CC BY
49
ИЗМЕРЕНИЕ УПРУГО-ЭЛАСТИЧНЫХ СВОЙСТВ МЕМБРАНЫ НАТИВНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ IN VITRO
В. А. Сергунова1, Е. К. Козлова2, Е. А. Мягкова1, А. М. Черныш1
1 НИИ общей реаниматологии им. В. А. Неговского, Москва Россия, 107031, Москва, ул. Петровка, д. 25, стр. 2 2 Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова Минздрава России
Россия, 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2
In Vitro Measurement of the Elastic Properties of the Native Red Blood Cell Membrane
V. A. Sergunova1, E. K. Kozlova2, E. A. Myagkova1, A. M. Chernysh1
1 V. A. Negovsky Research Institute of General Reanimatology, Moscow 25, Petrovka St., Build. 2, Moscow 107031, Russia 2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation 8, Trubetskaya St., Build. 2, Moscow 119991, Russia
Цель исследования. Выработать методику получения изображений нативных клеток в физиологической среде, измерить локальную жесткость фиксированных мембран эритроцитов в жидкости в опытах in vitro. Материал и методы. Забор крови производили у четырех здоровых доноров в процессе профилактических осмотров. Кровь помещали в микроветты с ЭДТА. Эритроциты фиксировали в среде буферного раствора на подложку с покрытием полилизина. Изображение клеток получали с помощью АСМ NTEGRA Prima, (NT-MDT, РФ). Жесткость мембран оценивали с помощью метода атомно-силовой спектроскопии. Результаты. Получены значения эффективного модуля Юнга для статистической выборки фиксированных мембран эритроцитов. При действии верапамила на кровь модуль Юнга был равен 528±21кП. При действии на кровь ионов тяжелых металлов средняя локальная жесткость высушенной мембраны была увеличена до 942±56 на глубине 35 нм. Выводы. Измерения силовых характеристик эритроцитов в жидкости позволяют получать воспроизводимые результаты исследований упруго-эластичных свойств мембран. С помощью метода атомной силовой микроскопии и атомно-силовой спектроскопии можно анализировать свойства живой клетки в физиологической среде. Ключевые слова: мембраны, нативные клетки, упруго-эластичные свойства, атомно-сило-вая спектроскопия.
Objective: to develop a procedure to image native cells in a physiological medium and to measure the local stiffness of fixed red blood cell membranes in liquid in vitro experiments. Material and methods. Blood was taken from 4 healthy donors during prophylactic examinations and placed in EDTA-containing Microvette tubes. The red blood cells were fixed in buffer solution onto a polylysine-coated substrate. Cell images were obtained using an ACM NTEGRA Prima microscope (NT-MDT, the Russian Federation). Membrane stiffness was estimated by atomic force spectroscopy. Results. The values of effective Young's modulus were obtained for a statistical sample of fixed red blood cell membranes. Under the action of verapamil on blood, Young's modulus was equal to 528±21 kP. Under the action of heavy metal ions on blood, the mean local stiffness of the dried membrane was increased up to 942±56 at a depth of 35 nm. Conclusion. The measurements of the force characteristics of red blood cells in liquid can yield reproducible results of examining the elastic properties of the membranes. Atomic force microscopy and atomic force spectroscopy can be employed analyze the properties of a live cell in the physiological medium. Key words: membranes, elastic properties, atomic force spectroscopy, erythrocytes.
