CC BY
39
Нелинейные локальные деформации мембран эритроцитов: действие токсинов и фармпрепаратов (Часть 2)
А. М. Черныш1-2, Е. К. Козлова1-2, В. В. Мороз1, В. А. Сергунова1, О. Е. Гудкова1, А. П. Козлов2, Е. А. Манченко1-2
1 НИИ общей реаниматологии им. В. А. Неговского ФНКЦ реаниматологии и реабилитологии, Россия, 107031, г. Москва, ул. Петровка, д. 25, стр. 2 2 Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова Минздрава России, Россия, 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2
Nonlinear Local Deformations of Red Blood Cell Membranes: Effects of Toxins and Pharmaceuticals (Part 2)
Alexander M. Chernysh1,2, Elena K. Kozlova1,2, Viktor V. Moroz1, Viktoria A. Sergunova1, Olga E. Gudkova1, Alexander P. Kozlov2, Ekaterina A. Manchenko1,2
1 V. A. Negovsky Research Institute of General Reanimatology, Federal Research and Clinical Center of Intensive Care Medicine and Rehabilitology,
25 Petrovka Str., Build. 2, 107031 Moscow, Russia 21. M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of Russia, 8 Trubetskaya Str., Build. 2, 119991 Moscow, Russia
Модификаторы мембран порождают локальные дефекты на поверхности клеток. Измерение жесткости в зонах локальных дефектов может дать дополнительную информацию о структуре дефектов и механических свойствах мембран в целом.
Цель работы: пошаговое исследование процесса нелинейной деформации мембран эритроцитов при действии на них модификаторов различной физико-химической природы.
Материалы и методы. Методом атомно-силовой спектроскопии провели исследование деформации мембран внутрь клетки вязко-упругой композитной конструкции эритроцита. Исследовали нелинейные деформации при действии гемина, ионов Zn2+, фармпрепарата верапамила.
Результаты. Показали процесс упруго-эластичной деформации мембраны по мере индентации зонда в областях локальных дефектов, вызванных модификаторами. На один и тот же шаг смещения Az пьезосканера зонд погружался на разные дискретные величины Ah, которые являются функциями структуры мембраны. В областях доменов при действии гемина возникали зоны натяжения и зоны пластичности. Привели математическая модель индентации зонда в области дефектов мембран.
Заключение. Обсудили молекулярные механизмы различных видов нелинейных деформаций, возникающих при действии токсинов. Результаты работы могут представлять интерес как для фундаментальных исследований свойств клеток крови, так и для практической реаниматологии и реабилитологии.
Ключевые слова: мембраны эритроцитов; нелинейные деформации; атомно-силовая спектроскопия
Modifiers of membranes cause local defects on the cell surface. Measurement of the rigidity at the sites of local defects can provide further information about the structure of defects and mechanical properties of altered membranes.
The purpose of the study: a step-by-step study of the process of a nonlinear deformation of red blood cells membranes under the effect of modifiers of different physico-chemical nature.
Materials and methods. The membrane deformation of a viscoelastic composite erythrocyte construction inside a cell was studied by the atomic force spectroscopy. Nonlinear deformations formed under the effect of hemin, Zn2+ ions, and verapamil were studied.
Results. The process of elastic deformation of the membrane with the indentation of a probe at the sites of local defects caused by modifiers was demonstrated. The probe was inserted during the same step of the piezo scanner Az displacement; the probe indentation occured at the different discrete values of Ah, which are the functions of the membrane structure. At the sites of domains, under the effect of the hemin, tension areas and plasticity areas appeared. A mathematical model of probe indentation at the site of membrane defects is presented.
Адресс для корреспонденции: Correspondence to:
Александр Черныш Alexander Chernysh
E-mail: [email protected] E-mail: [email protected]
Conclusion. The molecular mechanisms of various types of nonlinear deformations occurring under the effect of toxins are discussed. The results of the study may be of interest both for fundamental researchers of the blood cell properties and for practical reanimatology and rehabilitology.
Keywords: red blood cells membranes; nonlinear deformations; atomic force spectroscopy
DOI:10.15360/1813-9779-2018-1-29-39
Введение
Способность эритроцитов деформироваться определяет возможность их прохождения через капиллярную сеть и реологию крови в целом [1]. Особенно остро стоит эта проблема в практической реаниматологии и реабилитологии. Это определяется тем, что при критических состояниях, при кровопотере, сочетанной травме собственные параметры мембран эритроцитов меняются в широких пределах [2-5].
Атомная силовая спектроскопия (АСС) позволяет получать изображения наноповерхности мембран и исследовать их способность деформироваться под действием индентора [6, 7]. По деформации биологической структуры делается заключение о жесткости материала и его механических свойствах [8, 9]. Деформируемость и жесткость мембран эритроцитов меняется при заболеваниях - при сахарном диабете, ишемии миокарда, гипертонии [10, 11], при возникновении опухолей [12, 13].
По силовым кривым, измеренным в поверхностном слое, расчитывается модуль Юнга, который приписывается всему объему материала [14-16]. В таком контексте измерение жесткости мембраны клетки можно проводить на мембранах, закрепленных на твердой подложке [17]. Но, в этом случае нет возможности получить данные о деформируемости отдельных компонент мембран. Можно лишь оценить модуль Юнга поверхностного слоя. Задача изучения механических свойств мембран эритроцитов с помощью АСС должна быть поставлена иначе. А именно, исследование способности деформироваться внутрь клетки вязко-упругой композитной мембраны на целостной конструкции эритроцита [18, 19].
Модификаторы мембран могут порождать локальные дефекты на поверхности клеток. Измерение жесткости в зонах локальных дефектов может дать дополнительную информацию о структуре дефектов и механических свойствах мембран в целом. Поэтому, для описания биомеханики мембран, необходимо исследовать не просто модуль Юнга поверхностного слоя, но и изменения жесткости мембран в их различных зонах и на разной глубине прогиба. Для этого исследовали действие на клетки модификаторов различной природы: токсический агент гемин, ионы тяжелых металлов — Zn2+, лекарственный фармпрепарат — верапамил.
Цель работы — пошаговое исследование процесса нелинейной деформации мембран эритроци-
Introduction
The ability of red blood cells (RBC) to deform determines the possibility of their passage through capillary network and rheology of a blood [1]. This problem is especially urgent in practical reanima-tology and rehabilitology since in critical states due to a blood loss and multitrauma the intrinsic parameters of erythrocyte membranes vary in a wide range [2-5].
The atomic force spectroscopy (AFS) makes it possible to obtain images of the nanosurface of membranes and to study their ability to deform under the influence of the indenter [6, 7]. A conclusion about the firmness of the material and its mechanical properties [8, 9] is made by the deformation of the biological structure. The deformability and rigidity of the erythrocyte membranes varies depends on the disease studied and inclludes diabetes mellitus, myocardial ischemia, hypertension [10, 11], and tumors [12, 13].
According to the force curves measured in the superficial layer, the Young's modulus is calculated, which is attributed to the entire volume of the material [14-16]. In this context, the measurement of the hardness of the cell membrane can be carried out on membranes fixed on the solid substrate [17]. But in this case, it is not possible to obtain data about the deformability of individual membrane components. One can only estimate the Young's modulus of the surface layer. The task of studying the mechanical properties of erythrocyte membranes with the help of AFS should be set differently. Namely, a study of the ability of the viscoelastic composite membrane to deform inside a cell on an integral ery-throcyte construction [18, 19].
