CC BY
24
HayKOBMM BiCHMK ^tBiBCtKoro Ha^OHa^tHoro yHiBepcMTeTy
BeTepMHapHoi Megw^HM Ta öioTexHO^oriw iMem C.3. I^M^Koro
Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies
ISSN 2519-268X print doi: 10.15421/nvlvet8527
ISSN 2518-1327 online http://nvlvet.com.ua/
UDC [679.872+ 579.873. 1] : 579.222.3 : 615.331
Non-waste biotechnology of obtaining a symbiotic and a metabolite on the basis of Bifidobacterium longum - Ya 3 and Propionibacterium shermanii - 4
L. Krupytska, L. Kaprelyants, O. Kylymenchuk, T. Velichko
Odessa National Academy of Food Technologies, Odessa, Ukraine
Krupytska, L., Kaprelyants, L., Kylymenchuk, O., & Velichko, T. (2018). Non-waste biotechnology of obtaining a symbiotic and a metabolite on the basis of Bifidobacterium longum - Ya 3 and Propionibacterium shermanii - 4. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. 20(85), 148-154. doi: 10.15421/nvlvet8527
In order to eliminate dysbiotic violations of microbiota of the human gastrointestinal tract probiotics are used. However, in recent years data has been accumulated on the reduction of the effectiveness of classical probiotics, especially against antibiotic therapy, so a promising group of probiotics of a metabolic type is gaining popularity. Metabiotics contain metabolic products or structural components of probiotic microorganisms. The purpose of experimental work was to develop a technology of non-waste production using a culture fluid of probiotic microorganisms as raw material for the creation of a cell-free probiotic. The objects of the study were cultures of microorganisms of the Museum of the Department of Biochemistry, Microbiology and Nutrition Physiology ONAFT Bifidobacterium longum - Ya 3, Propionibacterium shermanii - 4, the culture fluid of these probiotic strains. Subject of research - structural elements of metabolic activity of probiotic microorganisms, organoleptic, physico-chemical and microbiological indices. After co-cultivating B. longum -1 3 + P. shermanii-PS 4 in a lactose medium with the addition of soy serum at a temperature of (34 ± 1) °C for 24 hours with a titre of at least 1 1010 CFU/cm3, a culture medium supernatant was obtained by centrifugation at 8000 rpm for 20 minutes and further filtration because of bacterial filters in aseptic conditions. The bifidogenic growth stimulator was purified from the microbial biomass residue by vacuum filtration using bacterial filters (Millipore, 0.22 pm). Its determination was carried out by gas-liquid chromatography using the GC-16A «Shimadzu» (Japan) gas chromatograph with the possibility of temperature programming up to 330 °C, flame-ionization detector and software «GC solution». The content of 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid in the supernatant of the consortium Bifidobacterium longum - Ya 3, Propionibacterium shermanii - 4 in the amount of 4.1 mg/liter was determined. The principle of technological schemes of non-waste production of biologically active additives based on the classical and metabolic probiotic developed.
Key words: propionic acid bacteria, bifidobacteria, supernatant, metabolites, probiotic.
Безввдходна бттехнолоНя отримання симбштика i метабттика на 0CH0Bi Bifidobacterium longum - Я 3 та Propionibacterium shermanii - 4
Л.О. Крупицька, Л.В. Капрельянц, О.О. Килименчук, Т.О. Велiчко
Одеська нацюнальна академiя харчових технологт, м. Одеса, Украша
Для усунення дисбютичних порушень мтробюти шлунково-кишкового тракту людини використовують препарти пробютики. Однак в остант роки накопичуються дат про зниження ефективностi класичних пробютитв, особливо на фот антибютикоте-рапп, тому популярностi набувае перспективна група пробютитв метаболтного типу. Метабютики мютять продукти мета-болiзму чи структупШ компоненти пробютичних мiкроорганiзмiв. Метою експериментальног роботи стала розробка технологи безвiдходного виробництва, використовуючи культуральну рiдину пробютичних мiкроорганiзмiв як сировину для створення без-клтинного пробютика. Об'екти до^дження - культури мiкроорганiзмiв музею кафедри бюхтй, мжробюлоги i фiзиологы харчу-вання ОНАХТBifidobacterium longum - Я 3, Propionibacterium shermanii - 4, культуральнарiдина зазначених пробютичних штамiв. Предмет до^дження - структурн елементи метаболiчно'i активностi пробютичних мiкроорганiзмiв, органолептичт, фiзико-хiмiчнi i мiкробiологiчнi показники. Пкля сумюного культивування B. longum - Я 3 + P. Shermanii - PS 4 на лактозному середовищi
