CC BY
38
VOL 1 № 3 FUNDAMENTAL
' AND CLINICAL MEDICINE
ОБНАРУЖЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОГО АГЕНТА В ИКСОДОВОМ КЛЕЩЕ МЕТОДОМ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
ИЛЬИНСКИХ Н.Н.1,2, ИЛЬИНСКИХ е.Н.1,2
1ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский государственный университет» Министерства образования и науки РФ, г. Томск, Россия 2ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Томск, Россия
ORIGINAL ARTICLE
L
CYTOGENETIC DETECTION OF INFECTIOUS AGENTS IN IXODID TICKS
NIKOLAY N. ILYINSKIKH12, EKATERINA N. ILYINSKIKH12
National Research Tomsk State University (38, Lenina Street, Tomsk, 634050), Tomsk, Russian Federation
2Siberian State Medical University (2, Moskovskiy Trakt, Tomsk, 634050), Tomsk, Russian Federation
Резюме
Цель. Использование цитогенетического метода для определения наличия в клеще инфекционного агента.
Материал и методы. Материал в виде суспензий клещей был взят для анализа в лабораториях пунктов серопрофилактики г. Томска, г. Тюмени и г. Колпашево (Томская область). Методом иммуноферментного анализа (ИФА) определено наличие или отсутствие вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и (или) спирохет иксодово-го клещевого боррелиоза (ИКБ). Суспензии, полученные из клещей, были введены в культуры лимфоцитов, полученных от здоровых доноров.
Результаты. Цитогенетическое исследование показало, что суспензии с ВКЭ и ИКБ обладают выраженным кластогенным и анеугенным эффектом. Особенно существенное повышение
числа клеток с цитогенетическими нарушениями наблюдалось при наличии в клеще обоих инфекционных агентов. Из 18 суспензий клещей, в которых методом ИФА не определялось наличие ВКЭ и возбудителя ИКБ, в 6 случаях введение суспензий в культуру клеток индуцировало существенное повышение числа клеток с хромосомными аберрациями и изменениями в числе хромосом. Методом ПЦР в этих суспензиях определено наличие вируса лихорадки Западного Нила.
Заключение. Цитогенетический метод позволяет показать наличие в клеще инфекционного агента.
Ключевые слова: цитогенетический метод, иксодовые клещи, вирус клещевого энцефалита, патогенные Borrelia, клещевые иксодовые боррелиозы, вирус лихорадки Западного Нила.
Abstract
Aim: To test whether the cytogenetic techniques can be used for detection of infectious agents in ixodid ticks.
Materials and Methods: Suspensions of ixodid ticks were tested for encephalitis virus (TBEV)
and pathogenic Borrelia (PB) using enzyme-linked immunosorbent assay and then added to the lymphocytes isolated from donor peripheral blood.
Results: Suspensions of ixodid ticks with either TBEV or ITBB induced clastogenic and aneugenic effects, with the synergistic action of these two
< English
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
ТОМ 1, № 3
agents. However, one-third of samples negative for both TBEV and PB did still provoke mutagenic effects. To test whether other infectious agents may be responsible for this, we conducted polymerase chain reaction, with the successful identification of West Nile Fever virus (WNFV).
Conclusion: Cytogenetic techniques can be used for the detection of TBEV, ITBB, or WNFV in ixodid ticks.
Keywords: cytogenetics, ixodid ticks, tick-borne encephalitis virus, pathogenic Borrelia, Ixodes Tick-Borne Borreliosis, West Nile Fever virus
Введение
Имеются многочисленные исследования, свидетельствующие о том, что вирусы, бактерии и некоторые простейшие способны в клетках человека и животных вызывать нарушения в структуре и числе хромосом [2,8,14]. Как известно, иксодовые клещи могут являться носителями целого комплекса паразитов: вирусов клещевого энцефалита, лихорадки Западного Нила, геморрагических лихорадок, боррелий, риккетсий, бабезий и других инфекционных агентов [13,15]. Многих из них возможно ти-пировать только в условиях высокоспециализированных вирусологических лабораторий. Поэтому в поступивших в серопрофилактиче-ские пункты клещах, присосавшихся к человеку, в основном проводится определение наличия только вируса клещевого энцефалита и гораздо реже возбудителя иксодового клещевого боррелиоза, остальные инфекционные агенты в этих условиях не определяются, хотя могут являться причиной болезни [7]. Нами было показано, что вирус клещевого энцефалита и возбудители иксодовых клещевых боррелиозов способны вызывать в условиях культуры лимфоцитов человека цитогенетические нарушения [9,10]. Аналогичные данные были получены и относительно некоторых других клещевых инфекций [11].