Modifiers of membranes may produce local defects on the cell surface. The measurement of the hardness at sites of local defects can give additional information about the structure of defects and the mechanical properties of membranes, in general. Therefore, to describe the biomechanics of membranes, it is necessary to investigate not only the Young's modulus of the superficial layer, but also changes in the rigidity of membranes in their various zones and at different depths of deflection. For this purpose, the effect of modifiers of different nature on the cells was studied: a toxic agent hemin, ions of heavy metals (Zn2+), and a pharmaceutical verapamil.
The purpose of the study was a step-by-step study of the process of a nonlinear deformation of red blood cells membranes under the effect of modifiers of different physico-chemical nature.
Эспериментальные исследования
тов при действии на них модификаторов различной физико-химической природы.
Материал и методы
Способ измерения деформаций, объект, а так же методика построения и анализа силовых кривых в атомно-силовой спектроскопии была подробно описана в части 1 этой статьи.
Кровь забирали у доноров на добровольной основе при профилактических осмотрах, и все дальнейшие исследования проводили in vitro. В исследовании использовали кровь 6 доноров мужского пола от 23 до 34 лет. Все исследования проводили с учетом требований Хель-синской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г, а также с нормами этического комитета ФНКЦ РР
Проводили исследования локальной жесткости мембран эритроцитов после воздействия на кровь in vitro модификаторов: гемина, ионов тяжелых металлов (Zn2+), лекарственного препарата верапамила. Эти модификаторы имели различную природу и различные механизмы действия на наноструктуру мембран. Важно, что эти модификаторы порождали на мембранах эритроцитов специфические топологические локальные дефекты, характерные только для данного модификатора. Выбор модификаторов продиктован необходимостью получения широкого спектра эффектов их воздействия на наноструктуру и механические свойства мембран.
Гемин — продукт окисления гемоглобина. Малярия (серповидные клетки), ишемия, кровопотеря, кровотечение из эрозий желудка могут привести к формированю гемина [2, 18, 20]. Ионы Zn2+ вызывают кластеризацию белковых структур и порождают локальные дефекты мембран [21, 22]. Верапамил, используемый при лечении гипертонии, стенокардии, тахиаритмии и кардиомиопатии, является одним из часто назначаемых блокаторов кальциевых каналов [23].
В работе использовали сухой гемин (Sigma, USA). 50 мг сухого гемина растворяли в 0,1 М раствора NaOH в дистиллированной воде. Конечная концентрация гемина в крови in vitro составляла 1,5 мМ. Раствор соли ZnSO4 (Sigma, USA) добавляли в цельную кровь. Концентрация ионов Zn2+ в крови in vitro составляла 2 мМ. Концентрация верапамила гидрохлорида (Nycomed, Austria) в крови in vitro составляла 0,6 мМ.
Статистическую обработку данных проводили с помощью стандартной программы Origin 9, (Origin Lab Corporation, USA). Строили гистограммы, определяли среднее значение, величину среднеквадратического отклонения и получали интервальную оценку, оценку достоверности полученных результатов, оценку достоверности различий. Достоверность различий оценивали с помощью однофак-торного дисперсионного анализа (One-way, ANOVA).
Результаты и обсуждение
Процесс индентации зонда в мембраны эритроцита при действии гемина
Гемин образует домены на поверхности мембран [24]. Пример наноповерхности мембраны эритроцита после действия гемина представлен на рис. 1, a. Показаны области больших доменов (350-1000) нм - «Ld», области малых доменов
Materials and Methods
The method of deformations measuring, the object, as well as the procedure of plotting and analyzing of force curves in the atomic force spectroscopy has been described in details in Part 1 of this article.
Blood was collected from donors on a voluntary basis during preventive examinations, and all further studies were performed in vitro. Blood from 6 male donors aged from 23 to 34 years old was used in the study. All studies were carried out in accordance with the requirements of the Declaration of Helsinki by the World Medical Association «Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects», as amended in 2000, as well as with the requirements of the Ethics Committee of the Federal Research and Clinical Center of Intensive Care Medicine and Rehabilitology.
Studies of local hardness of erythrocyte membranes after in vitro exposure of blood to modifiers: hemin, heavy metal ions (Zn2+), verapamil. These modifiers had different nature and different mechanisms of action on the nanostruc-ture of the membranes. It is important that these modifiers generated specific topological local defects on the erythro-cyte membranes, which are characteristic only to this modifier. The choice of modifiers is substantiated by the need to obtain a wide range of effects of their influence on the nanos-tructure and mechanical properties of membranes.
Hemin is a product of hemoglobin oxidation. Malaria, sickle cells, ischemia, blood loss, bleeding from gastric erosions can lead to the formation of hemin [2, 18, 20]. Zn2+ ions cause clustering of protein structures and generate local membrane defects [21, 22]. Verapamil is one of the most commonly prescribed calcium channel blockers, used in the treatment of hypertension, angina pectoris, tachyarrhythmia and cardiomyopathy [23].
Dry hemin was used in the study (Sigma, USA). 50 mg of dry hemin was dissolved in a 0.1 M solution of NaOH in distilled water. The final in vitro concentration of hemin in the blood was 1.5 mM. A ZnSO4 solution (Sigma, USA) was added to the whole blood. The in vitro concentration of Zn2+ ions in the blood was 2 mM. The in vitro concentration of verapamil hydrochloride (Nycomed, Austria) in blood was 0.6 mM.
The statistical processing of data was carried out using the standard Origin 9 software, (Origin Lab Corporation, USA). The histograms were constructed, the mean value, the standard deviation value were determined and an interval estimate, an estimate of the reliability of the obtained results, and an estimate of the reliability of the differences were obtained. The reliability of the differences was assessed using single-factor analysis of variance (One-way, ANOVA).
Results and Discussion
Process of probe indentation into RBC membrane under the effect of hemin
Hemin forms domains on the membrane surface [24]. An example of the nanosurface of the red blood cell membrane after the action of hemin is shown in fig. 1, a. Zones of large domains (350-1000 nm), «Ld», zones of small domains (200-300) nm, «Sd», and zones of flat membranes surface, «Fl», are shown. The characteristic size of granular structures in domains is 100-120 nm, which is close to the characteristic cell size of the spectrin matrix. The sizes of domains are determined by the number of grains in it [25].
Рис. 1. Наноповерхность мембран эритроцитов при действии гемина. Fig. 1. Nanosurface of red blood cell membranes under the effect of hemin.
Note. a - functions Ah/Az (h) for the flat surface Fl, zone of the large domain Ld, zone of the small domain Sd; b - function ^ (h) for the same zones; c - HSd and HLd are the zones of tension in the areas Ld and Sd, TSd and TLd are the zones of plasticity in the same ares. hmax is the depth of the indenter stop.
Примечание. a - функции Ah/Az (h) для плоской поверхности Fl, области большого домена Ld, области малого домена Sd; b -функции ^ (h) для тех же областей; с - Hsd и HLd - зоны натяжения в областях Ld и Sd, Tsd и TLd - зоны пластичности в тех же областях. hmax - глубина остановки индентора.
(200-300) нм - «Б^» и области плоской поверхности мембран — «Р1». Характерный размер зернистых структур в доменах составляет 100—120 нм, что близко к характерным размером ячейки спек-тринового матрикса. Размеры доменов определяются количеством зерен в нем [25].
