CC BY
19Вестник АПК „ ,
Растениеводство
УДК 634.2:631.53.01:581.143.6
;№ 2(26), 2017
Л. Л. Бунцевич, М. А. Винтер
Buntsevich L. L., Vinter M. A.
ПРОИЗВОДСТВО ИСХОДНОГО ОЗДОРОВЛЕННОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА КОСТОЧКОВЫХ КУЛЬТУР IN VITRO, ОСОБЕННОСТИ ТЕХНОЛОГИИ
PRODUCTION OF THE STONY FRUIT VIRUS FREE INITIAL SEEDLINGS IN VITRO, TECHNOLOGY SPECIAL FEATURES
Проблема обеспечения населения плодами и ягодами в России в настоящее время остается актуальной. Решить её можно либо путём увеличения площадей садов, либо повышением урожайности культур. Как известно, одним из наиболее действенных подходов к увеличению урожайности плодовых и ягодных культур, в т. ч. косточковых, является внедрение в производство оздоровленного посадочного материала. Переход к безвирусному садоводству имеет особенное значение в последнее время, на фоне широкого распространения в насаждениях вирусных инфекций. Современная технология выращивания оздоровленного посадочного материала косточковых культур включает несколько производственных этапов: выделение исходных клонов для оздоровления, тестирование на скрытое заражение современными методами (ИФА, ПЦР, биологическое тестирование), оздоровление с помощью хемо- и термотерапии, адаптация оздоровленных растений, повторное тестирование. Основной способ получения качественного безвирусного посадочного материала плодовых культур -оздоровление меристемным методом. Метод включает в себя операции по стерилизации эксплантов 0,1 %-ном раствором йодида ртути, введению апикальных меристем размером до 0,1 мм в культуру in vitro, доращиванию и первичному размножению микропобегов in vitro на гормональных средах, содержащих БАП и гибберелловую кислоту в концентрациях от 1 до 10 мг/л, ризогенезу с добавлением ИМК, НУК, ИУК и др., адаптации мериклонов к условиям in vivo. Адаптированные оздоровленные микрорастения сортов и подвоев косточковых культур с закрытой корневой системой предназначены для формирования маточника безвирусных исходных растений. Для присвоения категории «Исходные» микрорастения тестируются на вирусоносительство.
Ключевые слова: оздоровленный посадочный материал, культура in vitro, косточковые культуры, вирусы, апикальные меристемы, мультипликация, ризогенез, адаптация, тестирование.
The problem of the populations consumption with fruits and berries in Russia currently remains relevant. It can be solved either by increasing the acreage of orchards or increasing crop yields. As you know, one of the most effective approaches to increase yields of fruit and berry cultures, including stone, is the production of virus-free planting material. Move to the virusfree horticulture has special importance lately, amid widespread distribution in stands of viral infections. Modern technology of cultivation of stone fruit crop planting material includes several production steps: selecting source clones for recovery, testing for latent infection of modern methods (ELISA, PCR, biological testing), the sanitation by the chemo- and thermotherapy, adapting the sanitated plants, repeated testing. Sanitation by the meristem's method - the basic method of obtaining the qualitative virus-free seedlings of fruit cultures. The method includes of the explants sterilization in solution of mercury iodide 0,1%, introduction of apical meristems (size up to 0.1 mm) in culture in vitro, mikroshoots growing and primary multiplication in vitro on hormonal medium that contain BAP and gibberellic acid at concentrations ranging from 1 to 10 mg/l, risogenesis with the addition of the IBA, NAA, IAA, etc., adaptation to the conditions meriklons in vivo. The adapted virus free micro-plants of varieties and stock of stone fruits are intended for the formation of the virus-free initial plants nursery. For the awarding to category «initial» micro-plants will be tested to viruses.
Key words: virus free seedlings, culture in vitro, stone fruit crops, viruses, apical meristem, multiplication, risogenesis, adaptation, testing.
Бунцевич Леонид Леонтьевич -
кандидат биологических наук, заведующий
лабораторией вирусологии
ФГБНУ «Северо-Кавказский зональный
научно-исследовательский институт садоводства
и виноградарства»
г. Краснодар
E-mail: [email protected]
Винтер Марина Александровна -
младший научный сотрудник лаборатории вирусологии
ФГБНУ «Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства» г. Краснодар
E-mail: [email protected]
Buntsevich Leonid Leontievich -
Ph.D of Biological Sciences,
Head of the Laboratory of Virology
FSBSI «North-Caucasus Regional Research Institute
of Horticulture and Viticulture»
Krasnodar
E-mail: [email protected]
Vinter Marina Alexandrovna -
Junior researcher Laboratory of virology
FSBSI «North-Caucasus Regional Research Institute
of Horticulture and Viticulture»
Krasnodar
E-mail: [email protected]
Ежеквартальный
научно-практический
журнал
Увеличение производства плодов и ягод в России всегда было на повестке дня по причине низкой обеспеченности населения витаминной плодоовощной продукцией. Данная проблема в настоящее время остается актуальной в связи с продовольственной безопасностью страны в условиях санкций Запада и ответных мер правительства РФ. Решить её можно либо путём увеличения площадей садов, либо повышением урожайности культур.