DOI:10.15360/1813-9779-2015-3-39-44
Введение Introduction
Одной из важных задач реаниматологии является определение упруго-эластичных свойств эритроцитов при критических состояниях. Эти свойства обеспечивают эффективность транспорта клеток в системе сосудов микроциркуляции и оксигенацию тканей. Для ис- One of the important problems of reanimatology is determining the elasticity patterns of erythrocytes in critical illness. These properties ensure efficient cell transfer in vascular microcirculation and effective tissue oxygenation. Different techniques are used to investigate the deforma-
Адрес для корреспонденции: Correspondence to:
Виктория Сергунова E-mail: [email protected] Victoria Sergunova E-mail: [email protected]
следования деформируемости эритроцитов используют разные методы: фильтрацию через поры с диаметрами около 5 мкм, методы лазерной дифрактометрии [1]. Однако это косвенные методы изучения деформируемости эритроцитов. Прямым методом изучение упруго-эластичных свойств эритроцитов является атомно-силовая спектроскопия (АСС) [2]. Атомная силовая микроскопия (АСМ) и АСС позволяют непосредственно наблюдать биологические объекты в реальном времени и изучать их механические свойства. При этом АСМ обеспечивает получение изображений поверхности мембран в нанодиапазоне [3, 4], а АСС позволяет исследовать деформируемость и жёсткость биологических объектов [5, 6], в том числе мембран клеток и их фрагментов [7, 8].
Оба эти метода реализуются с помощью атомного силового микроскопа (АСМ) на одной аппаратуре и на одних и тех же образцах. Измерение жёсткости проводится после получения изображений мембран или их фрагментов в поле АСМ [9]. На выбранные участки измерения жёсткости действуют зондом с заданной силой. По деформации биологической структуры делается заключение о жесткости материала и его механических свойствах. Деформируемость и жёсткость мембран эритроцитов меняется при заболеваниях — при сахарном диабете, ишемии миокарда, гипертонии [10, 11], у больных с онкологическими заболеваниями [12, 13]. Изучение нативных биологических объектов на АСМ в жидкости представляет собой технически и методически сложное направление [14, 15], поскольку живые клетки — мягкие объекты, которые плавают в растворе. Для проведения исследований их необходимо зафиксировать на подложке и сформировать монослой [16].
АСМ и АСС расширяет возможности получения информации об эритроцитах, потому что оба метода пригодны для исследования характеристик живых клеток в буфере на наноразмерном уровне.
Цель работы — разработать методику получения изображений нативных клеток в жидкой среде, измерить локальную жесткость мембран эритроцитов при различных условиях в жидкости в опытах in vitro.
Материал и методы
Забор крови производили у четырех здоровых доноров. В соответствии с требованиями этического комитета НИИ общей реаниматологии им. В. А. Неговского было получено согласие всех доноров на проведение исследований. Кровь в объеме 200 мкл помещали в микроветты с ЭДТА (Sarstedt AG and Co., Germany).
Цельную кровь разделяли на плазму и эритроциты с помощью центрифугирования (центрифуга «Hettich Mikro 220R» (Германия) в течение 10 минут, 1000 об/мин). Надоса-дочную жидкость, содержащую плазму, удаляли и к эритроцитам добавляли раствор буфера (фосфатно-солевой буфер (PBS, pH 7,4) для восстановления исходного объема.
Для стабилизации мембраны в приготовленную суспензию добавляли 100 мкл 1% глутарового альдегида и инкубировали в течение 30 минут, после чего эритроциты отмывали дистиллированной водой. В отмытые эритроциты добавляли
bility of erythrocytes: filtration through pores with diameters of about 5 micron, methods of laser diffraction [1]. However, all of this are indirect methods for studying the deformability of red blood cells. Direct method to study the elasticity of erythrocyte membrane is an atomic force spectroscopy (AFS) [2]. Atomic force microscopy (AFM) and AFC allows both direct observing the biological objects in real time and determining their mechanical properties.
AFM allows to obtain images of the membranes surface in the nano range [3, 4]. AFS allows to investigate the deformability and rigidity of biological objects [5, 6] including cell membranes and its fragments [7, 8].
Both of these methods are realized using atomic force microscopes (AFM) on the same equipment and on the same samples. Measurement of rigidity in the AFM field is conducted following acquisition of imagesof the membranes or their fragments by AFM [9]. Probe with a given force affects the selected areas of interest to determine local rigidity. Deformation of biological structures is informative for a rigidity determining of the material and evaluating the mechanical properties of the object. Deformability of erythrocyte membranes and rigidity are changing in various diseases including diabetes, myocar-dial ischemia, hypertension [10, 11], cancer [12, 13].