Article info
Received 19.02.2018 Received in revisedform
12.03.2018 Accepted 16.03.2018
Odessa National Academy of Food Technologies, Kanatna Str., 112, Odesa, 65039, Ukraine. Tel. +38-097-503-20-73 E-mail: [email protected]
з додаванням сосвог сироватки за температури (34 ± 1) °С протягом 24 год з титром не менше 1 1010КУО/см3, отримували супе-рнатант культуральног рiдини шляхом центрифугування при 8000 об/хв протягом 20 хв i подальшого фтьтрування через бактерi-альт фтьтри в асептичних умовах. Бiфiдогенний стимулятор росту очищували вiд залштв мтробног бюмаси за допомогою вакуум-фтьтрацп iз застосуванням бактерiальних фiльтрiв (Millipore, 0,22 мкм). Його визначення проводили за методом газово-рiдинно'i хроматографа з використання газового хроматографа GC-16A «Shimadzu», Япотя з можливктю програмування температури до 330 °С, полум 'яно-ютзацтним детектором i програмним забезпеченням «GC solution». Визначено вмкт 1,4-дигидроксi-2-нафто'гново'г кислоти у супернатантi консорцiуму Bifidobacterium longum - Я 3, Propionibacterium shermanii - 4 у кiлькостi 4,1 мг/л. Розроблено принципот технологiчнi схеми безвiдходного виробництва бюлогшо активних добавок на основi класичного та метаболтного пробютика.
Ключовi слова: протоновокиmi бактерш, бiфiдобактерii, супернатант, метаболти, пробютик.
Вступ
Промислове виробництво збалансованих харчових продуктов завжди було одшею з найважливших проблем людства. Людина i навколишне середовище представляють едину еколопчну систему, яка знахо-диться у сташ бюлопчно! рiвноваги. Нормальна мш-робюта шлунково-кишкового тракту (ШКТ) людини представляе мшробний пейзаж сформований в проце-с тривало! еволюцп.
Складна мшроеколопчна система оргашзму людини представлена станом динашчно! рiвноваги, яке визначаеться, з одного боку, його фiзiологiчними та iмунологiчними особливостями, а з шшого - шльшс-ним та яшсним складом мшробних асоцiацiй. На rai рiзкого зниження популяцшного рiвня бiфiдобактерiй i лактобацил, зростае кшьшсть умовно-патогенних i патогенних мiкроорганiзмiв, що сприяе розвитку дис-бактерiозу. У зв'язку з цим, пошук нових засобiв профiлактики для корекцй' дисбютичних порушень набувае актуальностi. Сьогоднi препарти пробiотики набули широкого застосування у клшчнш практицi з метою корекцй дисбактерiозiв i вiдновлення кшьшс-ного та яшсного складу мiкробiоти ШКТ людини. Також особливу увагу займають функцiональнi про-бiотичнi продукти, яш пiдтримуеть мiкроекологiчну рiвновагу у ШКТ. В цьому аспектi симбiотики грають важливу роль. Синбiотик - це функцюнальнийхарчо-вий продукт мiкробiологiчного походження, який е комбiнацiею пробiотичних мiкроорганiзмiв та пребю-тичних компонентiв.
Пробютики - це живi мiкроорганiзми, використання яких в необхiднiй шлькосп нормалiзують киш-кову мiкробiоту та мають лiкувально профiлактичну дiю на оргашзм людини (FAO/WHO, 2002).
Сьогодш пробiотики подiляють на п'ять основних поколшь: I поколiння - класичш монокомпонентнi пробiотики, до яких вщносять рiдкi або сухi препара-ти, що складаються з одного штаму мiкроорганiзмiв (<^фщумбактерин», <^фвдумбактерин - форте); II поколшня - полiкомпонентнi препарати (симбюти-к1в), що включають рiзнi штами мiкроорганiзмiв або кiлька культур бактерш-симбюнпв (<^фжол», «Ль некс», «Пробютжс», «Ацвдофшс» i iн.); III поколшня - антогошсти, що самоелiмiнуються, яш заснованi на використаннi неспецифiчних для людини мшроорга-нiзми i складаються з споровийх бактерш i сахаромь цетiв («Споробактерп», «Биоспорин», «Бактисубтил», «Ентерол»); IV поколiння - комбiнованi препарати (синбютики), що мiстять мiкроорганiзми i основу, яка несе додаткове функцюнальне навантаження, тобто
речовини, що сприяють !х росту, розмноження i мета-бол!чно1 активностi («Ламшолакт», «Б!фшор», «Би-филиз», «Аципол», «Малюк»)^ поколiння - безкль тиннi пробiотики, що мютять продукти обмiну автох-тонно! микробюти ШКТ («Хшак-форте») (Krysenko et al., 2010).
