CC BY
75
УДК 619:618.177-089.888.11:636.92
Масалович Ю. I., * астрант (E-mail:[email protected]) ©
Нащональний умверситет бюресурав 7 природокористування Украгни
ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТ1 СПЕРМПВ ПРИ ВИКОРИСТАНН1 Р1ЗНИХ РОЗБАВНИК1В ДЛЯ СПЕРМИ КРОЛ1В
У статтг наведено результати дослгдження динамжи збереження активности спермПв тсля розбавлення сперми. Наведено поргвняльну характеристику складових ргзних середовищ. Встановлено, що штучт середовища в1дпов1дають якостг, зберггають життездаттсть спермПв та прост1 у виготовлент та застосувант. Дослгджено, що тривалгсть життя сперматозогдгв кролгв поза оргатзмом залежить вгд середовища, яке застосовують для розбавлення сперми. Встановлено, що збыьшення об'ему сперми 1з високою заплгднювальною здаттстю спермПв за тривалого термшу збер1гання потребуе розбавлення еякуляту специальными бгологгчними середовищами, ям гальмували б затрати внутр1шн1х енергетичних запас1в в сперм1ях I не викликали загибелг. Середовище «МАБ-1» показало найкращг результати в ступеш дН на активность спермПв кролгв, до складу якого входили ще бгкарбонат натргю та хлорид калю, якг е природними буферами, що перешкоджають отруенню спермПв кислими продуктами гх метаболизму, зменшують проникнгсть оболонок спермПв, послаблюють дгю антиты у статевих шляхах самки на сперматозогди, виводять з сироватки сперми кальцгй, вгльнг гони якого е шкгдливими для сперматозогдгв; антибиотики - затримують розвиток мгкрооргангзмгв у спермг, що можуть потрапити в нег при взятт1, та ряд гнших складових.
Ключов'1 слова: сперматозогди, сперма, активность, розбавники, кролг, оцгнка, середовище, динамгка, розргджувач.
УДК 619:618.177-089.888.11:636.92
Масалович Ю. I., аспирант
Национальный университет биоресурсов и прирородопользования Украины
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СПЕРМИЕВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РАЗНЫХ РОЗБАВИТЕЛЕЙ ДЛЯ СПЕРМЫ КРОЛЕЙ
В статье приведены результаты исследования динамики сохранения активности спермиев после разбавления спермы. Приведена сравнительная характеристика составных разных сред. Установлено, что искусственные среды отвечают качеству, хранят жизнеспособность спермиев и простые в изготовлении и применении. Исследовано, что продолжительность жизни сперматозоидов кролей вне организма зависит от среды, которую применяют для разбавления спермы. Установлено, что увеличение объему спермы с высокой оплодотворяющей способностью спермиев при длительном сроке хранения нуждается в разбавлении еякулята специальными биологическими средами, которые тормозили бы затраты внутренних энергетических запасов в спермиях и не вызывали гибели. Среда «Mas-1» показала наилучшие результаты в степени действия на активность спермиев кролей, в состав которой входили еще бикарбонат натрия и хлорид калию, которые являются естественными буферами, которые препятствуют отравлению спермиев кислыми продуктами их метаболизма, уменьшают проницаемость оболочек спермиев, ослабляют действие антител в половых путях самки на сперматозоиды, выводят из сыворотки спермы кальций, свободные ионы которого являются вредными для сперматозоидов; антибиотики - задерживают развитие микроорганизмов в сперме, которые могут попасть неё при взятии, и ряд других составляющих.
'Науковий кершник: доктор вет. наук, професор Любецький В. Й. ©Масалович Ю. I., 2015
84
Ключевые слова: сперматозоиды, сперма, активность, розбавители, кролики, оцтка, середовище, динамгка, розргджувач.