Привели зависимости Лк/Лг (к) (рис. 1, Ь) и ^ (к) (рис. 1, с) для трех выделенных областей клетки, показанных на рис. 1, а. Процесс погружения зонда в области плоской поверхности (рис. 1, Ш) был похож на такой же процесс на планоците (часть 1, рис. 4, Р1). Функция Лк/Лг (к) падала от 0,8 (к=6 нм) до 0 на глубине 32 нм. Процесс погружения зондов в области доменов Бй и Ьй отличается от такового для плоской поверхности этой же клетки (рис. 1, Ь). В областях доменов регистрировали характерные зоны натяжения и Ни и зоны пластичности композитного материала мембран ТБй и Ты для малого и большого доменов соответственно. В зонах Н коэффициент локальной жесткости ^ мембран возрастал по мере роста к, а зонах Т коэффициент ц почти не менялся. Наиболее выраженными были эти зоны для большого домена. В зоне Ни (26-36 нм) Лк/Лг падала от 0,94 до 0,41. Затем возникала зона пластичности - ТЬй (36—90 нм). В этой зоне Лк/Лг практически не уменьшалась (0,41-0,38). На глубине к=94 нм зонд прекратил погружение в мембрану. В области малого домена процесс погру-
Dependences Ah/Az (h) (fig. 1, b) and ^ (h) (Fig. 1c) are presented for the three selected cell zones, shown in Figure 1a. The process of probe introduction into the zones of flat surface (fig. 1, Fl) was similar to the same process on the planocyte (part 1, fig. 4, Pl). The function Ah/Az (h) fell from 0.8 (h=6 nm) to 0 at the depth 32 nm. The process of probes indentation into the Sd and Ld domain zones differ from that for a flat surface of the same cell (fig.1, b). In the domain zones, characteristic HSd and HLd tension zones and the zones of plasticity of the membrane composite material TSd and TLd for small and large domains, respectively, were registered. In zones H, the local membranes hardness coefficient ^ increased with increase of h; and in zones T the coefficient ^ almost did not change. These zones were more expressed for the large domain. In the zone HLd (26-36 nm), Ah/Az fell from 0.94 to 0.41. Then a zone of plasticity TLd (36-90 nm) appeared. In this zone, Ah/Az practically did not decrease (0.41-0.38). At a depth of h=94 nm, the probe stopped its indentation into the membrane. In the zone of a small domain, the indentation process was similar. The tension zone HSd was wider (28-58 nm), and the drop of Ah/Az was from 0.83 to 0.3. The plasticity zone TSd was from 58 to 64 nm, and the maximum value of the probe indentation was h=74 nm. The function ^ (h) (fig. 1, c) for a flat zone of the membrane Fl was an increasing one, similar to this function for the planocyte
Рис. 2. Локальные дефекты мембран эритроцитов при действии ионов Zn2+ (a) и верапамила (b). Fig. 2 Local defects of erythrocyte membranes under the effect of Zn2+ ions (a) and verapamil (b).
Note. c - functions Ah/Az (h) for normal discocyte (control), under the effect of Zn2+ ions and verapamil; d- the function ^ (h) for the same cells. hmax is a depth of the indenter stop.
Примечание. с - функции Ah/Az (h) для нормального дискоцита (контроль), при действии ионов Zn2+ и верапамила; d- функции ^ (h) для тех же клеток. hmax - глубина остановки индентора.
жения был подобным. Зона натяжения HSd была шире: (28-58 нм), а падение Ah/Az составило от 0,83 до 0,3. Зона пластичности TSd была уже: от 58 до 64 нм, а максимальное значение погружения зонда h=74 нм. Функция ^ (h) (рис. 1, с) для плоского участка мембраны Fl была нарастающей, подобной этой функции для планоцита (часть 1, рис. 4, с). Для большого домена Ld функция ^ (h) имела характерный плоский участок Ти внутри которого, величина коэффициента локальной жесткости ^ мембраны практически не изменялась. Этот участок выделен на рис. 1, с цветным прямоугольником. При локальной деформации мембраны на глубину h=90 нм коэффициент ^ резко возрастал и это приводило к остановке погружения зонда.
Процесс индентации зонда в мембраны при действии ионов Zn2+ и верапамила.
На рис. 2 представили эритроциты с дефектами мембран, вызванными действием ионов цинка и блокатора кальциевых каналов верапами-ла. Ионы тяжелых металлов и, в частности Zn2+, при высоких концентрациях (2 мМ и более) всегда вызывают локальные дефекты мембран (рис. 2, а) [26, 27]. Верапамил в клинических концентрациях не вызывает деструкции мембран. В данном исследовании использовали десятикратную дозу препарата in vitro, которая вызывала токсический эффект, и, как следствие, специфические локальные дефекты мембран (рис. 2, b).
(part 1, fig. 4, c). For a large domain Ld, the function ¡j (h) had a characteristic flat zone TLd within which the value of the local hardness coefficient j of the membrane remained practically unchanged. This zone is highlighted in fig. 1, c as a colored rectangle. At local deformation of the membrane to the depth h=90 nm, the coefficient ^ sharply increased resulting in the stop of the probe indentation.
The process of probe indentation into membranes under the effect of Zn2+ ions and verapamil.
Red blood cells with membrane defects, caused by the effect of zinc ions and the calcium channel blocker verapamil are shown in fig. 2. Ions of heavy metals and, in particular, Zn2+, at high concentrations (2 mM and more) always cause local membrane defects (fig. 2, a) [26, 27]. Verapamil in clinical concentrations does not cause destruction of membranes. This study used a tenfold dose of the drug in vitro, which caused a toxic effect, and as a result, specific local membrane defects (fig. 2, b).
The function Ah/Az (h) for membranes damaged by zinc ions had the character of a tension zone, it decreased almost linearly. The probe stopped its indentation at the depth of h=18 nm, thus indicating a 3.6-fold increase in hardness as compared to the normal limits. The same function for verapamil practically repeated the normal curve, and the probe was inden-tated at 65 nm, as under normal conditions (64 nm) (fig. 2, c). The hardness coefficient j (h) for verapamil
Experimental Studies
Рис. 3. Гистограммы плотности относительных частот для мембран эритроцитов при действии ионов Zn2+ (а) и верапамила (b). Fig. 3. Histograms of the density of relative frequencies for erythrocyte membranes under the effect of Zn2+ ions (a) and verapamil (b). Note. The coefficient of hardness д is plotted along the abscissa axis, and density of relative frequencies is plotted along the ordinate axis. Примечание. По оси абсцисс - коэффициент жесткости д, по ординате - относительная плотность частот.
Функция Ah/Az (h) для мембран, поврежденных ионами цинка, имела характер зоны натяжения — почти линейно убывала. Зонд прекратил погружение уже на глубине h=18 нм, что указывает на увеличение жесткости в 3,6 раза по сравнению с нормой. Эта же функция для верапамила практически повторяла нормальную кривую, а зонд погрузился на 65 нм, как и в норме (64 нм) (рис. 2, с). Коэффициент жесткости ^ (h) для верапамила практически не менялся на протяжении всего процесса погружения зонда и оставался на уровне нормы (рис. 2, d).
Если ставится задача оценки средней жесткости мембран эритроцитов по ансамблю клеток, то подход к ее решению должен быть иным [28]. За оценку средней жесткости в зоне индентации можно выбрать параметр hmax. В этом случае в разных областях тора дискоцита надо m раз измерить величину hmax для n клеток и усреднить ее по некоторому ансамблю. Для иллюстрации на рис. 3 приведены гистограммы распределений средней жесткости мембран эритроцитов при действии на кровь модификаторов мембран: ионов тяжелых металлов (Zn2+) и блокатора кальциевых каналов - верапамила.
В данном примере были измерены величины hmax на 6 точках торов 34 эритроцитов для контрольной группы и по столько же для групп действия каждого модификатора. Усреднение и построение гистограмм проводили по ансамблю 204 точек для каждой группы. Ионы цинка (2 мМ in vitro) вызывали возникновение локальных дефектов на мембране [26, 27] и увеличивали ее среднюю жесткость в 3,6 раза.