Позитивний ефект пробiотикiв, навiть при трива-лому застосуваннi, нередко носить тимчасовий характер, а часом i повнiстю вiдсутнiй.
Результи даних (Di Caro et al., 2005; Chang et al., 2009) сввдчать про те, що не ва пробютичш бактерп безпечнi, навпъ якщо вони ввдносяться до бактерш родiв Lactobacillus або Bifidobacterium i не мають генiв патогенностi. З показнишв медичних обстежень можна зробити висновок, що молочнокисл! бактерп i навiть б!фщобактерп, як1 використовуються у вигляад пробiотикiв, iнодi зв'язуються з опортушстичними iнфекцiями людини, особливо у пащенпв, що прохо-дять курс антибютикотерапп, i у хворих з важким iмунодефiцитом (Yuan et al., 2008; Chang et al., 2009).
В останш роки виявилося, що горизонтальний перенос генiв може ввдбуватися м1ж молочно-кислими бактерiй i кишковими бактерiями, а також в межах одного роду молочнокислих бактерш (Di Caro et al., 2005; Clayton et al., 2009; Bourdichon et al., 2012).
Доведено, що мшрооргашзми-пробютики i автох-тонш мшрооргашзми можуть як стимулювати, так i пригнiчувати ростовi i антимiкробнi властивосп один одного. За результатами дослщженнь (Semenov, 2011) пробiотичнi бактерп подiляють на: бiосумiснi з домь нантною мжробютою iндивiдуума i здатнi пригшчу-вати рiст патогенiв; небiосумiснi з нормобютой, але здатнi стимулювати и захиснi властивостi i володiють антагошзмом до патогенних i умовно-патогенних мiкроорганiзмiв; небiосумiснi, здатнi пригнiчувати антимiкробнi властивосп автохтонного мiкробiмома ШКТ i володшть слабкою антагонiстичною актившс-тю до патогеншв.
Для визначення бiосумiсностi препарапв-пробiотикiв з автохтоннош мiкробiотою необхщно проводити ряд дослвджень для конкретного шдиввду-ума, або розробляти аутопробютики, що е досить складним процесом.
У зв'язку з цим, фахiвцi покладають велик! надп на групу метаболiтних про- i синбютишв, як1 в пор!в-нянш з клиинною формою бшьш стабiльнi при зберь ганнi, не знижують свою бюлопчну актившсть при застосуванш на rai л!кувального курсу антибютишв, не спричиняють поб!чних дш на оргашзм людини при гострих запальних процесах i хрошчних захворюван-нях, на ввдшну в!д живих мжрооргашзм!в (Di Caro et
al., 2005; Chang et al., 2009; Bomba et al., 2012; Bourdi-chon et al., 2012).
Pi3Hi пробютичш штами можуть стати джерелом сотень низькомолекулярних бiологiчно активних речовин (НБАВ): бактерiоцинiв (i шших антимшроб-них речовин), iнших оргашчних кислот, бюсурфакта-нтiв, полiсахаридiв, пенпдоглшашв, тейхоевих кислот, лiпо- i глшопротещв, вiтамiнiв, антиоксидантiв, нуклешових кислот, рiзних бiлкiв, ферментiв i лекти-нiв, пептидiв рiзноl активностi, амшокислот, факторiв росту i коагуляцп, захисних речовин i 1х iндукторiв в клггинах людини, сигнальних молекул, плазмалогешв, кофакторiв (Goldfine, 2010; Holmes et al., 2011; Ishikawa et al., 2011).
У досладжент (Krupytska and Kaprelyants, 2016; Krupytska et al., 2017) наведет дат щодо вивчення жирнокислотного складу заквасок з включенням Pro-pioniobacterium shermani - 4. За допоногою ВЕРХ всатановлено, що у заквасщ симбiотичного консорць уму В. longum-Я 3 i P. Shermanii - 4 сума ненасичених жирних кислот (78,36%), була вищою, шж в iнших дослвджуваних зразках. Кшьюстъ лшолево1 кислоти становило 23,99%. Результати цьго дослвдження до-водять перспектившсть виробництва бiологiчно активних добавок на основi сумiсного культивирования бiфiдо- i пропiоновокислих бактерий з високим вмю-тои есенцiальних жирних кислот.
Ц групи НБАВ, видiленi з симбютичних чи пробь отичних мiкроорганiзмiв або 1х культурально! рiдини, можуть використовуватися для виробництва харчових добавок, продукпв харчування i лiкарських препара-тiв з метою профiлактики i лiкування хронiчних за-хворювань людини.