Studying native biological objects in fluid with AFM is technically complecated [14, 15] since living cells represent soft objects that float in the solution. For research purposes it is necessary to fix them on the substrate and use a cell monolayer [16]. Therefore, the AFM and AFC expand possibilities of gathering information about ery-throcytes making possible to study membrane properties of living cells in the buffer at the nanoscale
The goal of the study was developing a technique for obtaining images of native cells in a physiological environment, to measure the local rigidity of the erythrocytes membranes in fluid in experiment in vitro.
Materials and Methods
Blood samples were harvested from four healthy donors following obtaining the informed consent from each donor in accordance to requirements of the Ethics Committee of the V. A. Negovsky Institute of General Reanimatology.. Blood was placed in microvet-ty with EDTA (Sarstedt AG and Co., Germany). Whole blood was divided to plasma and erythrocytes by centrifugation for 10 min at 1000 rpm (centrifuge «Hettich Mikro 220R», Germany).Supernatant containing plasma was discarded and the original volume was restored with phosphate buffered saline (PBS, pH 7,4). For erythrocyte membrane 0,1 ml of 1% glu-taraldehyde was added for 30 minutes anderythrocytes were centrifuged in the presence of distilled water added.
The resulting slurry was aliquoted onto a glass coated with polylysine (0,5 mg/ml for one hour in a Petri dish followed by drying on air during 2 hours) and allowed to adhere for 10 minutes, then dipped in a 1% glutaraldehyde for 5 seconds to fix the cells to the glass surface. The resulting sample was washed in PBS and scannned by AFM.
Images were acquired by AFM NTEGRA Prima (NT MDT, Russia) in a liquid using an insert (model AU028NTF) with open liquid cell. Scanning was performed in a contact mode. The number of scan points were 512. Rigidity was evaluated by AFC. This
буфер PBS (pH 7,4) в количестве 5 мл. Фиксацию эритроцитов к стеклу в среде буферного раствора, проводили с помощью полилизина. Для этого чистые обезжиренные покровные стекла помещали на 1 час в чашку Петри с раствором полилизина 0,5 мг/мл. После чего высушивали их на воздухе в течение 2 часов.
Полученную суспензию наносили на стекла с полилизи-новым покрытием и оставляли для адгезии на 10 минут, затем опускали в 1% глутаровый альдегид на 5 секунд для улучшения фиксации клеток к стеклу. Полученный образец промывали в PBS (pH 7,4) и приступали к сканированию данного образца с помощью АСМ.
Для получения изображений с помощью АСМ NTEGRA Prima (NT MDT, Россия) в жидкости использовали измерительный вкладыш модели AU028NTF с открытой жидкостной ячейкой. Сканирование производили в контактном режиме. Число точек сканирования — 512. Жесткость мембраны оценивали с помощью метода атомно-силовой спектроскопии. Метод позволяет измерять величину деформации поверхности мембраны и кантилевера в зависимости от вертикального смещения пьезосканера, на котором помещена мембрана [2].
Для получения изображения и измерения деформации мембраны в буфере использовали кантилеверы типа SD-R150-T3L450B-10. Радиус зонда кантилевера 150 нм, коэффициент упругости 0,15 Н/м.
Измерения локальной жёсткости мембраны сухих эритроцитов проводили кантилеверами SD-R150-NCL-10. Радиус зонда кантилевера 150нм. Коэффициент упругости кантиле-вера 30 Н/м.
Результаты и обсуждение
Для оценки упруго-эластичных свойств мембраны построили зависимость F (h), где F — сила, h — глубина индентации зонда в мембрану.
Для определения модуля Юнга (Е) использовали модель Герца (1), которая описывает деформацию мембраны при действии на нее сферического зонда: F=(4/3)ER05h(3/2) (1),
где: F — Сила; E — модуль Юнга мембраны; R — радиус зонда; h — глубина индентации.
По зависимости F(h), можно оценить величину E для разных глубин погружения зонда.