Средняя локальная жесткость мембраны после воздействия на кровь ионами цинка и вера-памила (M±m) (таблица).
did not change practically during the entire process of the probe indentation and remained at the normal level (fig. 2, d).
If there is a task to assess the average hardness of erythrocyte membranes over the ensemble of cells, then the approach to its solution should be different [28]. The parameter hmax is taken as the average hardness in the indentation zone. In this case, in different zones of the discocyte torus we should measure the value hmax m times for n cells and average it over a certain ensemble. For illustration, the histograms of distributions of the average hardness of erythrocyte membranes are shown in fig. 3 under the effect of the modifiers of membranes on blood: ions of heavy metals (Zn2+) and a calcium channel blocker verapamil.
In this example, the values hmax were measured at 6 points of the tours of 34 red blood cells for the reference group and the same amount for the groups of action of each modifier. The averaging and plotting of the histograms were carried out using an ensemble of 204 points for each group. Zinc ions (2 mM in vitro) caused local defects on the membrane [26, 27] and increased its average hardness by 3.6-fold.
Verapamil in a concentration that is 8-10 times as high as the clinical dose caused damage of the membrane nanostructure [2], but in this case it did not change their average hardness, that remained similar to that in the reference group (P<0.05).
Each component of the composite membrane has its own mechanical properties. Soft, practically transparent for the probe lipid bilayer is located on the external surface. Spectrin matrix is a dynamically changing structure, consisting of stiff fibers of spec-trin, forming a continuous net throughout the whole cell with the average cell size of 80-100 nm [28]. Spec-
Средняя локальная жесткость мембраны после воздействия на кровь ионами цинка и верапамила (M±m). Average local membrane hardness after the effect of zinc ions and verapamil (M±m) on blood.
Parameter Values of parameter in groups
C, rel. units Reference 1.0±0.4 Reference 1.0±0.6
Zinc ions 3.6±1.2* Verapamil 1.1±0.3
Note. * - P<0.05 compared with the reference group.
Примечание. Parameter - параметр; Values of ... in groups - значения в группах; Reference - контроль; Zinc ions - ионы цинка; Verapamil - верапамил; C, rel. units - К, отн. ед. * - £><0,05 по сравнению с контролем.
Верапамил в концентрации, в 8-10 раз превышающей клиническую дозировку, вызывал повреждения наноструктуры мембран [2], но при этом не изменял их среднюю жесткость, которая оставалась на уровне контроля (р<0,05).
Каждая составляющая композитной мембраны имеет собственные механические свойства. Сверху — мягкий, практически прозрачный для зонда, липидный бислой. Спектриновый матрикс — динамично изменяющаяся структура, состоящая из жестких нитей спектрина, образующих непрерывную сетку по всему объему клетки со средним размером ячейки - 80—100 нм [28]. Спектриновая нить - тетрамер, состоящая из спиральных а и в мономеров, соединенных микрофиламентами актина. Длина нити может варьировать в широком диапазоне: от 50 и менее до 260 нм [29, 30]. Связываясь с внутренней стороной мембраны с помощью белков band 4.1, band 3, анкирина, актина и других, спектрин стабилизирует фосфолипидный слой и ограничивает латеральную диффузию интегральных белков.
В силу многочисленных и достаточно прочных связей между фосфолипидным бислоем и спектриновым матриксом при действии на клетку индентора эти структуры ведут себя как единая неоднородная (в смысле упруго-эластичных свойств) композитная мембрана клетки.
Процесс погружения зонда в мембрану эритроцита после действия гемина (рис. 1) имел иные тенденции по сравнению с кинетикой погружения в нормальный эритроцит, представленной на рис. 4, часть 1.
Гемин (солянокислый гематин) нарушает конформацию спектрина, белка band 4,1 и ослабляет связь между ними [31]. Он модифицирует конформацию соединительного комплекса «спек-трин - белки band 4,1, band 3», индуцирует образование локальных дефектов на поверхности мембран [2, 5, 32]. Эффект модификации матрикса проявляется на процессе погружения зонда в мембрану клетки, на которую подействовали гемином.
В зонах доменов графики Ah/Az (h) имели специфические, характерные только для них особенности. На этих графиках присутствуют зоны натяжений HSd и HLd, когда градиент функции Ah/Az (h) максимальный, и зоны пластичности TSd и TLd, когда этот градиент близок к 0.
Зоны натяжений Нг - это участки hi, в которых коэффициент локальной жесткости ^ возрас-
trin fiber is a tetramer consisting of spiral a and ¡3 monomers connected by actin microfilaments. The length of the fiber can vary over a wide range: from 50 to less than 260 nm [29, 30]. Binding to the inner side of the membrane by means of band 4.1 and band 3 proteins, ankyrin, actin and others, spectrin stabilizes the phospholipid layer and limits lateral diffusion of integral proteins.
Due to the numerous and quite strong links between the phospholipid bilayer and the spectrin matrix under the action of the indenter on the cell, these structures behave as a single heterogeneous (in the sense of its elastic properties) composite cell membrane.
The process of the probe indentation into the ery-throcyte membrane after the action of hemin (fig. 1) had other tendencies compared to kinetics of indentation in the normal red blood cell, presented in fig. 4 part 1.
Hemin (hydrochloric acid hematin) disrupts the conformation of spectrin, band 4.1 protein and weakens the bond between them [31]. It modifies the conformation of the «spectrin-protein band 4.1, band 3» binding complex and induces the formation of local defects on the membrane surface [2, 5, 32]. The effect of modifying the matrix is manifested in the immersion of the probe into the cell membrane, which was affected by the hemin.
In the zones of domains, the graphs Ah/Az (h) had specific features, typical for them alone. On these graphs, there are tension zones HSd and HLd, when the gradient of the function Ah/Az (h) is maximal, and the plasticity sites TSd and TLd, when this gradient is close to 0.
The tension zones Hi are the sites hi in which the local hardness coefficient ^ increases, and the indenter immersion slows down sharply. In the zones of plasticity of Ti, the coefficient of local hardness ^ remains practically unchanged (Fig. 1c), and, consequently, Ah does not change in this region. The dimensions of the tension zones and the plasticity zones of H and Tl depend on the size of the domains formed on the surface of the membranes as a result of the action of hemin.
Before the tension zones HSd and HLd, the probe was introduced in the cell membrane almost freely. The differential Aht was only 0.1. The probe was introduced up to the indicated depths and reached the matrix. For these values of hi, the matrix was in an unstressed state and deformed (deflected) freely, without tension. This is the plastic deformation membrane zone. In the zones Hi, the hardness of the medium in-
Experimental Studies
Рис. 4. Зависимости: p (h) модельные и экспериментальные (a), F (z) для различных значений К (b). Fig.4. Model and experimental dependencesp (h) (a), F (z) for different Kvalues (b).
тает, и погружение индентора резко замедляется. В зонах пластичности Тг коэффициент локальной жесткости ^ остается практически неизменным (рис. 1, с), а, следовательно, и АН не меняется в этой области. Размеры зон натяжения и зон пластичности Нг и Тг зависят от размеров доменов, образовавшихся на поверхности мембран в результате действия гемина.