Культуральна рцщна - це продукт ввдходу в тра-дицiйнiй технологи виробництва бактерiальних пре-паратiв або концентратiв. Вона мютить в собi метаболита продукти життeдiяльностi пробiотичних бактерi i може бути використана, як основа безклтшннох фо-рми пробiотика. Н утилiзацiя, як вiдходу виробництва, призводить до значних економiчних втрат. Тому роз-робка i виробництво безклгганних пробiотикiв е актуальною задачею бюхехнолопчного процесу, як одинм з етатв створення безвiдходного виробництва бакте-рiальних препаратiв - це напрямок е iнновацiйним.
У попередньму дослвджеш (Krupytska et al., 2017), яке присвячено вивченню антагошстично1 активностi вторинних метаболтв пропiоновокислих бактерiй, доведено, що культуральа рiдина штаму P.shermanii -4, яку отримали при культивуваннй на лактозному середовищi з додавання 3% соево! сироватки за тем-ператури (30 ± 1) °С з титром не менше 1 109 КУО/см3, здатна стимулювати рют бiфiдобакте-рiй, а також встановлено, що використання мшмаль-но! концентрацп у кiлькостi 2% супернатанту культурально! рщини пригнiчували рiст уах умовно-патогенних мiкроорганiзмiв (Escherichia coli, Staphylococcus aureus ОНУ-223, Bacillus cereus ОНУ-67).
Це сввдчить, що ефектившсть пробiотичних пре-паратiв зумовлена продуктами життедiяльностi мш-роорганiзмiв, тобто екзометаболгтами. У зв'язку з цим, актуальним завданням бютехнологп е розробка технологш видiлення з безклiтинних фшьтрапв або
супернатанпв бюлопчно активних екзометаболтв для створення пробютишв метаболггаого типу. Новий метаболггний пробютик не м1стить живих, чи мертвих клгтин бактерш. Його д1я базуеться на вщновленш власно! мжрофлори шляхом стимуляцй' та нормал1за-цп облпатних представник1в ШКТ людини.
Лггературш джерела свiдчать, що прошоновоки^ бактерiï е продуцентантами бiфiдогенного ростового фактору невуглеводноï природи, а саме 1,4-пдроксь2-нафтойноï кислоти (Kouya et al., 2007; Kaprelyants and Krupytska, 2017).
Метою експериментально! роботи довести наяв-нiсть 1,4-пдроксь2-нафтойно! кислоти у культураль-нiй рiдинi пробютичного консорцiуму та розробити технологiю безвыходного виробництва, використо-вуючи культуральну рвдину як сировину для створення метаболггаого пробiотика.
Матерiал та методи дослщжень
Для проведення експериментально! роботи викори-стовували культури мiкроорганiзмiв музею кафедри бюх1мп, мжробюлоги i фiзиологiï харчування ОНАХТ Bifidobacterium longum - Я 3, Propionibacterium shermanii - 4. Культивування проводили на лактозному середовищi з додаванням 3 % соевоï сироватки (молочна сироватка; пептон; цитрат натрш; калiй; натрш фосфорнокислий; аскорбiнова кислота; соева сироватка; вода).
Шсля одночасного внесення бактерiальних шоку-ляпв B. longum - Я 3 i P. Shermanii - 4 у сшввцщо-шенш 1:1, проводили сумюне культивування за тем-ператури (34 ± 1) °С протягом 24 год з титром не менше 1 1010 КУО/см3. Супернатант культурально1 рвдини консорцiуму отримали за допомогою центри-фугування при 8000 об/хв протягом 20 хв i подальшо-го фшьтрування через бактерiальнi фттри (Millipore, 0,22 мкм) в асептичних умовах.
Бiфiдогенний стимулятор росту, 1,4-пдрока-2-нафтоïнову кислоту (DHNA), визначали за допомогою високоефективно! газорiдинноï хроматографiï з використання газового хроматографа GC-16A «Shimadzu» (Японiя) з можливiстю програмування температури до 330 °С, полум'яно-юшзацшним детектором i про-грамним забезпеченням «GC solutions». Для подiлу використовували капiлярну колонку THERMO TR-FAME (30 mm x 0,25 mm ID x 0,25 um film) з темпера-турним градiентом вщ 70 до 230 °С. Нерухома фаза -70% Cyanopropyl (equip) Polysiphenylene-siloxane. Рухома фаза - гелш, швидк1сть потоку газу - 1 мл/хв. Температура iнжектора i детектора дорiвнювала 280 °С i 260 °С, вiдповiдно. Идентифiкацiю DHNA проводили шляхом порiвняння часу витримки речо-вин, що визначали з часом витримки стандартного маркера 1,4-пдрока-2-нафтойно! кислоти.
