состоит в получении здорового посадочного материала винограда и введение системы сертификации посадочного материала по образцу европейских стран.
Современная технология производства оздоровленного посадочного материала в качестве составной части включает биотехнологические приемы, комплексное оздоровление с использованием культуры изолированных апексов, ускоренное размножение оздоровленных экземпляров на искусственных питательных средах и создание коллекций оздоровленных форм in vitro [2]. Наиболее иллюстративным примером реализации потенциа-
ла растений (или их отдельных тканей и органов) с помощью биотехнологических приемов может стать клональное микроразмножение, при котором реальные коэффициенты размножения в сотни и даже тысячи раз выше, чем при любом из традиционных приемов
[3].
Объекты и методы исследований. Объектом исследований явились комплексно-устойчивые сорта винограда селекции Всероссийского НИИВиВ имени Я.И. Потапенко, ВННИВиВ «Магарач», молдавской, венгерской селекции и др.
В качестве исходного материала были взяты интенсивно растущие зеленые побеги винограда, которые разрезали на одноглазковые черенки и далее проводили вычленение меристем в ламинарных боксах. В эксперимент были включены следующие сорта: Августин, Молдова, Восторг, Мускат итальянский, Ранний Магарача, Подарок Магарача, Виорика и др.
Одноглазковые черенки перед вычленением меристемы стерилизовали в 2%-м растворе гипохлорита натрия. Простерилизованные органы помещали в стерильную чашку Петри. Перед вычленением с верхушки глазка удаляли покровные чешуи, последовательно обнажая верхушечную меристему с примор-диальными листочками. Эту операцию про-
водили с помощью препаровальной иглы под стереоскопическим микроскопом МБС-10, установленным в пылезащитной камере (ла-минар-боксе). Вычленяли меристемы от 200 до 400 микрон специальной препаровальной иглой и немедленно помещали на поверхность агаризованной среды в чашки Петри, которые, в свою очередь, были размещены в культуральной комнате с соответствующими условиями: освещенность 3-4 тыс. люкс, температура 27-28°С, относительная влажность воздуха 65-70%. При этом использовали модифицированную питательную среду MS (Мурасиге и Скуга) с витаминами: тиамин -1 мг/л, пиридоксин - 1 мг/л, никотиновая кислота - 1 мг/л, мезоинозит - 50 мг/л, источник углерода (сахароза) - 2%, агар - 0,7% и доводили рН до 6,4-6,5.
В качестве регуляторов роста в питательную среду добавляли ауксины и цитокинины в различных концентрациях и сочетаниях. Из группы ауксинов было изучено влияние ин-долил-масляной кислоты (ИМК) и индолил-уксусной кислоты (ИУК), из группы цитоки-нинов: 6-бензиламинопурин (6-БАП), 2-изопентил-аденин ^Р), кинетин, а также гибберелловая кислота (ГК).
Культивирование растительного материала осуществляли на первом этапе в чашках Петри, далее в пробирках размером 40x120 мм, содержащих 20 мл питательной среды. Пересадку эксплантов проводили по мере необходимости, при этом учитывали следующие показатели: приживаемость верхушечных меристем и одноглазковых эсплантов, интенсивность роста эксплантов, формирование и развитие корневой системы.
Результаты исследований. Метод получения свободных от вирусов растений основывается на том, что по направлению к верхушке побега содержание вирусов в больном растении снижается. Апикальная меристема обычно свободна от вирусов. Собственно апикальная меристема, представляет собой конус активно делящихся клеток высотой 0,20,4 мм [1, 3, 6]. Однако собственно меристему бывает трудно вычленить без повреждения, поэтому часто отделяли вместе с ней один-два листовых примордия.
Проведенные наблюдения показали, что на первом этапе выращивания (2 недели) часть меристем (40-60% в зависимости от сорта), начали некротизировать. Оставшиеся мери-
стемы через месяц после посадки развились в микропобеги размерами 2-2,5 мм. Эти микропобеги повторно пересаживали на такую же по составу питательную среду. Пересадку производили в биологические пробирки.
Степень приживаемости апикальных меристем на этапе введения в культуру in vitro у группы столовых сортов (Августин, Восторг, Мускат итальянский, Ранний Магарача) находится в среднем на уровне 50%, а у технических сортов (Подарок Магарача, Виори-ка, Ркацители) - 40-45%. Гибель апикальных меристем в процессе культивирования, по-видимому, наступает за счет повреждения апикальных структур в процессе вычленения.
