Определение тропикамида в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором Текст научной статьи по специальности «Прочие медицинские науки»

© А.В. Лаврентьева, Г.А. Банникова, А.Б. Мелентьев, 2011 УДК 340.67:615.225.2.099.074:543.544

А.В. Лаврентьева, Г.А. Банникова, А.Б. Мелентьев ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРОПИКАМИДА В КРОВИ МЕТОДОМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СЕЛЕКТИВНЫМ ДЕТЕКТОРОМ

МГЛПУЗ «Челябинская областная клиническая больница» (гл. врач. - к.м.н. М.В. Бавыкин);

ОГУЗ «Челябинское областное бюро судебно-медицинской экспертизы» (нач. бюро - к.м.н. Е.Ф. Швед) Описана аналитическая процедура определения тропикамида в крови с использованием газовой хроматографии с масс селективным детектором, предназначенная для токсикологических анализов. Пробоподготовка включает твердофазную экстракцию, получение триметилсилильных производных, и хроматографический анализ образцов. Предел обнаружения в гемолизированной крови равен 0,05 мкг/мл. Диапазон количественного определения от 0,05 до 2 мкг/мл. Относительная среднеквадратичная ошибка не превышают 12 % для концентраций 0,1 и 1,0 мкг/мл. Методика применяется для судебно-химических и токсикологических анализов.

Кттчевью слова: тропикамид, токсикологический анализ, газовая хроматография — масс спектрометрия.

DETERMINATION OF TROPICAMIDE IN BLOOD BY GAS CHROMATOGRAPHY - MASS SPECTROMETRY

A.V. Lavrentyeva, G.A. Bannikova, A.B. Melentyev Analytical procedure of determination of tropicamide in blood by a gas chromatography with MS, used for toxicological analyses is described. Procedure includes solid phase extraction, formation of trimethylsilyl derivatives, and chromatography analysis of samples. The detection limit in postmortem blood was 0,05 mkg / ml. A range of quantitative determination from 0,05 up to 2 mkg / ml. The intra-day coefficient of variation was < 12 % for concentration of 0,1 and 1,0 mkg / ml. The technique is applied to forensic and toxicological analyses.

Key words: tropicamide, the toxicological analysis, a GC - MS.

Тропикамид - М-этил-альфа-(гидроксиметил)-М-(4-пиридинилметил) бензолацетамид (торговые названия

- мидриацил, мидрум, тропикамид) относится к группе м-холиноблокаторов и предназначен для диагностических целей в офтальмологии, так как блокирует м-холинорецеп-торы сфинктера радужки и цилиарной мышцы. Расширяет зрачок и парализует аккомодацию [1]. По сравнению с атропином мидриатическое действие препарата и вызываемый им паралич аккомодации существенно короче. Обладает меньшим действием на внутриглазное давление, но его повышение во время применения возможно [2]. При местном применении передозировка маловероятна. Препарат не предназначен для внутреннего употребления, поэтому в литературе отсутствуют данные о его терапевтических и токсических концентрациях в крови. Однако, в последнее время этот препарат получил широкое распространение среди наркозависимых, которые принимают его обычно совместно с опиатами или психостимуляторами. Из-за широкого распространения мы включили этот препарат в скрининг крови и мочи на наркотические вещества. В нашей практике встречались случаи отравления тропикамидом, поэтому возникла необходимость разработки методики его определения в крови.

Целью данной работы явилась разработка методики количественного определения тропикамида в плазме и цельной крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором, предназначенной для токсикологического, терапевтического мониторинга и судебно-химического исследования.

Материалы и методы исследования.

Оборудование. Газовый хроматограф с масс селективным детектором PQ 5050 фирмы «Shimadzu» с капиллярной колонкой EVDX-5MS длиной 25 м с внутренним диаметром 0,2 мм и толщиной пленки 0,33 мкм, термошкаф с температурой до 100°С, аппарат для встряхивания АВУ-6с, центрифуга ОПн-8, иономер И-130, компрессор воздушный КВ-1, весы аналитические ВЛР-200, бытовой холодильник с морозильным отделением, микрошприц на 10 мкл, набор пипеток - дозаторов.

