Ефективність кріопротекторів рослинного і тваринного походження при заморожуванні сперми бугаїв плідників Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

УДК 636.2:591.463.1-57.086.13

Шаран М. М., д.с.-г.н. (шш [email protected]) © Яремчук I. М., к.с.-г.н.

1нститут б1ологп тварин НААН Украгни, м. Львгв Шаловило С. Г., д.с.-г.н., професор Льв1вський нацюнальний утверситет ветеринарног медицини та бютехнологт

¡мет С. З. Гжицького

ЕФЕКТИВН1СТЬ КРЮПРОТЕКТОРШ РОСЛИННОГО I ТВАРИННОГО ПОХОДЖЕННЯ ПРИ ЗАМОРОЖУВАНШ СПЕРМИ БУГА1В ПЛ1ДНИК1В

Дослгджено ефективтсть крюпротектор1в рослинного I тваринного походження при заморожуванш сперми бугагв-плгдникгв. Встановлено, що використання середовища, яке мктило соевий лецитин, як крюпротектор тдвищило активтсть розмороженог сперми на 11,3 % пор1вняно з середовищем, у склад якого входили фосфолШди яечного жовтка. Застосування кр1опротектора рослинного походження тдвищуе активтсть спермпв тсля п 'яти годин ¡нкубацп на 12,1 %, пор1вняно з використанням тваринних компонентгв.

Ключовi слова: середовище, виживання, бугаг-пл1дники, спермИ, кргозахиснг речовини, антиоксиданти

Вступ. Сучасна мiжнародна iндустрiя тваринництва базуеться на застосуванш штучного оаменшня з використанням заморожено!, а в подальшому розморожено! сперми ^ вщповщно, використання розбавниюв, яю реально тдходять для процесу И заморожування. Першим етапом роботи при низькотемпературному заморожуванш сперми тварин е И розбавлення. Ефектившсть заморожування сперми в значнш мiрi залежить вщ складу синтетичних середовищ, яю використовують для И розбавлення. Ц середовища повинш вмщувати в собi речовини, яю здатнi забезпечувати зберiгання бюлопчно! повноцiнностi спермив у процесi !х технолопчно! обробки [1, 2, 5]. Крiм того, вони повиннi створити оптимальш для спермпв умови рН, осмотичного тиску, електропровiдностi i буферностг

На основi морфологiчних, бiохiмiчних i фiзiологiчних дослiджень сперми запропонованi новi пiдходи до пiдбору компонентiв для розробки захисних середовищ на основi стабшзаци стiйкостi бiлково-лiпiдних комплексiв, активной глутамшо-щавлево! трансамiнази та акросоми [3, 4, 8, 9].

Крiм глщерину, в якостi крюзахисно! речовини, основними компонентами розбавниюв, яю використовують при заморожуванш сперми, е юлька цу^в — як функцiональних джерел енерги, а також iншi речовини, яю пiдтримують осмолярнiсть i забезпечують буферну здатнiсть.

У традицiйних розбавниках курячий жовток дiе як джерело лшопротевдв, типу фосфолiпiдiв, i iнших високомолекулярних речовин, якi допомагають

© Шаран М. М., Яремчук I. М., Шаловило С. Г., 2011

352

попередити низькотемпературний шок. Яечний жовток устшно використовуеться на протязi десятилт [6, 7].

Хоча icHye нове поколiння розчинниюв сперми, якi вiльнi вiд компоненпв тваринного походження, на cьогоднiшнiй день розчинники, яю мicтять жовток курячого жовтка широко використовують для крюконсервуваня сперми [10, 11].

Метою даного дослщження було порiвняння базового розчинника на яечному жовтку, яке використовуеться для заморожування сперми в необлицьованих гранулах i соломинках iз одним з розчинниюв, який не мютить бшка тваринного походження.

Матер1али i методи. Впродовж одного мicяця вщ трьох буга!в голштинсько! породи отримували еякуляти сперми на штучну вапну з режимом використання дуплетна садка два рази на тиждень, через двi доби. Для доcлiджень брали лише високояюсш еякуляти сперми, у яких було не менше 80 % живих спермив з концентращею не менше 0,7 млрд. спермив в 1мл. Свiжоотриманi еякуляти ощнювали за об'емом (мл), густотою i активнicтю (рyхливicтю) спермив (%) пщ мiкроcкопом (в роздавленiй краплi).