До зон натяжения НБй и Ни, зонд погружался в мембрану клетки почти свободно. Перепад АНг составил всего 0,1. Зонд погрузился до указанных глубин и достиг матрикса. Для этих значений Нг матрикс находился в ненапряженном состоянии и деформировался (прогибался) свободно, без натяжения. Эта область пластичной деформации мембраны. В зонах Нг жесткость среды резко возрастала. Перепад АН/Аг составлял 0,5 для области малого домена Бй и 0,53 в области большого домена Ьй. Матрикс начинал упруго деформироваться. Его нити растягивались, создавая практически максимальную спиральную упругость среды. Когда зонд погружался в мембрану на величину, близкую к Нпих, спектриновая нить, уже потерявшая спиральную упругость (конфигурацию), растягивалась до максимальной возможной длины. После этого нить становилась почти абсолютно жесткой, и зонд прекращал движение - АН=0.
В контексте рассмотренной задачи перспективно было бы поставить эксперименты по изучению упругих свойств матрикса на выделенной спектриновой сети. Хотя такие опыты проводились [33], интерпретация их результатов на целую клетку крови на сегодня — трудно разрешимая задача.
Кроме рассмотренных структур мембраны эритроцита на величины АН и Нтах может влиять внутреннее содержание клетки. Это гемоглобин и цитоплазма. Учитывая, что молекула гемоглобина
creased sharply. The difference Ah/Az was 0.5 for the small domain Sd and 0.53 for the large domain Ld. Matrix began to be deformed elastically. Its fibers were stretched, creating almost the maximum spiral elasticity of the medium. When the probe is introduced into the membrane at a depth close to hmax,, the spectral fiber that has already lost its spiral elasticity (configuration) is stretched to the maximum possible length. After that, the thread became almost completely hard, and the probe stopped its movement (Ah=0).
In the context of the considered problem, it would be perspective to arrange experiments to study the elastic properties of the matrix on the isolated spectrin network. Although such experiments are conducted [33], but the extrapolation of their results the whole blood cell is still a difficult problem.
In addition to the considered structures of the red blood cell membrane, the internal content of the cell may influence on the values Ah and hmax. This is hemoglobin and cytoplasm. Considering that the molecule of hemoglobin has a size of about 5 nm and these molecules are freely immersed in the liquid medium of cytoplasm, this may be modeled by a drop of liquid in a soft coating [18, 34]. The influence of these medium on the measurement of^ membrane is insignificant [35].
Modeling of the process of erythrocyte membrane deformation. We will consider the «membrane -probe with cantilever» system as consistently connected springs with hardness coefficients ^ and K, respectively. The hardness of the probe is an infinitely large value, so the coefficient K is entirely determined by the hardness of the cantilever.
Under the conditions of the presented experiments, when the piezo scanner is raised on the height of z, the probe enters the membrane to the depth h (deformation of the membrane), while the cantilever deformation take place (displacement of the end of the balk) at a level L. The point z=0 is the point of contact
имеет размер порядка 5 нм и эти молекулы свободно погружены в жидкую среду цитоплазмы, это влияние можно моделировать каплей жидкости в мягкой оболочке [18, 34]. Влияние такой среды на измерение ц мембраны пренебрежимо мало [35].
Моделирование процесса деформации мембран эритроцитов. Систему «мембрана - зонд с кантилевером» рассматривали как последовательно соединенные пружины с коэффициентами жесткости р и К соответственно. Жесткость зонда - бесконечно большая величина, поэтому коэффициент К целиком определяется жесткостью кантилевера.
В условиях представленных опытов при подъеме пьезосканера на величину 2 зонд входит в мембрану на глубину к (деформация мембраны), при этом происходит деформация кантилевера (смещение конца балки) на величину Ь. Точка z=0 - точка касания зонда с мембраной, тогда: z>0, Ь>0, Ь>0. Связь к, г и Ь определяли соотношением:
к=г-Ь, ( 1).
В модели сделали следующие допущения:
Коэффициент жесткости кантилевера К не изменяется в ходе измерения.
Коэффициент жесткости мембраны ц нелинейно зависит от к. Это обусловлено изменением механических свойств мембраны по мере ее деформации, в частности модификацией конфигурации спектринового матрикса [36].
Пусть:
Р (к) = -(к-Ь--+ С' (2)
где а, Ь, с - параметры, с=-а/Ъ2.
Коэффициент а определяет, крутизну функции р (Ь), то есть, на сколько резко изменяется р по мере погружения зонда в мембрану. Коэффициент Ь имеет размерность и физический смысл ктах.
На рис. 4 представили график зависимости
Р (к).
Эта зависимость согласуется с данными изменения механических свойств при изменении конфигурации спектриновых нитей [37].
Условие равновесия: сила со стороны канти-левера равна силе со стороны мембраны: ¥=К-Ь=1к0р(к)йк, (3).
С помощью ряда математических преобразований и с учетом (1), (2), (3) получаем графики зависимостей ¥ (г) и р (к) для впадины дискоцита (рис. 4) .
При к^ктах коэффициент жесткости мембраны стремится к бесконечности (р^<х>), что и является причиной остановки индентора. При этом коэффициент жесткости всей системы Ксист (последовательно соединенных пружин с коэффициентами К и р будет стремиться к жесткости кантилевера: Ксист ^ К.
На практике уже при р~5К коэффициент жесткости всей системы Ксист становится достаточно большим, что бы вызвать остановку индентора. В модели - это величина Ь=38 нм, а в эксперименте
of the probe with the membrane, then z>0, h>0, L>0. The relationship between h, z and L is defined by the relation:
h=z-L, ( 1).
The following assumptions are made in the model:
1. The cantilever hardness coefficient K is not changed during the measurement.
2. The membrane hardness coefficient p depends on h nonlinearly. This is caused by the change in the mechanical properties of the membrane as it deforms, in particular by modification of the configuration of the spectrin matrix [36].
Let us introduce the equation:
p (h) = -
+ c, (2)
(h-b)2
where a, b, c are the parameters, c=-a/b2.
The coefficient a determines the steepness of the function p (h), that is, how sharply ^ varies as the probe enters the membrane. The coefficient b has dimension and a physical meaning of hmax.
The p(h) dependence curve is presented in fig. 4.
This dependence agrees with the data on the change in the mechanical properties when the configuration of spectral fibers is changed [37].
The condition of equilibrium: the cantilever force is equal to the membrane force:
F=K'L=lh0p(h)dh, (3).
Using a number of mathematical transformations and taking into account (1), (2) and (3), we obtain the graphs of dependencies F (z) and p (h) for the disco-cyte cavity (fig. 4).
For h^hmax, the membrane hardness coefficient tends to infinity (p^cc), which is the reason for stop of the indenter. In this case, the hardness coefficient of the entire system Ksyst (successively connected springs with coefficients K and p) will tend to the hardness of the cantilever: Kyst^K.
In practice, even at p~5K, the hardness coefficient of the entire system Kyst grows enough to cause the stop of indenter. In the model, the value b=38 nm, and in the experiment for the discocyte cavity (part 1, fig. 4, b), the probe stopped at a depth of hmax=35 nm. Therefore, in the experimental dependences of p (h) near the point hmax, the graphs do not become vertical (p^cc), but go at the some angle y<a/4 (part 1, fig. 4, c). This is facilitated by the frictional forces (not included in the model) between the surfaces of the in-denter and the membrane.
As it is seen in the graphs in fig. 4 at a given coefficients a and b, the dependences F (z) and p (h) obtained at the modeling adequately describe these dependences obtained in the experiment.
Conclusion
The process of elastic deformation of membrane is shown as the probe is introduced at the sites of local defects caused by modifiers of various nature. The
для впадины дискоцита (часть 1, рис. 4, b) зонд останавливался на меньшей глубине — hmax = 35 нм. Поэтому на экспериментальных зависимостях ц (h) около точки hmax графики не становятся вертикальными (^.^<х>), а идут под некоторым углом у<ж/4 (рис. 4, с, часть 1). Этому способствуют и силы трения (не учитываются в модели) между поверхностями индентора и мембраны.