Изображения эритроцитов, полученные в жидкости, и 3D профиль указанной стрелкой клетки, представлены на рис. 1. Диаметр эритроцита 8517 нм, высота 1125 нм, глубина впадины 468 нм.
Изначально АСМ изображения клетки при сканировании в жидкости имеют более низкое пространственное разрешение по сравнению с изображением сухих клеток. Качество полученных изображений эритроцитов в жидкости зависит от образца, от выбора
О 2000 4000 6000 8000 10000 12000 nm dX: 3143.78 nindY: -638.712 nin
Рис. 1. Изображение нативных эритроцитов в жидкости и профиль эритроцита, указанного стрелкой. Fig. 1. Image of native erythrocytes in a liquid and the profile of the erythrocyte, indicated by the arrow.
method allows measuring the deformation of the membrane and cantilever depending on the vertical displacement of a piezoscan-ner, on which the membrane is placed [12]. To acquire images and measure the deformation of the membrane the type SD-R150-T3L450B-10 cantilever was used. The radius of the cantilever probe was 150 nm, coefficient of elasticity was 0.15 N/m.
Measurement of local stiffness of the dry membrane of erythrocytes was performed with cantilevers of SD-R150-NCL-10 type. The radius of the cantilever probe was 150 nm, coefficient of the cantilever elasticity was 30 N/m.
Results and Discussion
For evaluation of elastic properties of the membrane the dependence F (h) was plotted, where F — force, h — depth of probe indentation into the membrane.
Determination of the Young's modulus was performed using the Hertz model (1), which describes the deformation of the membrane under the action of its spherical probe:
Выборка для измерения tg силовой кривой для стекла и мембраны эритроцита в жидкости. Determining tg of force curve for glass and erythrocyte membrane in liquid microenvironment.
Conditions Number Number Number scans Number of Number of All objects
of donors of samples of on sample studying local measure- cells points
cells on sample ments on cell
Glass 5 3 15
Sample with erythrocytes 4 4 2 5—15 6 120 720
Note (примечание): Conditions — условия; glass — стекло; sample with erythrocytes — образец с эритроцитами; number — число: donors — доноров; samples scans on sample — сканов на образце; studying cells on sample — исследуемых клеток на образце; local measurements on cell — локальных измерений на клетке; all objects — всего объектов; cells — клеток; points — точек.
n 11)1) 3.1)0 JI.HJ 4D0 suti лио TT«tjiii,md 200 250 JliW 350 400 Height,tun
Рис. 2. Кривые измерения жесткости в жидкости: a — стекла; b — мембраны эритроцита. Fig. 2. The curves in measurement of rigidity in liquid: glass (a) vs. erythrocyte membrane (b).
Рис. 3. Эмпирическая зависимость F(h) (1) и теоретическая аппроксимация (2) для мембраны эритроцита в жидкости. Fig. 3. Empirical relationship F (h) (1) and theoretical approximation (2) for the erythrocyte membrane in the fluid. Note (примечание): h (depth of indentation probe, nm) — глубина индентации зонда , нм; F (h) (empirical dependence) — эмпирическая зависимость; kPa — кПа; nN — нН (нананьютон).
оптимальных специфических режимов работы АСМ и квалификации исследователя.
На рис. 2 приведены силовые кривые, полученные в жидкости: для стекла (tg<p = 6) (рис. 2, а), и силовая кривая для мембраны эритроцита (tg^=3,3) (рис. 2, б).
Общее количество измерений локальной жесткости мембраны эритроцита представлено в табл. 1.
Производили преобразование исходной эмпирической функции I (AZ) в зависимость F(h), где AZ — подъем пьезосканера (нм); I — ток рассогласования фотодиода (нА); h — глубина индентации зонда (нм).
f=k(vo-az
1м и 1ст — токи рассогласования для мембраны и стекла соответственно.
Полученная эмпирическая зависимость F(h) представлена на рис. 3. Эта эмпирическая зависимость была аппроксимированна теоретической зависимостью (1).
F=(4/3)ER05h(3/2) (1)
F — force; E — Young's modulus of the membrane; R — probe radius, h the depth of indentation.