Визначали концентрацiю спермив за допомогою фотометра та 1'х виживання до припинення прямолшшного поступального руху (год.) у cвiжоотриманiй та розбавленiй cпермi, витримуючи у термоcтатi при температyрi 38°С. Кожен еякулят роздiляли на двi частини. Одну частину еякуляту розбавляли лактозо-жовтковим середовищем (ЛЖС), iншy — розчинником, який не мютить бшюв тваринного походження i чи1' крюпотекторш влаcтивоcтi оcнованi на соевому лецитиш (Андромед). Кiнцева концентрацiя спермив 15 млн. спермив у дозi. Шсля розбавлення сперма була фасована у пайети i поставлена на 2,5 год. на еквшбрацш при температyрi -4°С. Замороження проводили на процеcорi шмецько! фiрми Minitüb у парах рщкого азоту при температyрi -120 °С.

Розморожували сперму у водянш банi при температyрi 38 °С впродовж 25 сек. Аналiз рухливост кожного зразка проводили безпосередньо тсля розморожування та на протязi 1, 2, 3, 4, 5-ти год. шкубаци при температyрi 38°С.

Пщ мiкроcкопом Olympus (Японiя) при збшьшенш у 200 разiв проводили аналiз рyхливоcтi спермив за допомогою програми Spermvision (Нiмеччина).

Отриманi результати статистично обробляли за допомогою програми Microsoft Office Excel

Результати дослщження. Порiвнюючи ефектившсть використання двох рiзних середовищ для розбавлення сперми буга!в не виявлено вiдмiнноcтей в активноcтi спермив до заморожування (табл.).

Рухлившть живих спермив тсля розморожування визначали використовуючи машинний аналiз руху кожно! кл^ини (cпермiя). В резyльтатi крюконсерваци сперми юльюсть активних спермив пicля розморожування значно знизилася, причому використання середовища, яке мicтило соевий лецитин, як крюпротектор, активнicть була на 24,4 % вищою порiвняно з середовищем, у склад якого входили фосфолшщи яечного жовтка.

Таблиця

Життездатшсть сперми бугаУв-плщнишв залежно вщ складу розбавника

Показники, %

До заморожування

Андромед

ЛЖС

Шсля розморожування

Андромед

ЛЖС

Актившсть спермiiв

(рухли-вiсть)

86,24±2,34

86,24±2,34

58,05±2,23

46,67±3,78

Спермiiв з прямолiнiй-но поступальним рухом

82,53±2,83

82,53±2,83

44,73±2,75

36,76±3,01

Спермiiв з манежним рухом

;,66±0,36

,66±0,36

12,18±0,27

21,14±1,19

Нерухомих спермив

13,76±0,21

13,76±0,21

41,95±1,33

53,33±1,46

Аналопчними були I кшьюсть спермив 1з прямолшшно поступальним рухом. Зокрема, тсля розморожування вщсоток спермив з прямолшшно поступальним рухом при використанш «Андромеду» був на 21,7 % вищим, шж при застосуванш ЛЖК.

Обернена залежшсть спостер1галася за кшьюстю спермив з манежним рухом та нерухомих спермив. Так, вщсоток спермив з манежним рухом при використанш соевого лецитину у склад1 середовища був нижчим 42,4 %, а нерухомих спермив — на 21,3 %, пор1вняно 1з застосуванням фосфолшщи яечного жовтка.

Для об'ективност ощнки якост сперми тсля розморожування ми провели И шкубацш впродовж п'яти годин (рис.).

0 1 2 3 4 5 тривалють шкубаци, год

□ Андромед □ ЛЖС

Рис. Параметри руху сперми впродовж дослiджуваного часу

Рухлив1сть спермнв значно зменшилась 1з часом в еякулятах розбавлених ЛЖС. Шсля 5-ти годин шкубацн !х рухливють була 16,76±0,87 %, в той час як сперми, пщдаш крюконсерваци з Андромедом проявляють незначне зниження рухливост 28,84±1,31 %. Сперма розбавлена середовищем «Андромед» проявляе на протяз1 усього дослщжуваного часу значно вищу рухливють у пор1внянш 1з спермою, розбавленою ЛЖС. Р1зниця в рухливост спермив у двох дослщжуваних розчинниках була статистично суттева.

