CC BY
72
железистых ячеек почти полностью дегранулированы, представляют собой переходные к главным клеточные формы с убывающим объёмом цитоплазмы.
Величина ацидофилов варьирует в пределах 15-18 мк (группы сравнения 13-16 мк), они имеют округлую или овальную форму (более правильную чем базофилы). Ядро в ацидофилах лежит преимущественно в центральных участках клеток, укрупнённое, гиперхромное, цитоплазма хорошо окрашена. У базофилов она окрашивается менее интенсивно и выглядит расплывчатой, что свойственно процессам выделения продуктов секреции. Выявленные изменения свидетельствуют об активной функции хромофилов, из которых базофилы находятся преимущественно в фазе выделения секрета. Специфические гранулы ацидофилов округлой формы, визуально крупнее чем в базофилах.
К стенкам синусоида и околососудистым зонам количественно прилегает больше базофилов чем ацидофилов. Очевидно, что за счет увеличения контакта крови с базо-филами решается задача выделения в кровеносное русло большего количества их секрета.
Данные гистохимического анализа показывают, что аденоциты периферии трабекул (часть хромофилов) дают положительную Шик-реакцию, по методу Браше в цитоплазме выявляются немногочисленные гранулы РНК розовато-коричневого цвета. Характерно, что на гистохимические реакции реагировали клетки преимущественно, в периферических участках трабекул.
Сосуды исследуемой группы резко полнокровны с дилатированными просветами. Суммарная площадь просветов капилляров, заполненных эритроцитами в исследуемой группе визуально намного больше чем в группах сравнения. Увеличение просвета капилляров даёт возможность большему количеству аденоцитов контактировать с кровеносным руслом. Так, доля хромо-
фильных аденоцитов, контактирующих с капиллярами в случаях смерти от общей гипотермии визуально больше, чем в контрольной группе. В просветах части сосудов престазы, стазы, микроагрегаты эритроцитов. В отдельных капиллярах отмечается изменение реологических и коагуляционных свойств крови в виде сепарации форменных элементов и плазмы, а также сгущения последней. Стенки сосудов имбибированы чётко контурированными эритроцитами, на отдельных участках мигрирующими из сосудистого русла в перикапиллярные пространства с формированием мелкоочаговых скоплений. Выход эритроцитов за пределы сосудистой стенки происходит без нарушения целостности последней вследствие повышенной проницаемости за счёт тканевой гипоксии. Обнаруженные изменения проницаемости сосудистой стенки необходимо рассматривать как проявление приспособительных реакций организма к существованию в необычных условиях внешней среды. Умеренное повышение проницаемости капилляров можно расценивать как положительный фактор, обеспечивающий лучшее кровоснабжение тканей, так как при этом облегчается и усиливается обмен между кровью и паренхимой аденогипофиза.
Описанные выше гистоморфологические изменения, а именно: увеличение количества и размеров хромофилов (преимущественно тиреотропов и кортикотропов), наличие клеток функционально активных (увеличены в размерах, с крупными, гиперхромными ядрами) и переутомленных (со сморщенными, пикнотичными ядрами), полнокровие сосудистой сети, обеднение РНК, свидетельствуют о напряженной работе желез при смертельной гипотермии. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что в аденогипофизе происходит приспособительная, функциональная перестройка, направленная на сохранение теплового гомеостаза организма.
Литература:
1. Витер, В. И. Структурная морфология гипофиза при гипотермии / В.И. Витер, Ю.С. Степанян // Проблемы экспертизы в меди-
цине. - 2005. №2, — С. 9-10.
2. Монастырская, Б. И. Аденогипофиз /Б.И.Монастырская. - Л., «Наука», - 1974.
3. Новиков, В. С. Физиология экстремальных состояний /B.C. Новиков, В.В. Горанчук, Е.Б. Шустов. - СПб: Наука, 1998. - с. 247.
4. Чудаков, А. Ю. Современные клинико-морфологические аспекты общего острого переохлаждения /А.Ю. Чудаков. - СПб. - 1999.
5. Шигеев, В. Б. Холодовая смерть /В.Б. Шигеев, С.В. Шигеев, Е.М. Колударова. М.— 2004. - 182 с.
6. Manfred Oehmichen. Hypothermia. Clinical, Pathomorfological and Forensic Features. Research in legal Medicine. - 2004 — v.31.—274p.
7. Scharrer, E. The final common path in neuroendocrine integration / E. Scharrer // Arch. anat. microsc. et morphol. exper. - 1965, № 1, p.359 - 369.