УДК 619:618.177-089.888.11:636.92
Y. I. Masalovich, graduate student
National university of life and environmental sciences of Ukraine
DETERMINATION OF ACTIVITY OF SPERMIEV AT THE USE OF DIFFERENT ROZBAVITELEY FOR SPERM OF CRAWLS
In the article th eresults of research of dynamics of maintainance of activity of spermiev after dilution of sperm. Comparative description of component different environments is resulted. It is set that artificial environments answer quality, keep viability of spermiev and simple in making and application. It is investigational, that life-span spermatozoa of crawls out of organism depends on an environment which is applied for dilution by sperms. It is set that the increase of volume sperm with high impregnating ability of spermiev at the protracted shelf-life needs dilution of eyakulyatu the special biological environments which would brake the expenses of internal power supplies in spermiyakh and did not cause death. The environment of «Mas-1» rotined the best results in the degree of operating on activity of spermiev of crawls, in the complement of which the bicarbonate of sodium and chloride entered yet to potassium, which are natural buffers which hinder poisoning of spermiev the sour products of their metabolism, diminish permeability of shells spermiev, weaken the action of antibodies in the sexual ways of female on spermatozoa, destroy from the whey of sperm a calcium free ions of which are harmful for spermatozoa; antibiotics - detain development of microorganisms in sperm, which can get for it at taking and row of other constituents.
Key words: spermatozoa, sperm, activity, media, rabbit, estimation, environment, dynamics, rozridzhuvach.
Одним з основних технолопчних процешв при збер^анш сперми тварин е розбавлення. Вивчаючи фiзико-хiмiчнi властивосп секрету додаткових статевих залоз i 1хнш вплив на статевi клггини самщв I. I. 1ванов (цитовано за Осташко Ф. I.) встановив, що сперматозо!ди здатш жити i збер^ати заплщнешсть без секрету додаткових статевих залоз. Рашше для розбавлення сперми застосовували фiзiологiчний (0,85 %) розчин кухонно! сол^ цукрово ^зюлопчний розчин, рщину Локка та ш. Наука в цьому напрямку розвиваеться дуже штенсивно i на сьогодш, запропоновано велику кшьюсть розрiджувачiв для сперми тварин [4].
Заплщнюванють маточного поголiв'я значною мiрою залежить вщ якосп сперми, використано! для ошменшня. Головною перевагою методу штучного ошменшня е можливють максимально використовувати високоплемшних самщв шляхом заплщнення багатьох самок спермою одного еякуляту. Збшьшення об'ему сперми iз високою заплiднювальною здатшстю спермив за тривалого термiну збер^ання потребуе розбавлення еякуляту спецiальними бюлопчними середовищами, якi гальмували б затрати внутршшх енергетичних запасiв в спермiях i не викликали загибелi [2, 4].
Реакщя рН середовища, яким розбавляють сперму самцiв, е значним чинником для збереження життездатност спермив та заплщнювально! здатностi. У свiжоотриманому еякулятi кролiв рН становить 6,5-6,7.
Сперми в^^зняються вiд шших клiтин органiзму активнiстю процесiв дисимшяци, що зумовлюе порiвняно швидке витрачання поживних речовин i загибель [3, 5]. Причинами загибелi спермив е також отруення !х молочною кислотою та шшими продуктами обмiну речовин, рiзке коливання температури, згубний вплив мiкроорганiзмiв, якi потрапили в сперму, втрата сперматозо!дами заряду i як результат, !х аглютинацiя [1]. Тому головна вимога до розрщжувача - це
85
забезпечення високо! заплщнювально! здатност сперматозоадв при високому ступенi виживання. Це можливо за умови, якщо розрiджувач виготовлений з урахуванням фiзiологiчних, бiохiмiчних i видових особливостей сперми тварин.
Штучш середовища, якi використовуються на практицi для розбавлення сперми, не можна розглядати як просто розрщжувачг Це фiзiологiчно активнi середовища, яю одночасно е i захисними середовищами. Вони збiльшують строки збер^ання сперми, а також полiпшують умови i прискорюють процес заплiднення. Для штучного ошменшня тварин застосовують тшьки розбавлену сперму [4].
Отже, розробка нових середовищ для розбавлення сперми кролiв було i залишаеться одним iз актуальних питань, якими займаються науковцi.
Мета дослiдження - встановити динамшу збереження активностi спермпв пiсля розбавлення сперми кролiв рiзними середовищами.