Известно, что одним из наиболее действенных подходов к увеличению урожайности плодовых и ягодных культур, в т.ч. косточковых, является внедрение в производство оздоровленного посадочного материала [1-3]. Особенное значение переход к безвирусному садоводству имеет в последнее время, когда наблюдается беспрецедентное распространение в насаждениях вирусных инфекций [4-6].
Современная технология выращивания оздоровленного посадочного материала косточковых культур включает несколько производственных этапов. Основные из них: выделение клонов для оздоровления, тестирование на скрытое заражение, оздоровление выделенных клонов, культивирование оздоровленных клонов в нестерильных условиях [7-10]. Их содержание изложено в настоящей статье. Предназначена описываемая технология для питомниководства Северного Кавказа.
1. Основные этапы производства оздоровленного посадочного материала косточковых культур
1.1 Выделение клонов для оздоровления
В промышленных насаждениях, а также на участках отбора новых сортов и селекционных форм сортов и подвоев косточковых культур выявляют и отмечают растения с высоким и качественным урожаем, без симптомов вирусных, фитоплазменных и других опасных заболеваний. Для оздоровления выбираются растения, полностью отвечающие сортовым стандартам. Обследования проводятся в фенофазах полного развития листьев и съёмной зрелости плодов.
1.2 Тестирование на скрытое заражение
Сортообразцы, выделенные для последующего оздоровления, тестируют на скрытое заражение вирусными, вироидными или фи-топлазменными заболеваниями методами им-муноферментного анализа (ИФА), ПЦР, им-муноэлектронной микроскопии, с помощью биологического тестирования на древесных индикаторах.
1.3 Разработка схемы дальнейшей работы с выделенными клонами
Сортообразцы косточковых культур, свободные от искомых вирусных, фитоплазмен-ных и вироидных болезней, переводятся в категорию «Исходные» и далее размножаются как исходные. Сорта и подвои, у которых в процес-
се тестирования нельзя найти здоровые клоны, лечатся с помощью культуры изолированных меристем либо другими способами (термо- и хемотерапия, их сочетание с методом меристем).
2. Оздоровление выделенных клонов косточковых культур «in vitro»
Процесс оздоровления с использованием культуры изолированных меристем комплексный, то есть с определенной вероятностью позволяет освободиться как от вирусной инфекции, так и от некоторых грибных и бактериальных заболеваний.
2.1 Первый этап - стерилизация экс-плантов
Перед вводом в культуру in vitro экспланты оздоравливаемых клонов стерилизуются: экс-планты срезают, промывают в мыльной воде или растворах детергентов (5-10 мин), затем в водопроводной воде два часа и подвергают обработке в стерилизующем растворе (водный раствор иодида ртути в концентрации 0,1 %).
2.2 Ввод апикальных меристем в культуру in vitro
Вычленение меристемы проводят под бинокулярной лупой или микроскопом с малым увеличением в ламинар-боксе. Глазным скальпелем вырезают апикальную меристему размером до 0,1 мм. Изолированную ткань быстро переносят на поверхность питательной среды. Через 20-30 дней из меристем вырастают побеги. Экспланты культивируются на питательной среде при 16-часовом фотопериоде, освещенности 1-3 тыс. лк и температуре 23-25 0С.
2.3 Доращивание и первичное размножение микропобегов
Проводится в стеклянных колбах с плоским дном объёмом 200 мл. Для размножения (мультипликации) мериклонов косточковых культур in vitro применяются модификации питательных сред, отличающиеся полным составом макро- и микросолей и повышенным содержанием 6-БАП (можно использовать иные соединения группы цитокининов, например 6-фурфуриламинопурин (кинетин). В некоторых из состава исключена ИМК, заменённая на a-НУК. Для индуцирования роста микропобегов in vitro рекомендуется гибберелловая кислота в концентрации 1-10 мг/л, ИМК 0,2 мг/л, полный минеральный состав.