Как следует из графиков на рис. 4 при заданных коэффициентах a и b зависимости F (z) и ^ (h), полученные при моделировании, адекватно описывают эти зависимости, полученные в эксперименте.
Заключение
Показали процесс упруго-эластичной деформации мембраны по мере индентации зонда в областях локальных дефектов, вызванных модификаторами различной природы. На один и тот же шаг смещения Az пьезосканера зонд погружался на разные дискретные величины Ah, которые являются функциями структуры мембраны. В областях доме-
Литература
1. Хромова В.С., Мышкин А.Е. Коагуляция цинк-модифицированного гемоглобина. Журнал общей химии. 2002; 72 (10): 1645-1649.
2. Gudkova O.Ye, Bushueva A.V., Kozlov A.P., Chernysh A.M. Nanostructure and local rigidity of red blood cells (RBC) under influence of membrane modificators and ionizing radiation. Conf. Proc. CLINAM. 2013; 6: 172-173.
3. Moroz V.V., Chernysh A.M., Kozlova E.K, Borshegovskaya P.Y, Bliznjuk U.A, Rysaeva R.M., Gudkova O.Y. Comparison of red blood cell membrane microstructure after different physicochemical influences: atomic force microscope research. J. Crit. Care. 2010; 25 (3): 539.e1-539.e12. DOI: 10.1016/j.jcrc.2010.02.007. PMID: 20381299
4. Перепелица СА, Сергунова ВА.., Гудкова О.Е. Влияние перинатальной гипоксии на морфологию эритроцитов у новорожденных. Общая реаниматология. 2017; 13 (2): 14-23. DOI: 10.15360/1813-9779-2017-2-14-23
5. Мороз В.В., Новодержкина И.С., Афанасьев А.В., Заржецкий Ю.В., Рыжков И.А., Козлова Е.К, Черныш А.М. Влияние перфторана на наноструктуру мембран дискоцита и стоматоцита после острой крово-потери. Общая реаниматология. 2017; 13 (2): 32-39. DOI: 10.15360/1813-9779-2017-2-32-39
6. Kozlova E, Chernysh A, Moroz V., Sergunova V., Gudkova O, Kuzovlev A. Nanodefects of membranes cause destruction of packed red blood cells during long-term storage. Exp. Cell. Res. 2015; 337 (2): 192-201. DOI: 10.1016/j.yexcr.2015.07.009. PMID: 26169694
7. Черныш А.М., Козлова Е.К., Мороз В.В., Сергунова ВА, Гудкова О.Е, Козлов А.П., Манченко Е.А. Нелинейные локальные деформации мембран эритроцитов: нормальные эритроциты (часть 1). Общая реаниматология. 2017; 13 (5): 58-68. DOI: 10.15360/1813-9779-2017-5-58-68
8. Roduit C, van der Goot F.G., De Los Rios P., Yersin A, Steiner P., Dietler G., Catsicas S., Lafont F, Kasas S. Elastic membrane heterogeneity of living cells revealed by stiff nanoscale membrane domains. Biophys.J. 2008; 94 (4): 1521-1532. DOI: 10.1529/biophysj.107.112862. PMID: 17981897
9. Voitchovsky K., Antoranz Contera S, Kamihira M, Watts A, RyanJ.F. Differential stiffness and lipid mobility in the leaflets of purple membranes. Biophys.J. 2006; 90 (6): 2075-2085. DOI: 10.1529/biophysj.105.072405. PMID: 16387758
10. Buys A.V, Van Rooy M.J, Soma P., Van Papendorp D, Lipinski B, Pretorius E. Changes in red blood cell membrane structure in type 2 diabetes: a scanning electron and atomic force microscopy study. Сardiovasc. Dia-betol. 2013; 12: 25. DOI: 10.1186/1475-2840-12-25. PMID: 23356738
11. Kuznetsova T.G., Starodubtseva M.N., Yegorenkov N. I., Chizhik S.A., Zhdanov R.I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 2007; 38 (8): 824-833. DOI: 10.1016/j.micron.2007.06.011. PMID: 17709250
12. Li M, Liu L, Xi N, Wang Y, DongZ, Xiao X, Zhang W. Atomic force microscopy imaging and mechanical properties measurement of red blood cells and aggressive cancer cells. Sci. China Life Sci. 2012; 55 (11): 968973. DOI: 10.1007/s11427-012-4399-3. PMID: 23160828
13. Yu M, Wang J, Wang H, Dong S. Calculation of the intracellular elastic modulus based on an atomic force microscope micro-cutting system. Chin. Sci. Bull. 2012; 57 (15): 1868-1872. DOI: 10.1007/s11434-012-5053-y
14. Sirghi L, Ponti J, Broggi F., Rossi F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. Eur. Biophys.J. 2008; 37 (6): 935-945. DOI: 10.1007/s00249-008-0311-2. PMID: 18365186
probe is inserted during the same step of the piezo scanner Az displacement at different discrete values Ah, that represent the functions of the membrane structures. In the domain zones, tension and plasticity zones appeared under the effect of hemin. Molecular mechanisms of different types of nonlinear deformations occurring under the effect of different toxins were discussed. The results of the study may be of interest both for fundamental researchers of the blood cell properties and for future studies in translational reanimatology and rehabilitology.
нов при действии гемина возникали зоны натяжения и зоны пластичности. Обсудили молекулярные механизмы различных видов нелинейных деформаций, возникающих при действии различных токсинов. Результаты работы могут представлять интерес как для фундаментальных исследований свойств клеток крови, так и для практической реаниматологии и реабилитологии.
References
1. Khromova V.S, Myshkin A.E. Coagulation of zinc-modified hemoglobin. Rus. J. Gen. Chem. 2002; 72 (10): 1645-1649. DOI: 10.1023/A:1023356221708. [In Russ., In Engl.]
2. Gudkova O.Ye, Bushueva A.V, Kozlov A.P., Chernysh A.M. Nanostructure and local rigidity of red blood cells (RBC) under influence of membrane modificators and ionizing radiation. Conf. Proc. CLINAM. 2013; 6: 172-173.
3. Moroz V.V., Chernysh A.M, Kozlova E.K, Borshegovskaya P.Y., Bliznjuk U.A., Rysaeva R.M., Gudkova O.Y. Comparison of red blood cell membrane microstructure after different physicochemical influences: atomic force microscope research. J. Crit. Care. 2010; 25 (3): 539.e1-539.e12. DOI: 10.1016/j.jcrc.2010.02.007. PMID: 20381299
4. Perepelitsa S.A., Sergunova V.A., Gudkova O.E. The effect of perinatal hypoxia on red blood cell morphology in newborns. Obshchaya Reanima-tologiya = General Reanimatology. 2017; 13 (2): 14-23. DOI: 10.15360/1813-9779-2017-2-14-23. [In Russ., In Engl.]
5. Moroz V.V., Novoderzhkina I.S., Afanasyev A.V., Zarzhetsky Y.V., Ryzhkov IA., Kozlova E.K, Chernysh A.M. Effect of perftoran on membrane nanos-tructure of discocyte and stomatocyte after acute blood loss. Obshchaya Reanimatologiya = General Reanimatology. 2017; 13 (2): 32-39. DOI: 10.15360/1813-9779-2017-2-32-39. [In Russ., In Engl.]