Використання розчинниюв, у склад яких входить жовток курячого яйця вимагае не тшьки велико! роботи з його пщготовки та очищення, а також вносить суттевий неконтрольований ризик забруднення бактерiями, лшарськими препаратами, гормонально активними речовинами, яю здатнi погiршити не тшьки актившсть сперми пiсля розморожування але й заплiднюючу здатнiсть сперматозо!дiв.

Таким чином, результати дослщжень вказують на необхщшсть використання розчинникiв для сперми з вщповщним складом i вшьними вiд патогенних органiзмiв замiнниками яечного жовтка, який би забезпечував оптимальш показники заплщнення тварин та простоту обробки в лабораторних умовах.

Висновки.

¡.Використання середовища, яке мютило соевий лецитин, як крюпротектор тдвищило актившсть розморожено! сперми на 11,3 % порiвняно з середовищем, у склад якого входили фосфолшщи яечного жовтка.

2.Застосування крюпротектора рослинного походження пiдвищуе актившсть спермпв тсля п'яти годин шкубацп на 12,1 %, порiвняно з використанням тваринних компонент

Л1тература

1. Наук В.А. Структура и функция спермиев сельскохозяйственных животных при криоконсервации // Кишинев. — „Штиинца". — 1991. — 197 с.

2. ДСТУ 3535 — 97 // Сперма буга!в нативна. Техшчш умови.

3. Пакенас П.Й. Байсогальская технология криоконсервирования семени быков // Животноводство. — 1985. — № 1. — С.16-18.

4. Осташко Ф.И. Харьковская технология криоконсервации спермы животных /Ф.И. Осташко, М.П. Павленко, Г.Н. Кузнецов // Теор. и прикл. аспекты биотехнол. — К., — 1991. — С.32-33.

5. Патент Укра!ни №10894 // Середовище для розбавлення i заморожування сперми буга!в. — Публ. 29.12.99. — Бюл. № 8.

6. Патент Укра!ни №13369 // Споаб оцшки якост сперми. — Публ. 28.02.97. — Бюл. №1.

7. van Wagtendonk-de Leeuw A.M. Fertility results using bovine semen cryopreserved with extenders based on egg yolk and soybean extract. / A.M. van Wagtendonk-de Leeuw, R.M. Haring, L.M. Kaal-Lansbergen, J.H. den Daas. // Theriogenology —2000. — 54. — P. 57-67.

8. Cross N.L. Two simple methods for detecting acrosome-reacted human sperm. / N.L. Cross, P. Morales, J.W. Overstreet, F.W. Hanson // Gamete Res 1986. — 15. — P. 213-26.

9. Burkman L.J. The hemizona assay (HZA): development of a diagnostic test for the binding of human spermatozoa to the human hemizona pellucida to predict fertilization potential. /L.J. Burkman, C.C. Coddington, D.R. Franken, T.F. Krugen, Z. Rosenwaks, G.D. Hogen // Fertil Steril 1988. — 49. — P. 688-97.

10. Hinsch K.D. In vitro tests for essential sperm functions using the phytooestrogen genistein as a test substance. //K.D. Hinsch, V. Aires, W. Ha'gele, E. Hinsch // Andrologia 2000. — 32. — P. 225-231.

11. Zhang B.R. Prediction of bull fertility by combined in vitro assessments of frozen-thawed semen from young dairy bulls entering an Alprogramme. /B.R. Zhang, B. Larsson, N. Lundeheim, M.G. Haard, H. Rodriguez-Martinez // Int J. Androl — 1999.—22. — P. 253-260.

Summary M. Sharan, I. Yaremchuk S. Shalowylo EFFICIENCY OF CRYOPROTECTANTS VEGETABLE AND ANIMAL ORIGIN AT FREEZING OF BULLS SPERM

Investigated the efficiency of cryoprotectants vegetable and animal origin at freezing of sperm bull. Found that use of the environment that contain soy lecithin as cryoprotectants increased activity of defrosted sperm by 11,3 % compared with the medium consisting of egg yolk phospholipids. The use of cryoprotectants vegetable increases the activity of sperm after five hours of incubation by 12,1 % compared with the use of animal components.

Рецензент - д.вет.н., проф. Стефаник В.Ю.