© А.Б. Мелентьев, Е.С. Кондратьева, 2007 УДК 340.67:615.214.2.099-074
А.Б. Мелентьев, Е.С. Кондратьева ОПРЕДЕЛЕНИЕ БУТОРФАНОЛА В КРОВИ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ С МАСС СЕЛЕКТИВНЫМ ДЕТЕКТОРОМ
КГУЗ «Челябинское областное бюро судебно-медицинской экспертизы» (начальник - к.м.н. Е.Ф. Швед) Описана аналитическая процедура определения буторфанола в крови с использованием газовой хроматографии с масс селективным детектированием, предназначенная для токсикологических анализов. Пробоподготовка включает введение внутреннего стандарта (этилморфин), жидкость-жидкостную экстракцию, дериватизацию с пропионовым ангидридом и газохроматографический анализ образцов в режиме селективного ионного мониторинга. Предел обнаружения равен 5 нг/мл. Диапазон количественного определения 10 до 100 нг/мл. Максимальные внутрисерийные относительные погрешности не превышают 14% для концентрации 20 нг/мл и 12 % для концентрации 100 нг/мл. Методика апробирована на экспертном материале при производстве судебно-химических исследований.
Ключевые слова: буторфанол, газовая хроматография - масс спектрометрия.
DETERMINATION OF BUTORPHANOL AND LEVOMEPROMAZINE IN BLOOD BY GAS CHROMATOGRAPHY MASS SPECTROMETRY A.B. Melentyev, E.S. Kondratyeva Analytical procedure of determination butorphanol in blood with use of a gas chromatography this mass selective detecting, intended for toxicological analyses is described. Preparation of biological fluid includes introduction of the internal
standard (ethylmorphine), liquid - liquid extraction, derivatization this propionic anhydride and GC analysis of samples in a mode of selective ionic monitoring. The LOD is equal 5 ng / ml, LOQ is 10 up to 100 ng / ml. The maximal inter-day precisions not exceed 14 % for concentration of 20 ng / ml and 12 % for concentration of 100 ng / ml. The technique is tested on an expert material by manufacture forensic chemical researches.
Key words: butorphanol, a gas chromatography mass spectrometry.
Буторфанол - лево-3,14-дигидрокси-М-циклобутил-метил [15-3Н]-морфинан (рис. 1.) представляет собой синтетический опиоид со свойствами агониста-антагониста, анальгетик центрального действия для парентерального применения. Выпускается фармацевтическими фирмами в виде водного раствора буторфанола тартрата (Стадол, Морадол, Торат и др.).
Рис.1. Структура буторфанола
По силе действия, скорости наступления эффекта и длительности действия близок к морфину, но эффективен в меньших дозах, чем морфин. Обычная разовая доза для взрослых внутримышечно - 2 мг каждые 4 часа, при этом эффективная концентрация буторфанола в крови обычно не превышает 5 нг/мл [4, 5], сведений о токсических и летальных концентрациях этого препарата в крови в литературе нами не обнаружено. Буторфанол широко и эффективно применяется в медицинской практике при обезболивании в хирургии и терапии, в частности при онкологических и ортопедических болях, для постхирургического обезболивания. За счёт седативного действия применяется для премедикации. Препарат не назначают больным в возрасте до 18 лет (из-за отсутствия достаточного опыта изучения действия препарата у детей и подростков), а также больным с физической зависимостью от наркотиков [1].
По принятой в настоящее время классификации буторфанол не является наркотиком и относится к сильнодействующим веществам, так как обладает более низким наркогенным потенциалом, чем морфин [5]. При назначении буторфанола вводятся ограничения на некоторые виды деятельности, связанные с необходимостью проявлять быструю реакцию, не применим в ситуациях, требующих длительной умственной и физической работоспособности. Последние несколько лет в нашем регионе буторфанол стал часто использоваться зависимыми от опиатов больными как временный и легально приобретаемый заменитель героина. В нашей практике встречались и случаи смертельного отравления буторфанолом. В связи с этим возникла необходимость в разработке простой и чувствительной методики для количественного определения буторфанола в крови при токсикологическом анализе.
В большинстве опубликованных работ количественное определение буторфанола проводится методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуоресцентным детектором [6] или тандемной масс-спектрометрией [4]. Количественное определение буторфанола методом газовой хроматографии (ГХ) с масс селективным детектором связано с трудностями его дериватизации, возникающими из-за неполноты прохождения реакций этерификации гидроксильной группы по положению 14 молекулы буторфанола [2, 3]. Поэтому для дериватизации необходимо применять только те реагенты, которые дают лишь один продукт этерификации. Ранее
[2] нами показано, что для этих целей подходят реагенты, которые имеют объемную прививаемую группу, что создает пространственные затруднения для прохождения реакции с гидроксильной группой по положению 14.