Прижившиеся апикальные меристемы, через месяц после посадки были пересажены на питательную среду с содержанием тех же компонентов. Пересадку производили в биологические пробирки размером 40x120 мм, в течение 45-55 дней образовались регенеранты размерами 6-10 см. Далее эти микрорастения были расчеренкованы и получены микроклоны.
На этапе пересадки кластер-побегов приживаемость их достаточно высокая, которая колеблется в зависимости от сорта: 75% у сорта Ркацители и более 90% у сорта Молдова и Мускат итальянский. Очень низок процент инфицированных побегов. По-видимому, здесь сыграл фактор стерилизации апикальных меристем при введении в культуру in vitro, а также пересадки растений в стерильных условиях (ламинар-боксах).
В течение 55-60 дней образовались регене-ранты растений размерами 6-10 см. Далее мы приступили к их клональному микроразмножению. Растения-регенеранты разрезали на фрагменты, включавшие узел с листом и почкой (нижняя часть междоузлия длиннее верхней на 1 -2 см). Полученные микрочеренки высаживали в биологические пробирки (40x120 мм) на агаровую среду так, чтобы нижняя часть междоузлия была погружена в агар. Пробирки закрывали фольгой и помещали их в культуральную комнату с соответствующими методике условиями.
Резюмируя полученные результаты, следует отметить, что 40% приживаемости апикальных меристем дает возможность дальнейшего их культивирования и размножения, при котором возможно получение безвирус-
ного посадочного материала. Дальнейшие глазковыми эксплантами, полученными из исследования нами были проведены с одно- изолированных апикальных меристем.
Рисунок 1 - Растения различных сортов винограда в культуре in vitro (A-B), в адаптационных сосуд-пакетах (С), на доращивании до стандартных саженцев в защищенном грунте (D)
Одним из важнейших и неотъемлемых компонентов питательной среды являются регуляторы роста [4, 5]. Их тщательный подбор и выявление оптимальных концентраций позволяют повысить эффективность метода клонального микроразмножения винограда.
Проведенные эксперименты показали, что регенерация побегов из изолированных апексов происходила при всех концентрациях 6-БАП, кроме добавки препарата в количестве 5,0 мг/л, когда верхушки сразу начинали чернеть и гибли. Микропобеги, выращиваемые на среде с концентрацией 0,1 мг/л 6-БАП, развивались очень медленно. Вероятно, это связано с тем, что такие низкие концентрации препа-
рата слабо стимулируют процессы органогенеза растений.
Эффективное влияние 6-БАП оказал в диапазоне концентрации 0,5-1,0 мг/л. Тем не менее, следует отметить наибольший прирост микропобегов, который был зафиксирован в варианте с концентрацией 1,0 мг/л. Минимальная длина микропобега наблюдалась в вариантах с концентрациями 0,1, а при концентрации 5,0 мг/л вообще подавлялось развитие побега. Это свидетельствует о том, что низкая концентрация недостаточна для роста и развития микропобега, а во втором случае, наоборот, - высокая концентрация препарата ингибирует развитие микропобегов (табл. 1).
Таблица 1 - Влияние 6-БАП на развитие одноглазковых черенков винограда in vitro (см)
Сорта Концентрация, мг/л НСР05
0,1 0,5 1,0 2,0 5,0
Августин 4,8 10,2 12,1 8,2 0,0 1,96
Молдова 5,1 11,5 11,9 7,9 0,0 2,06
Восторг 5,0 9,9 10,6 7,2 0,0 1,84
Мускат итальянский 4,8 9,8 12,0 8,1 0,0 2,08
Ранний Магарача 5,1 11,6 11,9 8,4 0,0 1,86
Подарок Магарача 4,4 7,0 9,2 5,0 0,0 1,56
Виорика 4,6 8,2 11,5 5,8 0,0 2,18
Ркацители 4,9 9,1 11,8 6,1 0,0 2,35
Для ускорения процесса удлинения микропобегов параллельно проводили изучение действия гибберелловой кислоты в различных концентрациях в сочетании 6-БАП. Как показал опыт, при сочетании 0,5 мг/л 6-БАП + 1,0 мг/л ГК был достигнут наилучший результат. Такое сочетание препаратов ускоряло вытягивание стеблей у растений, и через две недели размер побегов достигал 25-26 мм. В дру-
гих сочетаниях побеги намного уступали побегам, выращенным на среде с 6-БАП в концентрации 0,1 мг/л. Таким образом, проведенные нами эксперименты показали эффективное действие ГК (1,0 мг/л) и пониженной концентрации 6-БАП (0,5 мг/л) для удлинения побегов перед этапом укоренения.