Матерiали i методи дослщження. Експериментальнi дослiдження проводили упродовж 2014 року на кафедрi акушерства, гшекологи та бютехнологи вiдтворення тварин НУБЛ Украши. Матерiалом для дослiджень була сперма кролiв породи Hyla. Сперму отримували за допомогою штучно! вагши. Отриманий еякулят лабораторно дослiджували згщно з загальноприйнятими методиками, iз такими показниками: обем, колiр, запахом, консистенщя, густина та активнiсть. Порiвнювали як змшюеться активнiсть сперматозоадв пiсля розбавлення еякуляту кролiв рiзними за складом розбавниками.
Мшроскошчну оцiнку проводили за температури 38 -40 °С при збшьшенш об'ективу мiкроскопа в 400 разiв. Потiм еякулят розбавляли середовищами у сшввщношенш 1:10, пiдiгрiтим до температури тша тварини. Для визначення ефективносп розбавника кожну годину визначали активнють спермив (за десятибальною шкалою).
Результати дослщження. Об'ем еякуляту кролiв коливався в середньому вщ 0,4 до 1,1 мл. Колiр еякуляту був вщ молочного до блщого, запах специфiчний, консистенцiя сметаноподiбна, стороншх домiшок не вiдмiчали.
Оцiнка якост розбавлено! сперми проводилась за актившстю, яка у свiжоодержаному еякулятi становила 9 балiв.
До складу кожного iз середовищ входив HEPES, який е оргашчним буфером, що захоплюе важкi метали та утримуе рН в розбавленш спермi на сталому рiвнi, та в свою чергу запоб^ае рiзкому падiннi активностi сперматозоидов; глюкоза - е енергетичним матерiалом для сперматозоадв i запобiгае втрат ними електричного заряду, а отже !х аглютинаци.
Таблиця 1
Склад розбавникш _
Розбавник №1 Розбавник №2 Розбавник №3 Розбавник №4 (MAS -1)
HEPES HEPES NaCL HEPES
Глюкоза Глюкоза d-Glucose Glucose
Na2HPO4 Na2HPO4 Na2HPO4 Na2HPO4
MgCL2 MgCL2 MgCL (anhydrous) MgCL262O
KOH KOH KH2PO4, NaHCO3
NaCL NaCL CaCL2 (anhydrous) NaCL
NaOH NaOH KCL KCL
Milli-Qwater BSA (6003) BSA (A 4919) BSA
рН - 8,41 Milli-Qwater Sodiumpyruvate Napyruvate
рН - 11,02 Phenolred Lacticacid (60 %) syrup
Milli-Qwater CaCL22H2O
рН - 7,96 Milli-Qwater
рН - 8,4
86
Таким чином, iз застосованих середовищ найкращий ефект на рухливють сперматозо]дов показав розбавник №4 (МА8-1), до складу якого входили ще бiкарбонат натрiю та хлорид кашю, якi е природними буферами, що перешкоджають отруенню спермпв кислими продуктами !х метаболiзму, зменшують проникнiсть оболонок спермпв, послаблюють дiю антитiл у статевих шляхах самки на сперматозо1ди, виводять з сироватки сперми кальцш, вшьш iони якого е шюдливими для сперматозо]дов; антибiотики - затримують розвиток мiкроорганiзмiв у спермi, що можуть потрапити в не! при взятп та ряд шших складових.
На рис. 1 показано, що активнють сперматозо]дов при розбавленнi сперми середовищем №1 почала знижуватись на 5 год,на 10 год дослщження становила 6 балiв.
Рис. 1. Динамжа активностi сперматозо\дов
При використанш розбавника № 2, уже на 3 год сперми рухались з актившстю 8 балiв. При розбавленш середовищем № 3, активнiсть на 5 год почала с^мко падати, на 8 год становила 4 бали. Найкраще проявив себе розбавник № 4 (МА8-1), активнiсть сперматозоидов 9 балiв спостерiгали протягом 6 год, тшьки на 7 год почала поступово знижуватись.
Висновки.
1. Тривалють життя сперматозо]дов кролiв поза оргашзмом залежить вiд середовища, яке застосовують для розбавлення сперми.
2. Порiвняльний аналiз результатiв, отриманих в наших дослщженнях, вказуе на деякi вщмшност в ступенi дп розрiджувачiв на актившсть спермпв кролiв, що в свою чергу, пов'язано з рiзним складом кожного середовища.
Лiтература
1. Варакса П. А. Искусственное осеменение сельско-хозяйственных животных / П. А. Варакса // Л., Лениздат, 1969.