Мжробюлопчну оцiнку кiлькостi життездатних клiтин проводили за допомогою методу 10 кратних розведень на полурвдкому соеволактозному середо-вищi (Kaprelyants et al., 2016) та завдяки мжроскопш-ванню експериметальних зразк1в.
Результати та ïx обговорення
Ha ocrorn лiтepaтypниx дaниx тa влacниx дocлi-джeнь пpийнятo дo yвaги кiлькicть мeтaбoлiтiв, щo бyлo пpoдyкoвaнo тa ix бioxiмiчнy aктивнicть для oтpимaння мeтaбoлiтнoгo пpeпapaтy, oтpимaнo гайш-pcпeктивнiший вapiaнт - кyльтypaньнy рщину тонто-pцiyмy B. longum - Я З i P. Shermanii - 4. Пюля cyмi-сного культивування В. longum - Я 3 i Р. Shermanii -
Прнго ту ванна середошща ЕулынЕування
дняконсорщуму В. bngum-Я 3 та P. shenncmii- 4
(Т=121 ;С протягал 20 хентнн)
I
Озюлодження середовшца культнвуЕання до 34 "С
Внесения 5% добокм культур h 3. longum -ЯЗ tiP. shenrumii -
у стввинпшент L:L вр1вннх об'емах +
КультнЕування: при 34 °С: протягом 24 годнн
4 зa тeмпepaтypи (З4 ± 1) °С пpoтягoм 24 гoд пpoвo-дили пiдpaxyнoк життeздaтниx клiтин кoнcopцiyмy. Kiлькicть клтгин B. longum - Я З y кoнcopцiyмi cтaнoви-
лa 4 1010 KУО/cм3, a P. Shermanii - 4 - 4 1010 KyoW. Пicля вiддiлeння кyльтypaльнoï рвдини, бaктepiaльнa мaca кoнcopцiyмy B. longum - Я З i P. Shermanii - 4 cxana пpoбioтичнoю ocнoвoю клacичнoгo cинбioтикa (pиc. 1).
Центрнфугування прн 10 ООО оо.хв.: ЦЮТЯГОМ 15 ХБИШН
I
Вщокремлеш Ьюмаса .Щоф ¡льне Ежушування
.+, Видал ення супернаташу
(1:1)
Захнсне середовшце (молоко, сахароза, желатоза)
Гспоенй препарат
Рис. 1. Пpинципoвa тexнoлoгiчнa cxeмa oтpимaння cинбioтикa
У якocтi пpeбioтичнoï чacтини виcтyпaлa coeвa ст-poвaткa, яга вxoдилa дo cклaдy cepeдoвищa культиву-вaння Сoeвa cиpoвaткa бaгaтa га coeвi oлiгocaxapиди (a c^e ra paфiнoзy тa cтaxioзy), якi вoлoдiють виpa-жeними пpeбioтичними eфeктaми вyглeвoднoï ^^o-ди.
Пicля видaлeння cyпepнaтaнтy, бioмacy стмбюти-чнoгo кoнcopцiyмy B.longum - Я 3 тa P. shermanii - 4 pecycпeндyвaли зaxиcним cepeдoвищeм, якe мicтилo нacтyпнi кoмпoнeнти, %: caxapoзy - 50, жeлaтoзy - 25, мoлoкo - 25.
Виcyшyвaння cyмiшi пpoвoдили iз пoпepeднiм зa-мopoжyвaнням зa тeмпepaтypи -20 °С пpoтягoм 12 гoдин. Чepeз 8 гoдин вiд пoчaткy зaмopoзки тeм-пepaтypy знижyвaли дo -З0 °С. Для oтpимaння cyxoгo пopoшкoпoдiбнoгo пpoдyктy iз зaлишкoм вoлoги 5%, cyблiмaцiю пpoвoдили пpoтягoм 20-24 годин з пoдa-льшим тaблeтyвaнням cyмiшi.
Для oтpимaння тaблeтoвaнoï фopми викopиcтoвy-вaли гiдpaлiвтичнy мaшинy тaблeтyвaння мeтoдoм пpямoгo фacyвaння iз тиcкoм З0 МШ тa poзiгpiвoм мaтpицi дo 45 °С.