We can estimate E for different depths of probe immersion according to the dependence of F (h).
Images of erythrocytes obtained in liquid and the 3D profile of cells are shown in Figure 1. The diameter of the erythrocyte was 8517 nm, height was 1125 nm, the depth was 468 nm.
AFM images of the cells originally scanned in the fluid have a low spatial resolution compared to the images of dry cells. Quality of red blood cells images in a liquid depends on the sample, depends on optimum operating conditions of the AFM and experience of a researcher. Figure 2 (a) shows the power curve obtained for the glass in the fluid (tg^=6), and Figure 3 (b) illustrates the power curve for the erythrocyte membrane, (tg^=3.3).
The total number of local rigidity measurements of the erythrocyte membrane is shown in Table 1.
Original empirical function I (AZ) was converted into dependence F (h), where AZ — rises of a piezoscanner (nm), I — differential current of photodiode (nA), h — depth of indentation probe (nm).
F=K(IM/ICT) • AZ
Im h Ict — differential currents for membrane and glass, correspondingly.
The resulting empirical dependence F (h) is shown in Figure 3. These empirical relationships were approximated by theoretical dependence (1).
It was assumed that the mechanical properties of the erythrocyte membrane are uniform. The average values of the Young's modulus of the membrane of red blood cells in the fluid were 310—680 kPa. The specified dispersion was defined as different objects of measurement (cells) and difference of the local properties of the erythrocyte. The Young's modulus on the torus of the cell membrane was 576 kPa (Fig. 1).
Dry erythrocyte membrane is not uniform, and the modulus E for different values of h are different. Empirical
Рис. 4. Эмпирическая зависимость F(h) для мембраны эритроцита высушенного на воздухе; Eef i — графики модели (1) для различных значений эффективного модуля Юнга. Fig. 4. Empirical relationship F (h) for the dry erythrocyte membrane on air; Eef i — graphic model (1) for different values of the effective Young's modulus.
Note (примечание): h (depth of indentation probe, nm) — глубина индентации зонда, нм; F (h) (empirical dependence) — эмпирическая зависимость; nN — нН (нананьютон).
dependence F (h) of the dry erythrocyte membrane is shown in Figure 4, which displays changes of Young's modulus for different depths of indentation probe. The point of intersection of the graphs of the Hertz model with empirical curve provides a quantitative estimation of the effective Young's modulus of the membrane at depths hi. Measuring the elasticity of the membrane of dry red blood cells was performed by a cantilever SD-R150-NCL-10. The radius of the probe cantilever was 150 nm. The coefficient of elasticity of the cantilever was 30 N/m.
The empirical dependence of F(h) under the action of verapamil on the blood was approximated by a model (1), as in control cells (Fig. 3), and the average value of Young's modulus was 528±21kP. During action of heavy metal ions on the blood the empirical dependence F(h) for the dried cells was close to the function shown in Figure 4. The average value of local stiffness was increased (942±56kP at a depth of 35 nm). Therefore, measuring the power characteristics of red blood cells in the fluid allows obtaining reproducible results when determining the elasticity patterns of membranes.
Using the methods of AFM and AFS it is possible to analyze properties and morphology of living cells directly in a physiological environment.
При этом предполагается, что механические свойства мембраны эритроцита однородны. Значения модуля Юнга фиксированных мембран нормальных эритроцитов измеренные в жидкости лежали в пределах 310—680 кПа. Указанный разброс определялся как различными объектами (клетками) измерения, так и различием локальных свойств эритроцита. Модуль Юнга на торе мембраны клетки указанной на рис. 1 составил 576 кПа.
Мембрана сухого эритроцита неоднородна, и модуль E для разных величин h различен. Эмпирическая зависимость F(h) мембраны сухого эритроцита представлена на рис. 4, где представлены изменения модуля Юнга для различных глубин индентации зонда. Точки пересечения графиков модели Герца с эмпирической кривой дают количественную оценку эффективного модуля Юнга мембраны на глубинах hi.