Важнейшим моментом размножения растений in vitro является этап укоренения побе-
гов. Именно в этот период необходимо обеспечить развитие нормальной корневой системы, после чего растения можно высаживать в почву, либо помещать на длительное хранение при пониженных температурах.
Как известно, для стимуляции корнеобра-зования применяют ауксины. Учитывая это, нами был изучен характер действия регулятора роста ауксиновой природы с целью установления оптимальной концентрации использования препарата.
Спустя месяц число укоренившихся побегов ни при одной концентрации ИМК не увеличилось, продолжался только рост центральных и частично боковых корней.
Следует отметить, что к 30-му дню у многих растений, при концентрации ИМК 5,0 мг/л наблюдалось почернение корней.
В последующем, с целью увеличения коэффициента размножения исследовали два варианта комбинаций регуляторов роста -6-БАП с 2^Р и 6-БАП с кинетином. Контролем служила модифицированная среда Мурасиге-Скуга, дополненная 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л и 1,0 мг/л. На экспериментальные среды высаживали одноглазковые микрочеренки винограда сортов Августин и Надежда АЗОС. Длительность культивирования составляла 4 недели, после чего определяли коэффициент размножения и среднюю длину побегов.
Вначале были испытаны на укоренение побегов in vitro различные концентрации ИМК. Через 15 дней после применения наибольшее число корней образовалось в варианте опыта при концентрации ИМК 2,0 мг/л. В дальнейшем корнеобразование продолжалось, и через 30 дней количество корней увеличилось. Параллельно начался интенсивный рост растений, удлинялись черешки листьев, разрасталась листовая пластинка, вытягивался стебель (табл.2).
Присутствие 2iP в питательной среде оказывало отрицательное действие на образование дополнительных побегов у эксплантов винограда, снижая как коэффициент размножения, так и среднюю длину побегов. Так, при одинаковой концентрации 6-БАП, равной 0,5 мг/л, коэффициент размножения у экс-плантов сорта Августин снизился от 2,5 до 1,9; у эксплантов сорта Надежда АЗОС - от 2,7 до 1,9. Еще в большей степени снижение коэффициента размножения наблюдали в вариантах с использованием комбинации 2^Р с 6-БАП в концентрации 1,0 мг/л.
Присутствие кинетина в питательной среде в комбинации с 6-БАП положительно влияло на развитие эксплантов. Так, на фоне концентрации 6-БАП 0,5 мг/л присутствие кинетина (0,5 мг/л) обеспечило максимальный коэффициент размножения для обоих сортов вино-
Таблица 2 - Влияние ИМК на развитие корней у одноглазковых черенков in vitro (n = 20)
No п/п ИМК, мг/л Через 15 дней Через 30 дней
кол-во корней, длина корней, кол-во корней, длина корней,
шт. мм шт. мм
Сорт Августин
Среда без ИМК (контроль) 1,9 3,8 4,2 10,3
0,5 2,4 7.4 6,3 18,5
1,0 3,2 17,4 8,6 40,8
2,0 3,8 20,3 8,4 39,4
5,0 2,4 12,5 5,8 27,7
НСР05 1,94
Сорт Подарок Магарача
1 Среда без ИМК (контроль) 1,4 3,2 3,1 8,8
2 0,5 1,9 6,3 4,0 14,0
3 1,0 2,3 14,5 5,6 20,4
4 2,0 2,8 18,4 5,8 38,3
5 5,0 1,5 13,5 4,2 23,7
НСР05 1,46
града 2,9 и некотором уменьшении средней длины побегов. В вариантах с концентрацией 6-БАП 1,0 мг/л присутствие кинетина не уменьшало коэффициент размножения побегов сорта Августин, по сравнению с вариантом без кинетина. При культивировании экс-плантов сорта Надежда АЗОС отмечено некоторое уменьшение коэффициента размножения -на 11 % (кинетин 0,25 мг/л) и 20% (кине-тин 0,5 мг/л). Таким образом, для этапа микроразмножения винограда сортов Августин и Надежда АЗОС целесообразно совместное использование 6-БАП и кинетина в концентрации 0,5 мг/л каждого, что обеспечивает максимальный коэффициент размножения.
Область применения: растениеводство, виноградарство.
Выводы. Проведенные исследования показали возможность успешного размножения испытуемых сортов винограда методом культуры изолированных тканей и органов in vitro, что объясняется высокой потенциальной способностью винограда к вегетативному размножению вообще и к микроклональному в частности.