Гoтoвий пpeпapaт мютив нacтyпнy кiлькicть ^o-бioтичниx клгган: B. longum - Я 3 - 4 1010 KУО/cм З
P. shermani - 4 - З 10 KУО/cм . Стopoнньoï мiкpoф-лopи нe виявлeнo.
Отpимaнa бioлoгiчнo aктивнa дoбaвкa xapara^ep^ зyвaлacь пopoшкoпoдiбнoю cтpyктypoю бeжeвoгo кoльopy, cпeцифiчним cмaкoм тa зaпaxoм.
Для вилyчeння мeтaбoлiтниx i клiтинниx фpaкцiй мiкpoopгaнiзмiв викopиcтoвyють три oмнoвнi мeтoди: цeнтpифyгyвaння чи ocaджeння з пocлiдyючим вщдь лeнням cyпepнaтaнтy; yльтaфiльтpaцiя, якa дoзвoляe poздiлити низькo- тa виcoкoмoлeкyляpнi cпoлyки; гiдpoлiз. Ha нaш пoгляд, paцioнaльнiшe викopиcтoвy-вaти пpoцec yльтpaфiльтpaцii, ora^ra цeй мeтoд дoзвoляe oтpимaти в м^гк^ yмoвax мaкcимaльнo cкoцeнтpoвaнy бioмacy i yльтpaфiльтpaт для oтpимaн-ня мeтaбoлiтнoгo пpeпapaтy.
Вiддiлeнy кyльтypaльнy рщину кoнcopцiyмy B. longum - Я З i P. Shermanii - 4 пюля oчищeння фiльтpaцieю викopиcтoвyвaли для визнaчeння DHNA зa дoпoмoгoю ВЕРХ. Идeнтифiкaцiю DHNA пpoвoди-ли шляxoм пopiвняння 4acy витримки peчoвин, щo визнaчaли з чacoм витримки cтaндapтнoгo мapкepa 1,4-гiдpoкci-2-нaфтoйнoï киcлoти. Був зapeecтpoвaний пiк при yтpимaннi 4acy нa 25,8 xв (pиc. 2).
In»«п <и10.000>
S.OO
а оо
0.00 S.00 10.00 1S.OO 20.00 2S.00
Retention time (min) Рис. 2. 1дентиф1кащя DHNA у супернатанп P. shermanii - 4
Таким чином було доведено, що здатшсть прошо-новокислих бактерiй стимулювали рiст клiтин бiфiдo-бактерiй, здiйснюeться завдяки наявнoстi у культура-льнiй рiдинi DHNA.
DHNA е попередником менахiнoну (вiтамiн K2) та за лиературними джерелами (Kouya et al., 2007; Kaprelyants and Krupytska, 2017) е найбiльш ввдповь дальним за стимуляцш росту бiфiдoбактерiй. Цiкавo ввдзначити, що DHNA мае позитивш ефекти не тiльки для бiфiдoбактерiй, а й для людини. У дoслiдженнi (Okada et al., 2006), автори поввдомляють, що DHNA
Прнготування середовиша з додав анняи 3 % соево! сиров аил
I
Стерн Л13 ащ ¡я середовнща культивув ання (1 атм, 30 хв)
здшснюе вiднoвлення мiкрoбioценoзу товсто! кишки не тшьки шляхом балансування мiкрoбioти кишечника, але i шляхом придушення шфшьтрацп лiмфoцитiв шляхом ввдновлення молекули адгезп слизово! оболо-нки 1 (MAdCAM-1).
Отриманi експериментальнi данi свiдчать про до-цiльнiсть застосування супернатанта культурально! рвдини P. shermanii - 4 для створення прoбioтика метаболггного типу.
На рис. 3 представлена принципова технoлoгiчна схема виробництва пробютика метабoлiтнoгo типу.
Охолодження середов нща жультнв ув ан н я до 34 "С
I
Внесения 5% пставного матер!алу В. 1огщшп—ЯЗ та Р зкеппапп - 4 у сшввщношенш 1:1 Ер]вннх объемах
Кушьтнвувзння, при 34 "С. протягол 24 г одни
4
Цешрифугуванняпри 5 ООО об/хв^ __Вщцшеннл бшмасн
протягом 20 хвилнн кл]тнн ввд супертатанту
+
О-иернатант з продуктами мегабсипзму +
Ф1 льтрац ¡я суп ери атанту з внкорнстанням ыембранн \lillipore, 0,22 мкм
Пастер1зац1я протягои ЗОхв
затктературн 70 "С + '
Заморозжування при -20 °С протягом 12 годин
Люфшьне^внсушування Таблегування
(Т= 34С,т =-20год,= 2611а, п= 300об/хв}) (Т= 45С,т=-20год, р = ЗОПа)
Рис. 3. Принципова технолопчна схема отримання пробiотика метаболiтного типу
Отриманий супернатант i3 вмстом 6,0 ... 6,2% сухих речовин, у тому чист 1,4-дигидроксi-2-нафтоiнова кислота у кшькосп 0,07% (4,1 мг/л), пастеризували за темпе-ратури 70 °С протягом 30 хв за для усунення сторонньо! умовнопатогенно! мшробюти.