Литература
1. Муравьев А.А., Муравьев А.В., Тихомирова И.А., Булаева С.В., Май-мистова А.А. Методы изучения деформируемости эритроцитов в эксперименте и клинике. Клин. лабор. диагностика. 2010; 1: 28—29. PMID: 20201374
2. Сергунова В.А., Гудкова О.Е., Козлов А.П., Черныш А.М. Измерение локальной жесткости мембран эритроцитов с помощью атомно-си-ловой спектроскопии. Общая реаниматология. 2013; 9 (1): 14—17. http://dx.doi.org/10.15360/1813-9779-2013-1-14
3. Kozlova E.K., Chernysh A.M., Moroz V.V., KuzovlevA.N. Analysis of nanostructure of red blood cells membranes by space Fourier transform of AFM images. Micron. 2013; 44: 218—227. http://dx.doi.org/10. 1016/j.micron.2012.06.012. PMID: 22854216
4. Kozlova E., Chernysh A., Moroz V., Gudkova O., Sergunova V., Kuzovlev A. Transformation of membrane nanosurface of red blood cells under hemin action. Sci. Rep. 2014; 4: 6033. http://dx.doi.org/10.1038/ srep06033. PMID: 25112597
5. Dupres V., Verbelen C, Dufrene Y.F. Probing molecular recognition sites on biosurfaces using AFM. Biomaterials. 2007; 28 (15): 2393—2402. http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2006.11.011. PMID: 17126394
Эмпирическая зависимость F(h) при действии верапамила на кровь аппроксимировалась моделью (1), как и у контрольных клеток (рис. 3), а среднее значение модуля Юнга составило 528±21кП. При действии на кровь ионов тяжелых металлов эмпирическая зависимость F(h) для высушенных клеток была близка к функции, представленной на рис. 4. Средняя величина локальной жесткости была увеличена и составила E=942±56 на глубине 35 нм. Измерение силовых характеристик эритроцитов в жидкости позволяет получать воспроизводимые результаты исследований упруго-эластичных свойств мембран.
Таким образом, с помощью метода атомной силовой микроскопии и атомно-силовой спектроскопии можно анализировать эластично-упругие свойства живой клетки, непосредственно в физиологической среде.
References
1. Muravyev A.A., Muravyev A.V., Tikhomirova I.A., Bulaeva S.V., Maimistova A.A. Metody izucheniya deformiruemosti eritrotsitov v eksperimente i klinike. [Techniques for experimental and clinical studies of erythrocyte deformability]. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika. 2010; 1: 28—29. PMID: 20201374. [In Russ.]
2. Sergunova V.A., Gudkova O.E., Kozlov A.P., Chernysh A.M. Izmerenie lokalnoi zhestkosti membran eritrotsitov s pomoshchyu atomno-silovoi spektroskopii. Obshchaya Reanimatologiya. [Measurement of the local tension of red blood cell membranes by atomic force spec-troscopy. General Reanimatology]. 2013; 9 (1): 14—17. http://dx.doi.org/10.15360/1813-9779-2013-1-14. [In Russ.]