Цель исследования
Изучение возможного наличия инфекционных агентов методом изучения уровня цитоге-нетических аберраций в культурах лимфоцитов человека, подвергнутых «заражению» суспензиями из тела клеща.
Материалы и методы
Материал в виде суспензий клещей был взят для анализа в лабораториях пунктов серопрофилактики г. Томска, г. Тюмени и г. Колпашево (Томская область), где проводился анализ клещей на присутствие в них возбудителей инфекций. Клещей при поступлении в лабораторию промывали 1 раз в этиловом спирте и 2-3 раза
в растворе Хэнкса, рН 7,2-7,4 с антибиотиками (пенициллина 500 ед./мл и стрептомицина 1000 ед./мл). Каждого клеща помещали в стерильную пластмассовую пробирку для микропроб, опускали ее в жидкий азот на 10-15 секунд, затем содержимое пробирки гомогенизировали пестиком из нержавеющей стали. После чего в пробирку добавляли 0,2 мл раствора Хэнкса с антибиотиками и альбумином. Использовался метод иммуноферментного анализа (ИФА) для определения присутствия в клеще вируса клещевого энцефалита и (или) боррелий иксодово-го клещевого боррелиоза. Кроме того, в ограниченном числе случаев для диагностики наличия в клеще вируса лихорадки Западного Нила была применена полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием набора «РеалБест (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Для выявления специфических последовательностей нуклеиновой кислоты вируса лихорадки Западного Нила использована пара праймеров: WN910F 5'-GGGATCCACACCATGCAGAGAGTTGTG ТТ-3' и WN1493R 5,-CAGCTTACAGCTTCAA CTGCCTTGGATGAGC-3 [18]. Оставшуюся суспензию сохраняли при температуре -40оС и в дальнейшем использовали в цитогенетических экспериментах.
Всего цитогенетическим методом изучено 49 суспензий иксодовых клещей. В 16 случаях в них методом ИФА определено наличие вируса клещевого энцефалита, в 10 - боррелий иксо-дового клещевого боррелиоза, в 5 присутствовали оба инфекционных агента, а относительно 18 в лабораториях пунктов серопрофилактики было получено заключение об отсутствий в теле клеща как вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), так и боррелий иксодового клещевого боррелиоза.
Лимфоциты человека для цитогенетического анализа культивировали стандартно [14]. В экспериментах использована кровь здоровых доноров, ранее не болевших клещевыми инфекциями, не вакцинированных против клещевого энцефалита и не проходивших медицинских процедур с рентгеновским облучением в течение
VOL. 1, № 3
FUNDAMENTAL
AND CLINICAL MEDICINE
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
прошедшего года. Суспензии из клеща в объеме 0,1 мл вносили в 10 мл культуры через 1 сутки от начала культивирования. Приготовление препаратов для хромосомного анализа проводили рутинным методом [16]. Фиксацию культур осуществляли через 1 и 3 суток после введения суспензии. Контролем послужили лимфоциты от 11 здоровых доноров без введения в эти культуры суспензий клещей. Лимфоциты выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция). Культивирование осуществляли в специальных флаконах (около 2*106 клеток/мл), используя среду RPMI-1640 («ПанЭко», Россия) с добавлением антибиотиков (100 мкг/мл стрептомицина и 100 МЕ/мл пенициллина) с инкубацией при 37оС. Пролиферацию стимулировали 10 мкг/мл фи-тогемагглютинина (ФГА) («ПанЭко», Россия). Блокирование делящихся клеток в метафазе осуществляли колхицином в концентрации 0,5 мкг/ мл культуральной смеси. При гипотонической обработке клеток использовали 0,55% раствор хлорида калия. Клетки фиксировали холодным раствором Карнуа (три части абсолютного метилового спирта и одна часть ледяной уксусной кислоты), после чего взвесь клеток переносили на предметные стекла и высушивали феном.