6. Kozlova E, Chernysh A, Moroz V., Sergunova V., Gudkova O, Kuzovlev A. Nanodefects of membranes cause destruction of packed red blood cells during long-term storage. Exp. Cell. Res. 2015; 337 (2): 192-201. DOI: 10.1016/j.yexcr.2015.07.009. PMID: 26169694
7. Chernysh A.M., Kozlova E.K., Moroz V.V., Sergunova V.A., Gudkova O.E, Kozlov A.P., Manchenko E.F. Nonlinear lokal deformations of erythrocyte membranes: normal erythrocytes (part 1). Obshchaya Reanimatologiya = General Reanimatology. 2017; 13 (5): 58-68. DOI: 10.15360/18139779-2017-5-58-68. [In Russ., In Engl.]
8. Roduit C, van der Goot F.G., De Los Rios P., Yersin A, Steiner P., Dietler G., Catsicas S., Lafont F, Kasas S. Elastic membrane heterogeneity of living cells revealed by stiff nanoscale membrane domains. Biophys. J. 2008; 94 (4): 1521-1532. DOI: 10.1529/biophysj.107.112862. PMID: 17981897
9. Voitchovsky K., Antoranz Contera S, Kamihira M, Watts A, RyanJ.F. Differential stiffness and lipid mobility in the leaflets of purple membranes. Biophys.J. 2006; 90 (6): 2075-2085. DOI: 10.1529/biophysj.105.072405. PMID: 16387758
10. Buys A.V., Van Rooy M.J, Soma P., Van Papendorp D, Lipinski B, Pretorius E. Changes in red blood cell membrane structure in type 2 diabetes: a scanning electron and atomic force microscopy study. Cardiovasc. Dia-betol. 2013; 12: 25. DOI: 10.1186/1475-2840-12-25. PMID: 23356738
11. Kuznetsova T.G., Starodubtseva M.N., Yegorenkov N. I., Chizhik SA., Zhdanov R.I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 2007; 38 (8): 824-833. DOI: 10.1016/j.micron.2007.06.011. PMID: 17709250
12. Li M., Liu L., Xi N., Wang Y., DongZ, Xiao X, Zhang W. Atomic force microscopy imaging and mechanical properties measurement of red blood cells and aggressive cancer cells. Sci. China Life Sci. 2012; 55 (11): 968973. DOI: 10.1007/s11427-012-4399-3. PMID: 23160828
13. Yu M, Wang J, Wang H., Dong S. Calculation of the intracellular elastic modulus based on an atomic force microscope micro-cutting system. Chin. Sci. Bull. 2012; 57 (15): 1868-1872. DOI: 10.1007/s11434-012-5053-y
Эспериментальные исследования
15. Lekka M, Fornal M, Pyka-Fosciak G., Lebed K., Wizner B., Grodzicki T., Styczen J. Erythrocyte stiffness probed using atomic force microscope. Biorheology. 2005; 42 (4): 307-317. PMID: 16227658
16. Сергунова В.А., Козлова Е.К., Мягкова ЕА., Черныш А.М. Измерение упругоэластичных свойств мембраны нативных эритроцитов in vitro. Общая реаниматология. 2015; 11 (3): 39-44. DOI: 10.15360/18139779-2015-3-39-44
17. Shi X., ZhangX., Xia T., FangX. Living cell study at the single-molecule and single-cell levels by atomic force microscopy. Nanomedicine (Lond.). 2012; 7 (10): 1625- 1637. DOI: 10.2217/nnm.12.130. PMID: 23148543
18. BremmellK.E., Evans A., Prestidge CA. Deformation and nano-rheology of red blood cells: an AFM investigation. Colloids Surf. B. Biointerfaces. 2006; 50 (1): 43-48. DOI: 10.1016/j.colsurfb.2006.03.002. PMID: 16701986
19. Fisseha D, Katiyar V.K. Analysis of mechanical behavior of red cell membrane in sickle cell disease. Appl. Mathematics. 2012; 2 (2): 40-46. DOI: 10.5923/j.am.20120202.08
20. Sen S., Subramanian S., Discher D.E. Indentation and adhesive probing of a cell membrane with AFM: theoretical model and experiments. Bio-phys.J. 2005; 89 (5): 3203-3213. DOI: 10.1529/biophysj.105.063826. PMID: 16113121
21. Dupres V., Verbelen C., Dufrene Y.F. Probing molecular recognition sites on biosurfaces using AFM. Biomaterials. 2007; 28 (15): 2393-2402. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2006.11.011. PMID: 17126394
22. Liu S.C., Zhai S., Lawler J, PalekJ. Hemin-mediated dissociation of erythrocyte membrane skeletal proteins. J. Biol. Chem. 1985; 260 (22): 12234-12239. PMID: 4044594
23. Vadillo-Rodriguez V., Beveridge TJ., DutcherJ.R. Surface viscoelasticity of individual gram-negative bacterial cells measured using atomic force mi-croscopy.J. Bacteriol. 2008; 190 (12): 4225-4232. DOI: 10.1128/JB.00132-08. PMID: 18408030
24. Kozlova E.K., Chernysh A.M., Moroz V.V., Kuzovlev A.N. Analysis of nanos-tructure of red blood cells membranes by space Fourier transform of AFM images. Micron. 2013; 44: 218-227. DOI: 10.1016/j.micron.2012.06.012. PMID: 22854216
25. Kozlova E., Chernysh A., Moroz V., Gudkova O., Sergunova V., Kuzovlev A. Transformation of membrane nanosurface of red blood cells under hemin action. Sci. Rep. 2014; 4: 6033. DOI: 10.1038/srep06033. PMID: 25112597
26. Черныш А.М., Козлова Е.К., Мороз В.В, Сергунова В.А., Гудкова О.Е., Федорова М.С. Обратимые цинкиндуцируемые повреждения наноструктуры мембран красных клеток крови. Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2012; 154 (7): 95-99. PMID: 23330097
27. Kozlova E., Chernysh A., Moroz V., Sergunova V., Gudkova O., Fedorova M., Kuzovlev A. Opposite effects of electroporation of red blood cell membranes under the influence of zinc ions. Acta Bioeng. Biomech. 2012; 14 (1): 3-13. PMID: 22741531
28. Hekele O., Goesselsberger C.G., Gebeshuber I.C. Nanodiagnostics performed on human red blood cells with atomic force microscopy. Mater. Sci. Technol. 2008; 24 (9): 1162-1165. DOI: 10.1179/174328408X341834
29. Hartmann D. A multiscale model for red blood cell mechanics. Biomech. Model. Mechanobiol. 2010; 9 (1): 1-17. DOI: 10.1007/s10237-009-0154-5. PMID: 19440743
30. Fedosov D.A., Lei H., Caswell B., Suresh S., Karniadakis G.E. Multiscale modeling of red blood cell mechanics and blood flow in malaria. PLoS Com-put. Biol. 2011. 7 (12): e1002270. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1002270. PMID: 22144878
31. Mirijanian D.T., Voth GA. Unique elastic properties of the spectrin tetramer as revealed by multiscale coarse-grained modeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105 (4): 1204-1208. DOI: 10.1073/pnas.0707500105. PMID: 18202182
32. Shaklai N., AvissarN., Rabizadeh E., Shaklai M. Disintegration of red cell membrane cytoskeleton by hemin. Biochem. Int. 1986; 13 (3): 467-477. PMID: 3790141
33. Nakamura M., Bessho S., Wada S. Spring-network-based model of a red blood cell for simulating mesoscopic blood flow. Int. J. Numer. Method Biomed. Eng. 2013; 29 (1): 114-128. DOI: 10.1002/cnm.2501. PMID:
23293072
34. Parshina E.Yu., Sarycheva A.S., Yusipovich A.I., Brazhe N.A., Goodilin E.A., Maksimov G.V. Combined Raman and atomic force microscopy study of hemoglobin distribution inside erythrocytes and nanoparticle localization on the erythrocyte surface. Laser Physics Letters. 2013; 10 (7): 1-6. DOI: 10.1088/1612-2011/10/7/075607
35. Kim Y., Kim K., Park Y.K. Blood cell - an overview of studies in hematol-ogy. In: Moschandreou T.E. (ed.). Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Rijeka, Croatia; 2012: 167-195. DOI: 10.5772/50698
36. Gov N., Cluitmans J, Sens P., Bosman GJ.C.G.M. Chapter 4. Cytoskeletal control of red blood cell shape: theory and practice of vesicle formation. In: Advances in planar lipid bilayers and liposomes. v.10: 95-119. DOI: 10.1016/S1554-4516(09)10004-2
37. Hosseini S.M., FengJ.J. How malaria parasites reduce the deformability of infected red blood cells. Biophys. J. 2012; 103 (1): 1-10. DOI: 10.1016/j.bpj.2012.05.026. PMID: 22828326
Поступила 14.06.17
14. Sirghi L., Ponti J., Broggi F., Rossi F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. Eur. Biophys.J. 2008; 37 (6): 935-945. DOI: 10.1007/s00249-008-0311-2. PMID: 18365186
15. Lekka M., Fornal M., Pyka-Fosciak G., Lebed K., Wizner B., Grodzicki T., Styczen J. Erythrocyte stiffness probed using atomic force microscope. Biorheology. 2005; 42 (4): 307-317. PMID: 16227658
16. Sergunova VA., Kozlova E.K., Myagkova EA., Chernysh A.M. Chernysh A.M. In vitro measurement of the elastic properties of the native red blood cell membrane. Obshchaya Reanimatologiya = General Reanimatology. 2015; 11 (3): 39-44. DOI: 10.15360/1813-9779-2015-3-39-44. [In Russ., In Engl.]