2. Доввдник по штучному оаменшню сшьськогосподарських тварин / [За ред. I. Г. Зорша]. - К. Урожай, 1971. - С. 272.
3. Карташов I. I. Штучне оамешння тварин з основами акушерства: Навчальний иос1бник для учшвсередшх спещальних навчальних заклад1в 1з спещальност «Зоотехшя» / I. I. Карташов, Г. С. Шарапа. - К.: Вища школа, 1989.
4. Осташко Ф. I. Збер1гання с1м'я тварин / Ф. I. Осташко // К. Держ-сшьгоспвидав УРСР, 1962.
5. http://www.inenbiol.eom/bt/2006/1/4.pdf
Стаття надшшла до редакцИ 17.09.2015
87
УДК 001. 891. 577.214
Назар Б. I., к.вет.н. ©
Державный науково-досл1дний контрольный тститут ветеринарных препарат1в та кормових добавок, м. Льв1в, Украгна
ПРОБЛЕМИ, ЯК1 ВИНИКАЮТЬ П1Д ЧАС ПРОВЕДЕННЯ ПОЛ1МЕРАЗНО -ЛАНЦЮГОВО1 РЕАКЦП (ПЛР) ТА МОЖЛИВ1СТЬ IX УНИКНЕННЯ
Проведено аналгз можливих помилок та проблем, що можуть виникати в процесс проведення пол1меразно-ланцюговог реакцИ' на преаналтичному, аналтичному та постаналтичному етапах. Подано основт заходи щодо недопущення виникнення контамтацп I, як наслгдок, отримання хибно позитивних або хибно негативних результатов. 1з метою тдтвердження вгдсутностг контамтацп, необхгдно кожну серю експеримент1в супроводжувати постановкою негативних контрол1в (К-). Для контролю за якгстю проходження основних етатв анализу (в1дб1р, транспортування, зберггання, видыення НК, проведення реакцИ' зворотног транскрипцп чи безпосередньо реакцИ' амплгфгкацИ) обов'язковим е використання позитивних контрол1в (К+), що дозволяють оцтити ефективтсть реакцИ' I якгсть реагентгв. Висвтлено декглька способов усунення контамтацп. Вказано на необхгдтсть проводити регулярний внутрШньолабораторний контроль якостг дослгджень 1з пергодичтстю, яка залежить вгд обсягу роботи. Основними критериями оцтки якостг роботи ПЛР-лабораторИ' е результати внутрШнього I зовнШнього лабораторного контролю якостг дослгджень, а також вгдсуттсть випадюв лабораторной контамтацп НК.
Ключов1 слова: пол1меразно-ланцюгова реакция, нуклегнова кислота, контамтацгя, хибно позитивнийрезультат, хибно негативнийрезультат.
УДК 001. 891. 577.214
Назар Б. И., к. вет. н.
Государственный научно-исследовательский контрольный институт ветеринарных препаратов и кормовых добавок, м. Львов, Украина
ПРОБЛЕМЫ, КОТОРЫЕ ВОЗНИКАЮТ ВО ВРЕМЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНО-ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) И ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ
ИЗБЕЖАНИЯ
Проведен анализ возможных ошибок и проблем, которые могут возникать в процессе проведения полимеразной цепной реакции на преаналитическом, аналитическом и постаналитическом этапах. Представлены основные мероприятия по недопущению возникновения контаминации и, как следствие, получение ложно положительных или ложно отрицательных результатов. С целью подтверждения отсутствия контаминации необходимо каждую серию экспериментов сопровождать постановкой негативных контролей (К-). Для контроля за качеством прохождения основных этапов анализа (отбор, транспортировка, хранение, выделения НК, проведения реакции обратной транскрипции или непосредственно реакции амплификации) необходимо использовать положительные контроли (К+), позволяющие оценить эффективность реакции и качество реагентов. Освещены несколько способов устранения загрязнений. Указано необходимость проводить регулярный внутри-лабораторный контроль качества исследований с периодичностью, которая зависит от объема работы. Основными критериями оценки качества работы ПЦР-лаборатории являются результаты внутреннего и внешнего лабораторного контроля качества исследований, а также отсутствие случаев лабораторной контаминации НК.
© Назар Б. I., 2015
88