Препараты окрашивали по Романовского-Гимзе. В экспериментальных и интактных культурах в каждом случае анализировали не менее 50 ме-тафаз.
Статистическую обработку осуществляли с использованием пакета статистических программ STATISTICA ^6.0. [12]. Все количественные показатели исследования обрабатывали с применением 1>критерия Стьюдента для независимых выборок. Проведенное нами тестирование закона распределения при помощи критерия Колмогорова-Смирнова не выявило отличий от нормального. Различия сравниваемых результатов (Х±т, где X - выборочное среднее арифметическое, т - ошибка среднего арифметического) считались достоверными при достигнутом уровне значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение
Результаты цитогенетического анализа свидетельствуют о том, что суспензии с микст ин-фицированностью ВКЭ и ИКБ по сравнению с интактным контролем способны индуцировать в условиях культуры лимфоцитов существенное возрастание числа клеток как с аберрациями хромосом, так и с изменениями в числе хромосом (таблица 1).
Время
культи- Суспензии из клещей с Суспензии Интактный
Число клеток вирова- без ВКЭ контроль
цитогенетическими ния с ВКЭ ИКБ ВКЭ+ и И КБ
нарушениями, % суспен- ИКБ
зиями n=16 n=10 n=5 n=18 n=11
Всего клеток с 1 сутки 3,52±0,49** 1,68±0,08** 9,09±1,06** 2,50±0,12** 0,87±0,09
аберрациями хромосом 3 суток 3,59±0,44** 1,76±0,04* 9,64±0,61** 2,70±0,08* 1,11±0,08
с одиночными 1 сутки 3,10±0,24** 1,41±0,37* 6,36±0,59** 1,56±0,09** 0,48±0,01
фрагментами 3 суток 3,39±0,62** 1,59±0,29** 5,39±0,24** 1,48±0,36** 0,41±0,02
с хроматидными 1 сутки 0,42±0,17 0,27±0,18 1,28±0,18** 0,39±0,10 0,24±0,05
обменами 3 суток 1,20±0,10** 0,17±0,11 0,99±0,18** 0,29±0,12 0,29±0,02
с двойными 1 сутки 0,03±0,01 0,04±0,03 0,24±0,21** 0,08±0,06 0,04±0,01
фрагментами 3 суток 0,04±0,02 0,02±0,01 0,78±0,14** 0,02±0,01 0,08±0,04
с хромосомными 1 сутки 0,02±0,01 0,01±0,01 0,03±0,02 0,05±0,03 0,02±0,01
обменами 3 суток 0,03±0,02 - 0,08±0,05 0,11±0,04 0,03±0,01
с моносомиями 1 сутки 0,30±0,11 0,19±0,14 0,48±0,24 0,27±0,04* 0,21±0,11
3 суток 1,12±0,05** 1,76±0,14* 2,33±0,18** 1,29±0,05* 0,32±0,12
с трисомиями 1 сутки 0,09±0,04 0,11±0,09 0,06±0,02 0,19±0,03 0,02±0,04
3 суток 0,51±0,07** 0,08±0,07 1,36±0,11** 0,08±0,05 0,04±0,01
с полиплоидным 1 сутки 0,05±0,07 0,09±0,04 0,09±0,03 0,06±0,04 0,03±0,02
набором хромосом 3 суток 0,04±0,08 0,48±0,10** 1,22±0,09** 0,29±0,07** 0,04±0,02
Всего клеток с 1 сутки 8,92±1,11** 3,55±0,40 12,32±1,56 2,26±0,08** 1,02±0,04
цитогенетическими нарушениями 3 суток 6,76±1,58** 3,20±0,67 13,24±1,46 3,16±0,26** 1,24±0,04
Таблица 1. Число лимфоцитов с хромосомными нарушениями (X ± т) в культурах лимфоцитов после введения суспензий из клещей, инфицированных и не инфицированных ВКЭ и боррелиями -возбудителями ик-содового клещевого боррелиоза
Table 1. Lymphocytes with chromosomal aberrations after incubation with either infected or non-infected suspensions
Примечание: ВКЭ - вирус клещевого энцефалита, ИКБ - боррелии иксодового клещевого боррелиоза. Значимые отличия уровня цитогенетических нарушений при сравнении с интактным контролем отмечены звездочками: одной - при p<0,05, двумя -при p<0,01.