Материалы и реактивы. В работе использовали патроны для твердофазной экстракции «Oasis» 30 мг, пробирки полипропиленовые “Эппендорф” на 1,5 мл с крышкой. В качестве исходного раствора анализируемого вещества

применяли 1% раствор тропикамида - глазные капли «К.О. Ромфарм Компани С.Р.Л.» Румыния. Для приготовления раствора внутреннего стандарта использовали порошок хинидина сульфат фирмы ICN Biomedicals. А также применяли следующие растворители: этанол 95% р ЛС 002430, дистиллированная вода, N,O-Bis(trimethylsilyl) acetamide (BSA) фирмы “Aldrich”, натрия дигидрофосфат чда.

Стандартный раствор внутреннего стандарта (хинидина) с концентрацией 1 мг/мл готовился растворением 10 мг хинидина сульфата в 7,3 мл этанола. Рабочий раствор, содержащий 0,1 мг/мл хинидина, готовился добавлением в виалу 100 мкл стандартного растворов с концентрацией 1 мг/мл и 900 мкл этанола. Рабочий раствор готовился перед каждой партией анализов заново из стандартного раствора, который хранится в бытовом холодильнике в герметичной таре до 1 года.

В качестве стандартного раствора анализируемого соединения использовался лекарственный препарат с концентрацией тропикамида 10 мг/мл (1% раствор). Рабочий раствор с концентрацией 0,1 мг/мл готовился добавлением 50 мкл стандартного раствора к 4,95 мл этанола. Рабочий раствор, содержащий 0,01 мг/мл тропикамида, готовился добавлением в виалу 100 мкл раствора с концентрацией тропикамида 0,1 мг/мл и 900 мкл этанола. Рабочий раствор, содержащий 0,001 мг/мл тропикамида, готовился из рабочего раствора с концентрацией 0,01 мг/мл, аналогично описанной выше процедуре. При приготовлении растворов для построения градуировочной кривой использовалась схема, приведённая в табл. 1.

Таблица 1

Схема приготовления калибраторов

Название пробы Концентрация тропикамида в крови, мкг/мл Концентрация рабочего раствора, мг/мл Объём рабочего раствора на 1 мл крови, мкл

Бланк 0 - -

Точка 1 0,05 0,001 50

Точка 2 0,10 0,01 10

Точка 3 0,50 0,01 50

Точка 4 1,00 0,01 10

Точка 5 2,00 0,01 20

Таблица 2 Таблица 3

Оценка прецизионности методики по результатам анализа Изменение ионных отношений в зависимости от

контрольных проб с добавками тропикамида (р=0,95, п=6) концентрации тропикамида в крови

Показатель Серия 1 Серия 2

Концентрация тропикамида в крови, мкг/мл 0,10 1,00 0,10 1,00

Стандартное отклонение повторяемости (аг) 0,01 0,11 0,01 0,04

Относительное стандартное отклонение (8), % 9,80 11,3 10,3 4,4

Конц., мкг/мл 0,05 0,1 0,5 1 2

Отношение 237/266 (относительное отклонение, %) 0,56 (13,4) 0,49 (0,4) 0,49 (1,1) 0,43 (12,7) 0,49 (0,4)

Отношение 341/266 (относительное отклонение, %) 0,72 (9,2) 0,63 (3,8) 0,64 (2,8) 0,66 (0,3) 0,64 (2,6)

К 1 мл «холостой» крови добавлялось соответствующее количество одного из рабочих растворов, после чего калибровочные пробы проходили все процедуры пробо-подготовки и анализа. По результатам анализов калибраторов строилась градуировочная кривая. Для исследования и отработки методики использовалась трупная кровь, проверенная на отсутствие тропикамида. До анализа образцы холостой и анализируемой крови хранились в морозильной камере при температуре -12°С. Подготовка крови проводилась по следующей методике: к 1 мл крови добавлялось 2 мл 1Н раствора дигидрофосфата натрия (рН=4,3), 10 мкл раствора хинидина в этаноле (внутренний стандарт) с концентрацией 0,1 мг/мл, затем проба центрифугировалась 10 мин при 3000 об/мин. Надосадочный слой пропускался через предварительно кондиционированный (1 мл этанола + 2 мл воды) патрон «Oasis» 30 мг. Патрон промывался 1 мл воды и сушился под вакуумом 30 мин. Анализируемые соединения элюировались 1,5 мл этанола в полипропиленовую пробирку и спиртовый экстракт испарялся в потоке воздуха досуха. К сухому остатку добавлялось 70 мкл BSA и смесь нагревалась в плотно закрытой пробирке 20 мин при 70°С.