Целью данной работы явилась разработка методики количественного определения буторфанола в крови (плазме), предназначенной для токсикологических и судебнохимических анализов, с использованием метода газовой хроматографии с масс селективным детектированием.
Экспериментальная часть
Оборудование. Газовый хроматограф 6890N с масс-селективным детектором 5975В и автосамплером 7683В фирмы Agilent Technologies с ГХ колонкой HP-5MS длинной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с 5% фенил-метилсилоконовой фазы, толщина пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Набор пипеток-дозаторов («Biohit», Финляндия), встряхиватель АВУ-6, центрифуга СМ-6М, термостат ТВ.3-25.
Материалы и реактивы. В качестве стандартов использовали 0,2% раствор буторфанола тартрата для инъекций (BRISTOL-MYERS SQUIBB) и фармацевтическую субстанцию дионина (этилморфина гидрохлорида) применяемого в методике в качестве внутреннего стандарта. Пропионовый ангидрид фирмы «Ferak Berlin», Германия. Триэтиламин, квалификации ч, перед применением обезвоживали с помощью прокаленного при 170°С карбоната калия и перегоняли. Другие растворители и реактивы использовались квалификации хч или чда.
Стандартные и калибровочные растворы. Для приготовления раствора буторфанола с концентрацией 0,1 мг/мл на основание, 36,5 мкл 0,2 % раствора буторфанола тартрата смешивалось с 463,5 мкл этанола. Рабочие растворы для калибраторов готовились из стандартного раствора с концентрацией 0,1 мг/мл. Раствор с концентрацией буторфанола 0,01 мг/мл готовили добавлением в виалу 50 мкл раствора с концентрацией 0,1 мг/мл и 450 мкл этанола. Раствор с концентрацией буторфанола 0,001 мг/мл готовили добавлением в виалу 50 мкл раствора с концентрацией 0,01 мг/мл и 450 мкл этанола. Растворы буторфанола тартрата с концентрацией ниже 2 мг/мл хранению не подлежат и готовятся каждый раз заново при перекалибровке или для приготовления контрольных образцов. Калибраторы для ГХ анализа готовили на «холостой» крови, предварительно проверенной на наличие наркотических и психотропных веществ. Для приготовления калибровочных растворов использовали схему, при-
Таблица 1 Схема приготовления калибраторов
№ п/п Название пробы Калибровочная концентрация в крови, нг/мл Концен- трация рабочего раствора, мг/мл Объем рабочего раствора на 1 мл крови, мкл
1 Точка 0 0 - 0
2 Точка 1 5 0,001 5
3 Точка 2 10 0,001 10
4 Точка 3 50 0,001 50
5 Точка 4 100 0,01 10
веденную в табл. 1. К 1 мл «холостой» крови добавлялось соответствующее количество одного из рабочих растворов. После этого калибровочные пробы проходили все процедуры пробоподготовки и анализа. По результатам анализов калибраторов строилась калибровочная кривая.
Раствор внутреннего стандарта. Исходный раствор внутреннего стандарта с концентрацией 10 мг/мл готовили растворением 50 мг порошка этилморфина гидрохлорида в 3 мл этанола с добавлением 2 мл 0,1 н раствора соляной кислоты. Рабочий раствор внутреннего стандарта с концентрацией 0,01 мг/мл готовили добавлением 25 мкл исходного раствора с концентрацией 10 мг/мл в мерную колбу на 25 мл и заполнением колбы до метки этанолом.
Подготовка проб крови. К 1 мл крови добавляли 25 мкл раствора внутреннего стандарта этилморфина г/х 0,01 г/л, 1 мл 0,5н боратного буферного раствора с рН 10 и 5 мл дихлорметана в качестве экстрагента. Смесь встряхивали 10 мин и центрифугировали со скоростью 3000 об/мин в течение 5 мин. После разделения органического и водного слоёв, отделяли органический экстракт, пропускали его через слой безводного сульфата натрия и испаряли в токе воздуха досуха. К сухому остатку добавляли по 50 мкл триэтиламина и пропионового ангидрида, смесь нагревали в закрытой виале 30 минут при 90°С. Избыток реагентов удаляли в токе воздуха. Перед анализом к сухому остатку в виалу добавляли 200 мкл изопропанола.
ГХ анализ с масс селективным детектированием. Анализировали образцы на газовом хроматографе с масс-селективным детектором в режиме SIM (мониторинг заданных ионов) по ионам:
- первая группа (10,8-11,5 мин)- 369, 340, 396 - пропи-оновый эфир этилморфина (внутренний стандарт);
- вторая группа (11,5-12,8 мин)- 298, 328, 383 - пропи-оновый эфир буторфанола.