Note: TBEV is for tick-borne encephalitis virus, PB is for Ixodes Tick-Borne Borreliosis, *p < 0.05, **p < 0.01
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
ТОМ 1, № 3
Спектр аберрации не отличался от показателей экспериментов наблюдаемых нами при заражении культур лимфоцитов человека на-тивными штаммами ВКЭ и ИКБ [6, 9]. В то же время, число клеток с цитогенетическими нарушениями существенно различалось в культурах, зафиксированных после введения суспензий через 1 и 3 суток. В первом случае отмечено увеличение только числа клеток с аберрациями хромосом, а через 3 суток существенно повышается также и число анеуплоидных и полиплоидных клеток. При моноинфекции ВКЭ в суспензиях клещей в «зараженных» культурах наблюдалось возрастание количества клеток с одиночными фрагментами. На 3 сутки в наших экспериментах повышалось число клеток с хро-матидными обменами и анеуплоидным набором хромосом. Изменений в числе клеток с хромосомными фрагментами и обменами, а также с полиплоидией в этом случае не зарегистрировано. Известно, что хроматидные разрывы и фрагменты являются наиболее часто встречающимся типом хромосомных аберраций, возникающих под действием различных инфекционных агентов, включая вирусы гриппа, клещевого энцефалита, кори, а также некоторых бактерий - шигелл, сальмонелл и микоплазм [2,11], что объясняется вмешательством инфекционного агента в процессы репликации ДНК или же стимуляцией лизосомальных нуклеаз [11]. Анеуплоидия возникает в результате неправильной сегрегации хроматид хромосом при делении клетки и нарушения распределения наследственного материала между дочерними клетками. Известно, что анеугенными факторами являются множество химических соединений (винбластин, колхицин, гризеофульвин, органические соединения ртути и др.), некоторые инфекционные агенты (вирусы, микобактерии туберкулеза, токсоплазмы), а также ионизирующее излучение [7, 20]. Меньшие, но значимые, изменения в культурах индуцировали суспензии, содержащие боррелии. В этом случае помимо клеток с одиночными фрагментами, мо-носомиями существенно возрастает на 3 сутки и число полиплоидных клеток. Это соответствует результатам исследований, проведенных нами [6] и другими учеными [17] при изучении кариотипа инфицированных ИКБ. Полиплоидия, как известно, может быть следствием эн-доредупликации или блокирования цитокинеза [20]. Многие инфекционные агенты облада-
ют способностью индуцировать эти процессы [2]. Особое внимание привлекают результаты анализа культур с введением суспензий, в которых не были обнаружены ВКЭ и ИКБ. Здесь, хотя и в меньшей степени, чем в других вариантах эксперимента, отмечается возрастание числа клеток с одиночными фрагментами хромосом, а на 3 сутки клетки еще и с моносоми-ями и полиплоидией. Анализ результатов показал существенные отличия в результатах этого эксперимента, поскольку такое повышение было связано в основном с образцами суспензий, полученными из 6 клещей из 18 суспензий этой группы. Выделение их в особую группу позволило установить, что число клеток с хромосомными аберрациями по сравнению с исходным уровнем для этой группы возрастает в 4,5 раз (12,7±1,5%; р<0,01), а с измененным числом хромосом - в 3,2 раза (6,34±1,2%; р<0,01). Проведенное типирование предполагаемого инфекционного агента с использованием ПЦР анализа показало присутствие в суспензиях этих клещей вируса лихорадки Западного Нила. По мнению некоторых ученых [4, 5], течение заболевания, вызванного вирусом лихорадки Западного Нила, протекает практически идентично с клещевым энцефалитом. По-видимому, это связано с генетическим родством этих двух фла-вивирусов [3], но при этом вакцинация против ВКЭ не способствует развитию иммунитета и не защищает человека от инфекции, вызванной ВЗН [19]. Особую группу могут составить пациенты с микст-инфекцией. Поскольку у подвергшихся нападению клеща пациентов ВЗН не определяется, то вполне возможно, что этот вирус присутствует и у лиц с диагнозом клещевой энцефалит и (или) клещевой боррелиоз, что может существенно изменить течение инфекции.