Хроматографический анализ проводился на газовом хроматографе PQ 5050 с ГХ колонкой EVDX-5MS длиной 25 м с внутренним диаметром 0,2 мм и толщиной пленки

0,33 мкм. Параметры, при которых производилась оценка метрологических характеристик: начальная температура колонки - 80°С, выдержка 1,0 мин, увеличение температуры со скоростью 40°С/мин до 200°С и дальнейший подъем температуры со скоростью 12,5 град/мин до 300°С, с выдержкой при конечной температуре - 7 мин. Режим имитации постоянного потока 1,1 мл/мин. Газ-носитель гелий. Начальное давление на колонке 146,8 кПа поддерживалось в течение 1 мин, увеличивалось со скоростью 23 кПа/мин до 215,5 кПа и далее увеличивалось до 275 кПа со скоростью 8 кПа/мин с выдержкой при конечном давлении 6,5 мин. Температура инжектора 250°С, устройства сопряжения с детектором 280°С, энергия ионизации 70 эВ. Напряжение на электронном умножителе на 0,4 vV выше «Autotune». Интервал съемки масс 0,2 сек. Ввод пробы ручной без разделения потока со сбросом избытка пробы через 1 мин (1/10). При указанных выше условиях 1 мкл реакционной смеси в де-риватизирующем агенте анализировался в режиме SIM от 10,5 до 12,45 мин по ионам 266, 341, 234 (тропикамида ТМС эфир) и от 12,50 до 15 мин по ионам 261,136,396 (хинидина ТМС эфир). Первыми в списке ионов приведены ионы, по пикам которых проводился расчет концентрации. Правильность и воспроизводимость методики определяли по результатам двух серий проб крови, по 6 образцов каждая, содержащих по 0,1 и 1 мкг/мл тропикамида.

Результаты и их обсуждение.

В качестве внутреннего стандарта для анализа тропикамида был выбран хинидин, близкие физико-химические свойства и наличие гидроксильных групп в алкильной части молекул тропикамида и хинидина обеспечивают их

одинаковое поведение при твердофазной экстракции и получении производных. Получение ТМС производных анализируемого вещества и внутреннего стандарта при дериватизации позволяет увеличить летучесть этих соединений и избежать их термической деструкции, за счет чего достигается низкий предел обнаружения тропикамида и улучшается воспроизводимость анализа. Хроматограмма по полному ионному току образца крови с концентрацией тропикамида 1 мкг/мл приведёна на рис. 1.

Рис. 1. Хроматограмма по полному ионному току образца крови с концентрацией тропикамида 1,0 мкг/мл,

11,03 мин - пик ТМС эфира тропикамида;

12,88 мин - пик ТМС эфира хинидина

Методика обеспечивает предел количественного обнаружения тропикамида в крови 0,05 мкг/мл, линейность 0,05-2,0 мкг/мл. Концентрации тропикамида менее 0,05 мкг/мл, определенные в ходе анализа (при условии удовлетворительной идентификации), интерпретируются как “следовое количество”. В диапазоне концентраций 0,05-2,0 мкг/мл отклонение отношений подтверждающих ионов к целевому не превышают 15% (табл.2). В табл. 3 приведены результаты контрольных анализов при проверке воспроизводимости методики. Градуировочная кривая при проведении контрольных анализов описывалась уравнением: Y=1,517xX+0,018, R=0,998, где Y - концентрация тропикамида в крови (мкг/мл), X - отношение площадей целевых пиков тропикамида и внутреннего стандарта, И

- коэффициент корреляции.

Проверка стабильности дериватов во времени показала их устойчивость в течение суток после приготовления. Проверка стабильности рабочих растворов внутреннего стандарта и калибраторов показала, что после 7 дней хранения рабочих растворов в холодильнике результаты анализов с их использованием выходят за рамки двух стандартных отклонений и потому растворы непригодны для использования.

С помощью данной методики нами проводятся анализы крови и плазмы на тропикамид при комбинированных отравлениях с участием тропикамида и при отравлениях индивидуальным препаратом для последующего определения концентраций в крови, вызывающих интоксикацию.

Выводы

1. Разработана методика количественного определения тропикамида в плазме и трупной крови методом

4. Методика применяется в настоящее время для судебно-химических исследований в Челябинском областном бюро судебно-медицинской экспертизы, а также для токсикологических анализов в Челябинском областном токсикологическом центре.

газовой хроматографии с масс-селективным детектором и определены ее метрологические характеристики.