Оценка метрологических характеристик проводилась при следующих параметрах:
- начальная температура колонки 80°С, выдержка 1,0 мин., увеличение температуры со скоростью 40°С/мин до 200°С и дальнейший подъем температуры со скоростью 12,5°С/мин до 300°С с выдержкой при конечной температуре 6 минут;
- газ-носитель гелий, режим постоянного потока «œnstant flow» - 1,4 мл/мин, начальное давление на колонке 17,0 psi;
- температура инжектора 250°С, источника ионов 230°С, квадруполя 150°С;
- ввод пробы без разделения потока со сбросом избытка через 1 мин в отношении потоков 1:20 (Split/Splitless). Вводимый объём образца в изопропаноле 2 мкл.
Обсуждение результатов
Для дериватизации буторфанола перед ГХ анализом нами выбран пропионовый ангидрид, как наиболее дешевый и удобный для использования в рутинных анализах реагент. Предварительными опытами нами не обнаружено продуктов реакции пропионового ангидрида с гидроксильной группой по положению 14 молекулы буторфанола. Поэтому продукт этерификации имеет один пик на хроматограмме, что позволяет проводить количественное определение буторфанола методом газовой хроматографии. Хроматограмма экстракта крови с концентрацией буторфанола 50 нг/мл, масс-спектр и структура пропионового эфира буторфанола приведены на рис. 2. Условия экстракции и дериватизации перед ГХ анализом оптимизированы нами с помощью расчетов с использованием программы ACD/Labs и математического планирования эксперимента. Выбранный вариант пробо-
Рис.2. Хроматограмма экстракта крови с концентрацией буторфанола 50 нг/мл (а), масс-спектр и структура пропионового эфира буторфанола (б);
- 11,043 мин - пик пропионового эфира внутреннего стандарта,
- 12,602 мин - пик пропионового эфира буторфанола.
подготовки, описанный выше, обеспечивает извлечение буторфанола из крови на уровне 95±16% и наиболее стабильные показатели воспроизводимости анализа.
Определенные в ходе построения калибровочной кривой пределы обнаружения и интервал линейности наряду с внутрисерийной и межсерийной воспроизводимостью результатов служат основными критериями, по
Таблица 2
Результаты контрольных анализов на точность и воспроизводимость
Статистика Концентрация буторфанола, нг/мл
Серия 1 Серия 2 Серия 3
20 нг/мл 100 нг/мл 20 нг/мл 100 нг/мл 20 нг/мл 100 нг/мл
17,9 10б,4 22,1 81,4 20,3 89,9
18,0 100,9 20,0 100,0 22,5 89,9
21,5 10б,4 19,7 102,7 24,2 115
20,0 107,4 15,2 95,3 15,9 95,8
22,1 100,0 18,3 74,4 21,9 100,0
21,7 105,5 18,9 102,2 20,0 105,3
Среднее 20,2 104,4 19,03 92,бб 20,8 99,32
Стандартное отклонение 1,88 3,15 2,28 11,94 2,84 9,72
Коэффициент вариации 9,32 3,02 11,98 12,88 13,б9 9,78
Доверит. интервал 1,51 2,53 1,83 9,5б 2,27 7,77
которым проводится оценка применимости данного варианта методики для химико-токсикологических анализов наркотических и сильнодействующих веществ.
Разработанная методика охватывает область от 5 до 100 нг/мл буторфанола, что предполагает ее использование только для токсикологических, анализов, так как предел обнаружения выше, чем терапевтические концентрации в крови. Предел количественного определения равен 10 нг/мл. Калибровочная кривая линейна в диапазоне от 10 до 100 нг/мл и описывается уравнением:
Y = 2,121*X - 0,0089 (г = 0,9943), где Y - концентрация буторфанола нг/мл;
X - отношение площади пика целевого иона пропио-новых эфиров буторфанола (328 а.е.м.) и внутреннего стандарта (369 а.е.м.); г - коэффициент корреляции.
Результаты проверки методики на воспроизводимость и точность представлены в табл. 2. Максимальная внутрисе-рийная относительная погрешность не превышает 14% для концентрации 20 нг/мл и 12% для концентрации 100 нг/мл.
Предлагаемая методика прошла апробацию в Челябинском областном бюро судебно-медицинской экспертизы для подтверждения и количественного определения буторфанола в крови. Количественное определение буторфанола в крови проводили при обнаружении буторфанола или его метаболитов при скрининге биологических жидкостей на наркотические, психотропные и сильнодействующие лекарственные вещества. Концентрацию буторфанола более 100 нг/мл определяли по анализу крови, разбавленной водой в соотношении 1:1 с последующим пересчетом на цельную кровь. При определении буторфанола в концентрации от 5 до 10 нг/мл она интерпретируется как следовое количество.