2.4 Ризогенез
Для укоренения регенерированных микропобегов косточковых культур используют индолил-масляную кислоту (Имк) и нафтилуксусную кислоту (НУК). Индолил-3-уксусная кислота (ИУК) менее активна. Эффективными ауксинами являются 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), 4-хлорфеноксиуксусная кислота (ХФУ) и 4-амино-3,5,6-трихлорпиколиновая кислота (пиклорам или ТХП). Концентрация препаратов подбирается индивидуально и варьирует от 1 до 10 мг/л.
в
! № 2(26), 2017
Растениеводство
179
2.5 Адаптация микрорастений
Адаптацию следует начинать с момента, когда растения достигнут размера не менее 3-4 см, а их корневая система будет состоять из нескольких хорошо развитых корешков, длиной не менее 1-3 см. Перед высадкой в стерильный субстрат микрорастения закаливаются путём приоткрывания крышечек на сосудах на время от нескольких секунд вначале до 5-10 минут впоследствии.
3. Перевод оздоровленных мериклонов косточковых культур в нестерильные условия
3.1 Подготовка контейнеров с субстратом для высадки оздоровленных мериклонов косточковых культур
К моменту переноса оздоровленных мериклонов из культуры in vitro в условия in vivo готовятся контейнеры с субстратом. Для адаптации наиболее пригодны контейнеры цилиндрической формы объёмом 95 мл, разработанные и производимые фирмой SEOWON. В качестве субстрата используется измельчённый верховой торф, заправленный удобрениями. Перед высадкой растений субстраты стерилизуются озонированием.
3.2 Состав минеральных удобрений на 1м3 субстрата
Компонент Единица измерения Количество
Аммиачная селитра кг 1,5
Суперфосфат кг 2,0
Сернокислый калий кг 0,86
Сернокислое железо г 60
Борная кислота г 15
Сернокислая медь г 20
Сернокислый марганец г 6
Сернокислый цинк г 2
Молибденовокислый аммоний г 4
3.3 Посадка мериклонов в контейнеры
В контейнеры с субстратом высаживаются неадаптированные мериклоны, прошедшие процедуру закалки in vitro. При посадке корешки отмывают в стерильной воде от остатков пита-
тельной среды, помещают в лунку в субстрате, расправляют вниз, засыпают субстратом строго на уровне условной корневой шейки. После посадки мериклоны поливают.
3.4 Адаптация мериклонов
Для последующей адаптации мериклоны в контейнерах размещаются под туманообразу-ющие устройства в изолированных помещениях (боксах) либо в климатокамеры с регулируемой влажностью. Режим подачи тумана (создания уровня влажности 100 %) полностью определяется состоянием адаптантов - при первых признаках потери тургора листьями адаптантов влажность доводится до 100 %, при восстановлении тургора влажность понижают до 50-60 %. Прекращение потери тургора листьев при влажности 60 % свидетельствует о завершении периода адаптации и готовности мериклонов к переносу на постоянное место в фитотрон. Всего период адаптации не должен превышать 30 суток, из них 7 суток при влажности 50-60 % (ГОСТ Р 54051-2010).
4. Основные параметры адаптированных микрорастений сортов и подвоев косточковых культур с закрытой корневой системой
Адаптированные микрорастения сортов и подвоев косточковых культур, полученные in vitro, должны быть с пятью хорошо развитыми листьями и высотой побегов 5 см (ГОСТ Р 540512010). Субстрат готовится на основе верхового торфа с низкой степенью разложения, заправлен удобрениями, которые обеспечивают потребность растения в макро-микроэлементах. Объём контейнеров в кассете - 95 мл.
5. Назначение адаптированных микрорастений сортов и подвоев косточковых культур
Адаптированные оздоровленные микрорастения сортов и подвоев косточковых культур с закрытой корневой системой предназначены для формирования маточника безвирусных исходных растений. Для присвоения категории «Исходные» микрорастения доращиваются в фитотроне и тестируется на вирусоноситель-ство в установленном порядке органами Рос-сельхозцентра или Россельхознадзора.
Литература
1. Коваленко Н. Н., Медведева Н. И. Совершенствование этапов клонального микроразмножения сливы домашней // Современное садоводство [Электронный ресурс]. 2015. № 2. С. 99-104. URL: http://journal.vniispk.ru/ (дата обращения: 07.11.2016).
2. Особенности введения в культуру in vitro плодовых и ягодных растений / С. А. Муратова, М. Б. Янковская, Д. Г. Шорников [и др.] // Плодоводство : науч. тр. Само-хваловичи, 2005. Т. 17, ч. 2. С. 182-184.