2. Методика включает твердофазную экстракцию на картриджах «Oasis» 3Q mg и получение триметилсилильных эфиров тропикамида и внутреннего стандарта.

3. Показаны временные рамки использования для анализов рабочих растворов и дериватов.

Литература:

1. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник. - М.: АстраФармСервис, 2009. - 1760 с.

2. Регистр лекарственных средств России РЛС Энциклопедия лекарств. - 15-й вып. /Гл. ред. ГЛ. Вышковский. - М.: «РЛС-2007», 2006. -1488 с.

© М.А. Полякова, 2011 УДК 340.6

М.А. Полякова

ОСОБЕННОСТИ ИССЛЕДОВАНИЯ СЛЕДОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ВОЗНИКАЮЩИХ В ПРОЦЕССЕ ПРЕСТУПНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, СВЯЗАННОЙ С ТОРГОВЛЕЙ ЛЮДЬМИ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАБСКОГО ТРУДА

Кафедра криминалистики (нач. кафедры - к.ю.н. С.Ю. Журавлев)

ФГОУ ВПО «Нижегородская академия МВД России»

Статья посвящена особенностям исследования следов биологического происхождения, возникающих в процессе преступной деятельности, связанной с торговлей людьми и использованием рабского труда. Знание и умелое использование закономерностей образования следов, возможностей судебно-медицинской экспертизы биологических объектов, правильная постановка вопросов - важнейшие условия эффективности расследования преступлений данных категорий.

Ключевье слова: следы биологического происхождения, торговля людьми.

PECULARIS OF THE STUDY OF TRACES OF BIOLOGICAL ORIGIN APPEARING IN THE COURSE OF CRIMINAL ACTIVITIES RELATED TO MAN TRAFFICKING AND THE USE OF SLAVE LABO

M.A. Polyakova

This article deals with the peculiarities of the study of traces of biological origin appearing in the course of criminal activities related to man trafficking and the use of slave labor. The knowledge and skillful use of regularities of the formation of traces end of the possibilities of forensic - medical examination of biological objects, the correct formulation of the issues are the most important conditions for effective investigation of crimes of these categories.

Key words: traces of biological origin, man trafficking.

Преступление как любое явление действительности отражается в окружающей среде, и доказательственная информация есть результат такого акта отражения. Непосредственно отражаемыми объектами становятся субъект и объективная сторона преступления, что субъект преступления как личность отражается через свои свойства (как проявление личности) и через средства и способы действий, действия (или бездействие) - через средства и способы их осуществления. В качестве отражающих объектов выступают окружающая обстановка и предмет посягательства. На основании изменений подобных объектов (представляющих собой «отпечатки» свойств личности, результаты действий, т. е. являющихся информацией о преступлении) устанавливаются объекты, относящиеся к событию [1].

Следы преступления - это широкое понятие, включающее «и следы преступника, и следы потерпевшего, и следы, которые остались на преступнике, потерпевшем и материальной обстановке в результате взаимодействия всех этих объектов». В результате преступных действий в окружающей обстановке происходят разнообразные изменения, образующие информацию, которая может быть использована для установления объектов и следов, связанных с расследуемым событием [6].

Поскольку среда, в которой преступление вызывает изменение, это не нечто монолитное, не один объект, а комплекс объектов, процессов, явлений, постольку и

отражение преступления, его «отпечаток» содержится не на одном отражающем объекте, а на их комплексе. Таким образом, информация о событии распределена по всем объектам отражающего комплекса. Каждое из доказательств содержит только порцию этой информации. Объем доказательственной информации, содержащейся в конкретном доказательстве, зависит от того, насколько значительны те изменения среды, которые она выражает. Эти изменения зависят от взаимосвязи отражаемого и отражающего объектов. В качестве таковых выступают, с одной стороны, люди, как источники биологических объектов, а с другой - сами объекты, поверхности, на которых они находятся. Как бы тщательно ни готовилось преступление, как бы ни старался преступник уничтожить и скрыть следы своего пребывания (присутствия) на месте преступления, они всегда остаются [2].

Типовые действия, которые преступники, как правило, совершают в процессе преступной деятельности, связанной с торговлей людьми и использованием рабского труда, неизбежно ведут к возникновению определенных следов. Их перечень может быть типизирован и учитываться в процессе поисковой практической деятельности. При этом отсутствие определенных следов биологического происхождения может свидетельствовать о том, что предприняты действия по их уничтожению, следы которых также могут быть обнаружены в процессе более