Литература:
1. Современная медицинская энциклопедия/Подред. Г. Б. Федосеева - СПб., Норинт,- 2001. - 1235 с.
2. Мелентъев, А. Б. Обнаружение буторфанола и его основных метаболитов в моче методом газовой хроматографии с масс-селек-тивным детектором /А.Б. Мелентьев,Д.Г. Ким //Известия Челяб. Науч. Центра. -2006. - 1(31). - С.61-66.
3. Andraus, М. Н. Derivatization methodology for the analysis of butorphanol by gas chromatography-mass spectrometry / M.H. Andraus, M.E. de Siqueira //Biomedical Chromatography. - 1998. - Vol.12. P.34-37.
4. Boulton, D. W. Validation and application of a sensitive assay for butorphanol in human plasma by high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry detection /D.W. Boulton, G.F. Duncan, N.N. Vachharajani // J.Chrom. B. - 2002. - Vol.775. -P.57-62.
5. Gaver, R. C. Disposition ofparenteral butorphanol in man / R.C. Gaver, M. Vasiljev, H.Wong, I. Monkovic, J.E. Swigor, D.R. Van Harken, R.D. Smyth //Drug Metabolism andDisposithion. - 1980. - Vol.8. - P.230-235.
6. Willey, T. A. High-performance liquid chromatographic method for the quantitative determination of butorphanol, hydroxybutorphanol, and norbutorphanol in human urine using fluorescence detection / T.A. Willey, G.F. Duncan, L.K. Тау, K.A. Pittman, R.H. Farmen // J. Chrom. B. - 1994. - Vol.652. -P.171-178.
© О.Л. Горбунова, Л.Г. Зорина, 2007 УДК 343.983.7
О.Л. Горбунова, Л.Г. Зорина ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ В СУДЕБНОМЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЕ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ЧАСТИЦ ПЕРХОТИ
ГУЗ «Бюро судебно-медицинской экспертизы» Удмуртской республики (начальник - к.м.н. В.И. Жихорев)
На материале, отобранном с голов лиц с заведомо известной группой крови и категории выделительства, а также их одежды, изучены особенности использования моноклональных антител в судебно-медицинской экспертизе при исследовании частиц перхоти. Изучены частицы различных размеров. Отмечена высокая эффективность данной методики при исследовании малого количества материала, быстрота метода. Использование данного метода незаменимо при производстве срочных экспертиз, связанных с исследованием перхоти и выделений человека.
Ключевые слова: перхоть, моноклональные антитела, иммуноферментный анализ, антигены, цоликлоны.
USES OF MONOCLONAL ANTIBODIES IN MEDICOLEGAL EXAMINATION AT RESEARCH OF PARTICLES OF FURFUR
O.L. Gorbunova, L.G. Zorina On a material selected from heads of persons with obviously known group of blood, and also their clothes, are investigated features of use monoclonal antibodies in medicolegal examination at research of particles of furfur. Particles of the various sizes are investigated. High efficiency of the given technique is marked at research of small amount of a material, speed of a method. Use of the given method is irreplaceable by manufacture of the urgent examinations connected to research of furfur and allocation of the person.
Key words: monoclonal antibody, immunofermtal the analysis, antigenes, coliclon.
Одной из задач судебно-биологической экспертизы частиц перхоти. Однако оно резко возрастает при воспа-
является определение групповой принадлежности объек- лительных процессах, когда усиливается митотическая
тов биологического происхождения. К объектам биологи- активность базального слоя и, соответственно, этап кера-
ческого происхождения, в том числе, относится и перхоть. тинизации полностью не завершается.
Частицы перхоти сравнительно недавно стали объектом Обычно частицы перхоти хорошо различимы и несудебно-медицинского исследования и могут представ- редко встречаются в большом количестве. Наиболее часто
лять непосредственный интерес для следствия как одно они встречаются на таких предметах как шапки, маски,
из средств идентификации лица их оставившего. воротники пальто и пиджаков и т.д. Визуально частицы
Перхоть представляет собой чешуйки клеток верхних перхоти значительно отличаются по своему внешнему
слоев эпидермиса, находящихся на различных стадиях виду от частиц почвы, пыли, микроволокон и других
кератинизации. У здоровых людей на волосистой части примесей и представлены в виде блестящих частиц белого
головы можно обнаружить незначительное количество или слегка желтоватого цвета.