Висушування сумiшi проводили i3 попередшм за-морожуванням, яке проводили за температури -20 °С протягом 12 годин. Через 8 годин вщ початку заморозки температуру знижували до -30 °С. Для отриман-ня сухого порошкоподiбного продукту iз залишком вологи 5%, сублiмацiю проводять протягом 20-24 годин з подальшим таблетуванням сумiшi.
Для отримання таблетовано! форми використову-вали метод прямого фасування iз тиском 30МПа та розiгрiвом матрицi до 45 °С.
Отриманий пробiотик метаболiтного типу харак-теризувся порошкоподiбною структурою бежевого кольору, специфiчним смаком та запахом, стороньо! мiкрофлори не виявлено.
Висновки
У результата проведенних дослiдiв, доведена здат-нiсть P. shermanii - 4 стимулювати прирiст бiомаси бiфiдобактерiй завдяки наявностi у культуральнiй рiдинi 1,4-дтдрока-2-нафто!ново! кислоти. За допо-ногою ВЕРХ було визначено вмют 1,4-дигидроксь2-нафто!ново! кислоти у супернатантi консорцiуму у кшькосп 4,1 мг/л.
На основi експериментальних даних рекомендовано використовувати супернатант пробютичного кон-сорцiуму B. longum - Я 3 i P. shermanii - 4 як для створення пробютика метаболiтного типу, так i для конструювання полштамового синбiотика, викорис-товуючи DHNA як пребютик не вуглеводно! природи.
Розроблено принциповi технологiчнi схеми виро-ництва синбютика та метаболiтного побiотика, що дало змогу теоритично сторити безввдходну бютехно-логiю виробництва нових бiокоректорiв. Отриманi дieтичнi добавки за органолептичними та фiзико-хiмiчними показниками мали порошкоподiбну структуру, специфiчний смак та запах. За мшробюлопчни-ми показниками синбютик мiстить B. longum - Я 3 у
10 3
кшькосп 4^ 10 КУО/см P. shermanii - 4 -
10 3
310 КУО/см , сторонньо! мжробюти не вiявлено; пробютик метаболiтного типу мютить 1,4-дигидроксь 2-нафто!ново! кислоти у кшькосп 4,1 мг/л i не мютить пробiотичних клiтин та будь-яко! умовнопатогенно! мiкробiоти.
Перспектив подальших до^джень. Подальшi дослщження будуть присвяченi вивченню мжробюло-гiчних та органолептичних показнишв у процесi збе-рiгання в умовах холодильно! та морозильно! камерах, а також заплановано провести дослвдження «in vitro», якi моделюють виживання бiфiдо- i протоно-вокислих бактерiй в умовах, що iмiтують шлунково-кишковий тракт людини (рН 2 та при дп 40% жовчГ).
References
Bomba, A., Brandeburova, A., Ricanyova, J., Strojny, L., Chmelarova, A., Szabadosova, V., et al. (2012). The role of probiotics and natural bioactive compounds in modulation of the common molecular pathways in pathogenesis of atherosclerosis and cancer. Biologia. 67, 1-13. doi: 10.2478/s11756-011-0155-6.
Bourdichon, F., Berger, B., Casaregola, S, Farrokh, C., Frisvad, J.C. & Gerds, M.L. (2012). Safety Demonstration of Microbial Food Cultures in Fermented Food Products. Bulletin of the International Dairy Federation, 455-458.
Chang, G., Shi, Y., Le, G., Xu, Z., Sun, J., Li, J., et al. (2009). Effects of Lactobacillus plantarum of genes expression pattern in mice jejunal Peyer's patches. Cell Immunol. 258, 1-8. doi: 10.1016/j.cellimm.2009.02.005.
Clayton, T.A., Baker, D., Lindon, J.C., Everett, J.R. & Nicholson, J.K. (2009). Pharmacometabonomic identification of a significant host-microbiome metabolic interaction affecting human drug metabolism. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 14728-14733. doi: 10.1073/pnas.0904489106.
Di Caro, S., Tao, H., Grillo, A., Elia, C., Gasbarrini, G., & Sepulveda, A.R, (2005). Effects of Lactobacillus GG on gene expression pattern in small bowel mucosa. Dig Liver Dis. 37, 320-9. doi: 10.1016/j.dld.2004.12.008.