Литература
1. Батукаев А.А. Совершенствование технологии ускоренного размножения и оздоровления посадочного материала винограда методом in vitro. М.: Изд. МСХА. 1988. 221 с.
2. Бургутин А.Б., Бутенко Р.Г., Катаева Н.В., Голодрига П.Я. Быстрое клональное размножение виноградного растения // Сельскохозяйственная биология. 1983. № 7. С. 4850.
3. Высоцкий В.А. Биотехнологические приемы в современном садоводстве // Сборник научных работ ВСТИСиП РАСХН. М., 2011. Т. XXVI. С. 3-10.
4. Garre M., Martin-Tanguy J., Mussillon P. La cultur de meristemes et la multilpication Végetative in Vitro au service de la pepiniere // Bulletin Petits Fruit. 1979. № 14. P. 7-65.
5. Гамбург К.З., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений. Новосибирск: Наука, 1990. 243 с.
6. Дорошенко Н.П. Повышение регенера-ционной способности меристем при получении безвирусного материала винограда // Виноград и вино России. 1997. № 2. С. 6-9.
Приживаемость апикальных меристем, из которых вырастает растение in vitro (1012 см), дает возможность дальнейшего их культивирования и размножения (путем повторного черенкования), при котором возможно получение безвирусного посадочного материала.
Из испытанных регуляторов роста наиболее результативно проходила регенерация побегов при концентрации 6-БАП 0,51,0 мг/л. При массовом размножении побегов оптимальной оказалась концентрация 6-БАП 2 мг/л.
Действие ГК в концентрации 1,0 мг/л в сочетании с 6-БАП 0,5 мг/л, ускоряло вытягивание стеблей у микрорастений in vitro.
Присутствие кинетина в питательной среде в комбинации с 6-БАП положительно влияло на развитие эксплантов. Так, на фоне концентрации 6-БАП 0,5 мг/л присутствие кинетина (0,5 мг/л) обеспечило максимальный коэффициент размножения для испытываемых сортов винограда
References
1. Batukaev A.A. Sovershenstvovanie tekhno-logii uskorennogo razmnozheniya i ozdorovle-niya posadochnogo materiala vinograda meto-dom in vitro. M. Izd. MSKHA. 1988. 221 s.
2. Burgutin A.B., Butenko R.G., Katae-va N.V., Golodriga P.Ya. Bystroe klonal'noe razmnozhenie vinogradnogo rasteniya // Sel'sko-hozyajstvennaya biologiya. 1983. № 7. S. 48-50.
3. Vysockij V.A. Biotekhnologicheskie prie-my v sovremennom sadovodstve // Sbornik nauchnyh rabot VSTISiP RASKHN. M., 2011. T. XXVI. S.3-10.
4. Garre M., Martin-Tanguy J., Mussillon P. La cultur de meristemes et la multilpication Végetative in Vitro au service de la pepiniere // Bulletin Petits Fruit. 1979. № 14. P. 7-65.
5. Gamburg K.Z., Rekoslavskaya N.I., Shve-cov S. G. Auksiny v kul'turah tkanej i kletok ras-tenij. Novosibirsk: Nauka, 1990. 243 s.
6. Doroshenko N.P. Povyshenie regenera-cionnoj sposobnosti meristem pri poluchenii bezvirusnogo materiala vinograda // Vinograd i vino Rossii. 1997. № 2. S. 6-9.
7. Кравченко Л.В., Дорошенко Н.П. Производство сертифицированного посадочного материала винограда через культуру in vitro на иммунных песках опытного поля ВНИИВиВ им. И. Потапенко // Современные достижения биотехнологии в виноградарстве и других отраслях сельского хозяйства. Материалы конференции. Новочеркасск, 2005. С. 3-31.
8. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функции. М.: Наука, 1973. 264 с.
7. Kravchenko L.V., Doroshenko N.P. Proiz-vodstvo sertificirovannogo posadochnogo mate-riala vinograda cherez kul'turu in vitro na im-munnyh peskah opytnogo polya VNIIViV im. I. Potapenko // Sovremennye dostizheniya biotekh-nologii v vinogradarstve i drugih otraslyah sel'-skogo hozyajstva. Materialy konferencii. Novocherkassk, 2005. S. 3-31.
8. Kulaeva O.N. Citokininy, ih struktura i funkcii. M.: Nauka, 1973. 264 s.