17. Shi X., ZhangX., Xia T., FangX. Living cell study at the single-molecule and single-cell levels by atomic force microscopy. Nanomedicine (Lond.). 2012; 7 (10): 1625- 1637. DOI: 10.2217/nnm.12.130. PMID: 23148543
18. BremmellK.E., Evans A., Prestidge CA. Deformation and nano-rheology of red blood cells: an AFM investigation. Colloids Surf. B. Biointerfaces. 2006; 50 (1): 43-48. DOI: 10.1016/j.colsurfb.2006.03.002. PMID: 16701986
19. Fisseha D., Katiyar V.K. Analysis of mechanical behavior of red cell membrane in sickle cell disease. Appl. Mathematics. 2012; 2 (2): 40-46. DOI: 10.5923/j.am.20120202.08
20. Sen S., Subramanian S., Discher D.E. Indentation and adhesive probing of a cell membrane with AFM: theoretical model and experiments. Bio-phys. J. 2005; 89 (5): 3203-3213. DOI: 10.1529/biophysj.105.063826. PMID: 16113121
21. Dupres V., Verbelen C., Dufrene Y.F. Probing molecular recognition sites on biosurfaces using AFM. Biomaterials. 2007; 28 (15): 2393-2402. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2006.11.011. PMID: 17126394
22. Liu S.C., Zhai S., Lawler J., Palek J. Hemin-mediated dissociation of ery-throcyte membrane skeletal proteins. J. Biol. Chem. 1985; 260 (22): 12234-12239. PMID: 4044594
23. Vadillo-Rodriguez V., Beveridge TJ., DutcherJ.R. Surface viscoelasticity of individual gram-negative bacterial cells measured using atomic force microscopy J. Bacteriol. 2008; 190 (12): 4225-4232. DOI: 10.1128/JB.00132-08. PMID: 18408030
24. Kozlova E.K., Chernysh A.M., Moroz V.V., Kuzovlev A.N. Analysis of nanos-tructure of red blood cells membranes by space Fourier transform of AFM images. Micron. 2013; 44: 218-227. DOI: 10.1016/j.micron.2012.06.012. PMID: 22854216
25. Kozlova E., Chernysh A., Moroz V., Gudkova O., Sergunova V., Kuzovlev A. Transformation of membrane nanosurface of red blood cells under hemin action. Sci. Rep. 2014; 4: 6033. DOI: 10.1038/srep06033. PMID: 25112597
26. Chernysh A.M., Kozlova E.K., Moroz V.V., Sergunova V.A., Gudkova O.Ye., Fedorova M.S. Reversible zinc-induced injuries to erythrocyte membrane nanostructure. Bull. Exp. Biol. Med. 2012; 154 (1): 84-88. PMID: 23330097. [In Russ.]
27. Kozlova E., Chernysh A., Moroz V., Sergunova V., Gudkova O., Fedorova M., Kuzovlev A. Opposite effects of electroporation of red blood cell membranes under the influence of zinc ions. Acta Bioeng. Biomech. 2012; 14 (1): 3-13. PMID: 22741531
28. Hekele O., Goesselsberger C.G., Gebeshuber I.C. Nanodiagnostics performed on human red blood cells with atomic force microscopy. Mater. Sci. Technol. 2008; 24 (9): 1162-1165. DOI: 10.1179/174328408X341834
29. Hartmann D. A multiscale model for red blood cell mechanics. Biomech. Model. Mechanobiol. 92010; (1): 1-17. DOI: 10.1007/s10237-009-0154-5. PMID: 19440743
30. Fedosov D.A., Lei H., Caswell B., Suresh S., Karniadakis G.E. Multiscale modeling of red blood cell mechanics and blood flow in malaria. PLoS Com-put. Biol. 2011. 7 (12): e1002270. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1002270. PMID: 22144878
31. Mirijanian D.T., Voth GA. Unique elastic properties of the spectrin tetramer as revealed by multiscale coarse-grained modeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105 (4): 1204-1208. DOI: 10.1073/pnas.0707500105. PMID: 18202182
32. Shaklai N., Avissar N., Rabizadeh E., Shaklai M. Disintegration of red cell membrane cytoskeleton by hemin. Biochem. Int. 1986; 13 (3): 467-477. PMID: 3790141
33. Nakamura M., Bessho S., Wada S. Spring-network-based model of a red blood cell for simulating mesoscopic blood flow. Int.J. Numer. Method Biomed. Eng. 2013; 29 (1): 114-128. DOI: 10.1002/cnm.2501. PMID: 23293072
34. Parshina E.Yu., Sarycheva A.S., Yusipovich A.I., Brazhe N.A., Goodilin E.A., Maksimov G.V. Combined Raman and atomic force microscopy study of hemoglobin distribution inside erythrocytes and nanoparticle localization on the erythrocyte surface. Laser Physics Letters. 2013; 10 (7): 1-6. DOI: 10.1088/1612-2011/10/7/075607
35. Kim Y., Kim K., Park Y.K. Blood cell - an overview of studies in hematol-ogy. In: Moschandreou T.E. (ed.). Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Rijeka, Croatia; 2012: 167-195. DOI: 10.5772/50698
36. Gov N., CluitmansJ., Sens P., Bosman GJ.C.G.M. Chapter 4. Cytoskeletal control of red blood cell shape: theory and practice of vesicle formation. In: Advances in planar lipid bilayers and liposomes. v.10: 95-119. DOI: 10.1016/S1554-4516(09)10004-2
37. Hosseini S.M., FengJJ. How malaria parasites reduce the deformability of infected red blood cells. Biophys. J. 2012; 103 (1): 1-10. DOI: 10.1016/j.bpj.2012.05.026. PMID: 22828326
Received 14.06.17