Благодарности. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ и частично РГНФ. Грант РГНФ № 06-15-10190. Грант РФФИ № 16-44-700149
Заключение
Добавление в культуры лимфоцитов здоровых людей суспензий, содержащих ВКЭ и боррелии - возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов, приводит к выраженным класто-генным и анеугенным эффектам. В 6 из 18 исследуемых суспензий, где эти инфекционные агенты не были выявлены, методом ПЦР определено присутствие вируса лихорадки Западно-
VOL. 1, № 3
FUNDAMENTAL
AND CLINICAL MEDICINE
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
го Нила. Введение этих суспензий в культуры лимфоцитов приводило к существенному возрастанию числа клеток с нарушениями в структуре и числе хромосом. Поскольку клещи могут содержать большое количество различных инфекционных агентов, определение которых возможно только в высокоспециализирован-
ных лабораториях, предлагается использовать метод индикации цитогенетических нарушений для определения наличия в напавшем на человека клеще, редко встречаемых инфекционных агентов, способных вызвать у человека заболевание.
Литература / References:
1. Blumkin VM, Zhdanov VN. Impact of viruses on the chromosome apparatus of cell. M.: Medicine, 1973. 246p. Russian (Блюм-кин В.Н., Жданов В.М. Влияние вирусов на хромосомный аппарат клетки. М.: Медицина, 1973. 268 с.)
2. Borovikov VP, Borovikov LP. Statistical analysis and data processing in Windows. M: Filin, 1997. 246 p. Russian (Боровиков В.П., Боровиков Л.П. Статистический анализ и обработка данных в среде «Windows».M.: «Филинъ», 1997. 608 с.)
3. Burke DS, Monath TP. Flaviviruses. In Knipe, D.M. and Howley, P.M. (eds), Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2001, 1043-125 pp.
4. Calisher CH, Karabatsos N. Arbovirus serogroups: definition and geographic distribution. The arboviruses: epidemiology and ecology. Ed. P. Monath. Boca Raton (FL): CRC Press, 1988; 1: 19-57.
5. Dekonenko EP, Larichev VF, Butenko AM, Zorinev AB, Malyshev NA. Severe form of encephalitis caused by West Nile virus. Neurological journal. 2002;7 (6): 19-22. Russian (Деконенко Е.П., Ларичев В.Ф., Бутенко А.М., Зоринев А.Б., Малышев Н.А. Тяжелая форма энцефаломиелита, вызванная вирусом Западного Нила // Неврологический журнал. 2002. Т.7, №6. C.19-22.)
6. Ilyinskikh IN, Ilyinskikh EN, Semenov AG, Cherednikova EA, Puchkova N. Cytogenetic status and 9 chromosome polymorphism in patients with Lyme disease. Herald of the Novosibirsk State University. Biology and Cinical Medicine. 2012;10 (3): 87-94. Russian (Ильинских Е.Н., Ильинских И.Н., Семенов А.Г., Чередникова Е.А., Пучкова Н.Н. Цитогенетический статус и полиморфизм хромосомы 9 у больных с иксодовым клещевым боррелиозом // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. 2012. Т. 10. Вып. 3. С. 87-94.)