References
1. KovalenkoN. N., MedvedevaN.I.Improvement phases of clonal micropropagation of Prunus domestica // Contemporary horticulture [electronic resource]. 2015. № 2. P. 99104. Available at: http://journal.vniispk.ru / (date of access: 07.11.2016).
2. Features the introduction of in vitro culture of fruit and berriesdried plant / S. A. Muratova, M. B. Yankovskaja, D. G. Shornikov [et al.] // Horticulture: scientific papers. Samokhvalovichi, 2005. Vol. 17, p. 2. P. 182184.
Ежеквартальный
научно-практический
журнал
3. Бунцевич Л. Л., Тыщенко Е. Л., Сергеева Н. Н. О программе развития питомни-ководства юга России [Электронный ресурс] // Плодоводство и виноградарство Юга России. 2013. № 23 (5). С. 33-49. URL: http://journal.kubansad.ru/pdf/13/05/ 04.pdf (дата обращения: 16.02.2017).
4. Распространенность вирусных болезней косточковых культур в Европейской части России / Ю. Н. Приходько, С. Н. Чирков, К. В. Метлицкая, Л. В. Цубера // Сельскохозяйственная биология. 2008. № 1. С. 26-32.
5. Распространенность вредоносных вирусов в насаждениях косточковых культур в Подмосковье / М. Т. Упадышев, К. В. Метлицкая, А. Д. Петрова [и др.] // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. 2016. № 17. С. 467-477.
6. Митрофанова О. В., Митрофанова И. В. Биотехнология освобождения от вирусов и клональное микроразмножение декоративных и плодовых растений // Сб. тр. Никитского ботанического сада. 2012. Т. 134. С. 213-227.
7. Матушкина О. В., Пронина И. П. Кло-нальное микроразмножение плодовых и ягодных культур и перспективы его // Основные итоги и перспективы научных исследований ВНИИС им. И. В. Мичурина (1931-2001 гг.) : сб. науч. тр. Тамбов, 2001. С.103-105.
8. Верзилин А. В., Минаев В. А., Тарасов А. М. Оздоровление и клональное микроразмножение слаборослых подвоев яблони : мо-ногр. Мичуринск : МГПИ, 2007. 146 с.
9. Кухарчик Н. В. Научные и практические основы оздоровления от вирусов и размножения плодовых и ягодных культур in vitro : автореф. дис. ... д-ра с.-х. наук : 06.01.05. Жодино, 2006. 40 с.
10. Trigiano Robert N., Gray Dennis J. Plant Tissue Culture, Development and Biotechnology. Boca Raton : CRC Press, 2010. 186 p.
3. Buncevich L. L., Tyshhenko E. L., Sergeeva N. N. About the program of development of nursery in southern Russia [electronic resource] // Fruit growing and viticulture in southern Russia. 2013. № 23 (5). P. 33-49. Available at: http://journal. kubansad.ru/pdf/13/05/04.pdf (date of access: 16.02.2017).
4. Incidence of virus diseases of stone fruit crops in the European part of Russia / Yu. N. Prihod'ko, S. N. Chirkov, K. V. Metlickaja, L. V. Tsubera // Agricultural biology. 2008. № 1. P. 26-32.
5. Prevalence of malicious viruses in stands of stone fruit crops in the Moskow region / M. T. Upadyshev, K. V. Metlickaya, A. D. Petrova [et al.] // Theory and practice to combat parasitic diseases. 2016. № 17. P. 467-477.
6. Mitrofanova O. V., Mitrofanova I. V. Biotechnology exemption from viruses and micropropagation of ornamental and fruit plants // Coll. papers Nikitsky Botanical garden. 2012. V. 134. P. 213-227.
7. Matushkina O. V., Pronina I. P. Micropropagation of fruit and Berry cultures and perspectives of its use // Main results and research prospects of VNIIS named after I. V. Michurin (1931-2001) : Coll. of scientific papers. Tambov, 2001. P. 103105.
8. Verzilin A.V., Minayev A. V., Tarasov A. M. Micropropagation of Apple dwarf rootstocks : monograph. Mitchurinsk : MGPI, 2007. 146 p.
9. Kukharchyk N. V. Scientifi c and practical basis of recovery from virus and breeding of fruit and Berry cultures in vitro : auth. ... doctor of agricultural Sciences : 06.01.05. Zhodino, 2006. 40 p.
10. Trigiano Robert N., Gray Dennis J. Plant Tissue Culture, Development and Biotechnology. Boca Raton : CRC Press, 2010. 186 p.