FAO/WHO (2002). Join FAO/WHO Working group Guidelines for the Evolutions of Probiotics in Foods. London. Ontario.Canada. 30.
Goldfine, H. (2010). The appearance, disappearance and reappearance of plasmalogens in evolution. Prog Lipid Res. 49, 493-498. doi: 10.1016/j.plipres.2010.07.003.
Holmes, E., Li, J.V., Athanasiou, T., Ashrafian, H. & Nicholson, J.K. (2011). Understanding the role of gut microbiome-host metabolic signal disruption in health and disease. Trends Micobiol. 19, 349-59. doi: 10.1016/j.tim.2011.05.006.
Ishikawa, K., Handa, N., Sears, L., Raleigh, E.A. & Ko-bayashi, I. (2011). Cleavage of a model DNA replication fork by a methyl-specific endonuclease. Nucl Acids Res. 39, 5489-5498. doi: 10.1093/nar/gkr153.
Kaprelyants, L.V., Trufkati, L.V. & Krupytska L.O. (2016). Pozhyvne seredovyshche dlya pidrakhunku kilkosti zhyttyezdatnykh klityn bifidobakteriy u produktakh kharchuvannya ta preparatakh probi-otysnoho proznachennya. Naukovyy visnyk Lvivsko-ho natsionalnoho universytetu veterynarnoyi medytsyny ta biotekhnolohiy imeni S.Z. Gzhytskoho. 18(1), 70-75 (in Ukrainian).
Kaprelyants, L.V. & Krupytska, L.O. (2017). Probiotychni vlastyvosti ta byotekhnolohichnyi potentsial propionovokyslykh bakterii. Mikrobiolohiia i biotekhnolohiia. 1(37). 6-15. doi: 10.18524/2307-4663.2017.1(37).96324 (in Russian).
Kouya, T., Misawa, K., Horiuchi, M., Nakayama, E., Deguchi, H., Tanaka, T., & Taniguchi, M. (2007). Production of extracellular bifidogenic growth stimulator by anaerobic and aerobic cultivations of several propionibacterial strains. Journal of bioscience and bioengineering. 103(5), 464-471. doi: 10.1263/jbb.103.464.
HayKOBHH bîchhk .nHYBME iMeHi C.3. iW^Koro, 2018, T 20, № 85
Krupytska, L.O. & Kaprelyants, L.V. (2016). Zhyrnokyslotnyi sklad biolohichno aktyvnykh dobavok z vkliuchenniam propionovokyslykh bakterii.
(2016). Visnyk Lvivskoho universytetu. Seriia biolohichna. 73, 442-442 (in Ukrainian).
Krupytska, L.O., Kaprelyants, L.V., Trufkti, L.V., & Shpyrko, T.V. (2017). Research into fatty acid composition of probiotic consortiums with the inclusion of propionic acid bacteria. Vostochno-Evropejskij zhurnal peredovyh tehnologij. 3(6), 1520. doi: 10.15587/1729-4061.2017.101015. Krupytska, L.O., Kaprelyants, L.V., & Trufkti, L.V.
(2017). Investigation of the antagonistic activity of secondary metabolites of propionic acid bacteria. Kharchova nauka ta tekhnolohiia. 11(2), 16-20. doi: 10.15673/fst.v11i2.508.
Krysenko, O.V., Skliar, T.V., & Vinnikov, A.I. (2010). Mikrobiolohichni aspekty probiotychnykh preparativ.
Visnyk Dnipropetrovskoho universytetu. Biolohiia. Ekolohiia. 18(2), 25-33 (in Ukrainian).
Okada, Y., Tsuzuki, Y., Miyazaki, J., Matsuzaki, K., Hokari, R., Komoto, S. et al. (2006). Propionibacterium freudenreichii component 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA) attenuates dextran sodium sulphate induced colitis by modulation of bacterial flora and lymphocyte homing. Gut. 55, 681-688. doi: 10.1136/gut.2005.070490.
Semenov, A.V. (2011). Harakteristika otnoshenij mezhdu probioticheskimi i avtohtonnymi mikroorganizmami i algoritm individual'nogo podbora probiotikov. (2011). Kazanskij medicinskij zhurnal. 92(6), 792-795 (in Russian).
Yuan, J., Wang, B., Sun, Z., Bo, X., Yuan, X., He, X., et al. (2008). Analysis of host-inducing proteome changes in Bifidobacterium longum NCC2705 grown in vivo. J Proteome Res. 7, 375-385. doi: 10.1021/pr0704940.