7. Ilyinskikh NN, Choinzonov EL, Lebedev IN, Yasikov EG, Melnikov AA, Vasiliev SA, Ilyinskikh EN. Cytogenetic effects of radiation and chemical effects on humans. Tomsk: National Research Tomsk Polytechnic University, 2014: 420. Russian (Ильинских Н.Н., Чойнзонов Е.Л., Лебедев И.Н., Язиков Е.Г., Мельников А.А., Васильев С.А., Ильинских Е.Н. Цитогенетические последствия радиационных и химических воздействий на человека. Томск: Изд-во Национальный исследовательский Томский политехнический университет, 2014. 420 с.)
8. Ilyinskikh IN, Novitsky VV, Ilyinskikh EN, Ilyinskikh NN,Tkachenko SB. Infectious karyopathology. Tomsk: Tomsk State University Publishing House, 2005. 168 p. Russian (Ильинских Н.Н., Новицкий В.В, Ильинских Е.Н., Ильинских И.Н., Ткаченко С.Б. Инфекционная кариопатология. Томск: Изд-во ТГУ 2005. 168 с.)
9. Ilyinskikh NN, Zagromov EJ, Lepekhin AV. The analysis of some indices of immune response, DNA repair, and micronuclei content in cells from tick-borne encephalitis patients. Acta Virol. 1990; 34 (6): 554-562.
10. Ilyinskikh NN, Ilyinskikh IN. Effects of virus of tick-borne encephalitis on the chromosome apparatus of human cells. Cytology and Genetics. 1976; 10 (4): 331-333. Russian (Ильинских Н.Н., Ильинских И.Н. Влияние вируса клещевого энцефалита на хромосомный аппарат клеток человека // Цитология и генетика. 1976. Т.10, №4. С. 331-333).
11. Ilyinskikh NN, Ilyinskikh IN, Ilyinskikh EN. Infectious mutagenesis:cytogenetic effects in human and animal cells as well as immunoreactivity induced by viruses, bacteria and helminthes. Saarbrucken: LAP LAMBERT Academic Publishing, 2012. 224 р.
12. SAS/STAT User's Guide, Version 6, Fourth Edition, Volume 2, Cary, NC: SAS Institute Inc., 1989. 846 pp.
13. Ivanova NV. Role of small mammals in areas of natural infection in the anthropogenically transformed the territory Southeast of West Siberia. Abstract of PhD Thesis. Tomsk, 2009. 21p. Russian (Иванова Н.В. Роль мелких млекопитающих в очагах природных инфекций на антропогенно трансформированной территории юго-востока Западной Сибири: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Томск, 2009. 21c.)
14. Moorhead PS, Nowel PC, Mellman WJ, BattipsDM, Hungerford DA. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp. Cell Res. 1960; 20: 613-616.
15. Moskvitina NS, Romanenko VN, Ternovoy VA, Ivanova NV, Protopopova EV, Kravchenko LB et al. Detection of West Nile Fever virus and its genotyping in ixodid ticks (Parasitiformes:Ixodidae) in Tomsk and its suburbs. Parasitology. 2008; 42 (3): 210-225. Russian (Москвитина Н.С., Романенко В.Н., Терновой В.А., Иванова Н.В., Протопопова Е.В., Кравченко Л.Б. с соавт. Выявление вируса Западного Нила и его генотипирование в иксодовых клещах (Parasitiformes: Ixodidae) в Томске и его пригородах // Паразитология. 2008. Т.42, №3. С. 210-225).
16. Nichols WW. Relationship of viruses, chromosomes and carcinogenesis. Hereditas. 1963; 50: 53-80.
17. Pirogov NP, Novitsky VV, Hlusova MYu, Voronkov OV, Karpova M.R, Lukasheva LV. Cytogenetic status and phenotypic features of peripheral blood lymphocytes in patients with tick-borne ixodid borreliosis. The Siberian Bulletin of Medicine. 2005;4 (3): 4348. Russian (Пирогова Н.П., Новицкий В.В., Хлусова М.Ю., Воронкова О.В., Карпова М.Р., Лукашева Л.В. Цитогенетический статус и фенотипические свойства лимфоцитов периферической крови у больных иксодовым клещевым боррелиозом // Бюллетень сибирской медицины. 2005. Т.4, №3. C. 43-48).