3. Kozlova E.K., Chernysh A.M., Moroz V.V., KuzovlevA.N. Analysis of nanostructure of red blood cells membranes by space Fourier transform of AFM images. Micron. 2013; 44: 218—227. http://dx.doi.org/10. 1016/j.micron.2012.06.012. PMID: 22854216
4. Kozlova E., Chernysh A., Moroz V., Gudkova O., Sergunova V., Kuzovlev A. Transformation of membrane nanosurface of red blood cells under hemin action. Sci. Rep. 2014; 4: 6033. http://dx.doi.org/10.1038/ srep06033. PMID: 25112597
6. Butt H.-J., Cappella B., Kappl M. Force measurements with the atomic force microscope: technique, interpretation and applications. Surface Sci. Rep. 2005; 59: 1-152. http://dx.doi.org/10.10167j.surfrep.2005. 08.003
7. Kim Y, Kim K., Park Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. In: Moschandreou T.E. (ed.). Blood cell — an overview of studies in hematology. Croatia, 2012: 167—195. http://dx.doi.org/10.5772/50698
8. Roduit C, van der Goot F.G., De Los Rios P., Yersin A., Steiner P., Dietler G, Catsicas S, Lafont F., Kasas S. Elastic membrane heterogeneity of living cells revealed by stiff nanoscale membrane domains. Biophys. J. 2008; 94 (4): 1521 — 1532. http://dx.doi.org/10.1529/bio-physj.107.112862. PMID: 17981897
9. Мороз В.В., Голубев А.М., Козлова Е.К., Афанасьев А.В., Гудкова О.Е., Новодержкина И.С., Марченков Ю.В., Кузовлев А.Н., Заржецкий Ю.В., Костин А.И., ВолковД.П., Яковлев В.Н. Динамика морфологических изменений эритроцитов и биохимических показателей консервированной цельной крови в различные сроки хранения. Общая реаниматология. 2013; 9 (1): 5—13. http://dx.doi.org/10.15360/ 1813-9779-2013-1-5
10. Мороз В.В., Мягкова Е.А., Сергунова ВА., Гудкова О.Е., Остапченко ДА, Черныш А.М., Решетняк В.И. Морфологические особенности эритроцитов у больных с тяжёлой сочетанной травмой. Общая реаниматология. 2013; 9 (3): 14—23. http://dx.doi.org/10.15360/1813-9779-2013-3-14
11. Мороз В.В., Сергунова ВА., Назаров Б.Ф., Козлова Е.К., Черныш А.М., Власов И.Б. Изменения наноструктуры мембран красных клеток крови при кровопотере на этапах хирургического лечения у больных при операциях на спинном мозге. Общая реаниматология. 2013; 9 (2): 5—11. http://dx.doi.org/10.15360/1813-9779-2013-2-5
12. Voitchovsky K, Antoranz Contera S., Kamihira M., Watts A., Ryan J.F. Differential stiffness and lipid mobility in the leaflets of purple membranes. Biophys. J. 2006; 90 (6): 2075—2085. http://dx.doi. org/10.1529/biophysj.105.072405. PMID: 16387758
13. Lekka M., Fornal M., Pyka-Fosciak G., Lebed K., Wizner B., Grodzicki T., StyczenJ. Erythrocyte stiffness probed using atomic force microscope. Biorheology. 2005; 42 (4): 307—317. PMID: 16227658
14. Buys A.V., Van Rooy M.J., Soma P., Van Papendorp D., Lipinski B., Pretorius E. Changes in red blood cell membrane structure in type 2 diabetes: a scanning electron and atomic force microscopy study. Cardiovasc. Diabetol. 2013; 12: 25. http://dx.doi.org/10.1186/1475-2840-12-25. PMID: 23356738
15. Li M, Liu L, Xi N, Wang Y., Dong Z., Xiao X., Zhang W. Atomic force microscopy imaging and mechanical properties measurement of red blood cells and aggressive cancer cells. Sci. China Life Sci. 2012; 55 (11): 968—973. http://dx.doi.org/10.1007/s11427-012-4399-3. PMID: 23160828
16. Yu M., Wang J., Wang H.X., Liu L., Yan Y., Zhang J., Liang Y., Dong S. Calculation of the intracellular elastic modulus based on an atomic force microscope micro-cutting system. Sci. Bul. 2012; 57 (15): 1868— 1872. http://dx.doi.org/10.1007/s11434-012-5053-y
17. Мороз В.В., Черныш А.М., Козлова Е.К., Сергунова В.А., Гудкова О.Е., Федорова М.С., Кирсанова А.К., Новодержкина И.С. Нарушение наноструктуры мембран эритроцитов при острой кровопотере и их коррекция перфторуглеродной эмульсией. Общая реаниматология. 2011; 7 (2): 5—9. http://dx.doi.org/10.15360/1813-9779-2011-2-5
18. Мороз В.В., Голубев А.М., Афанасьев А.В., Кузовлев А.Н., Сергунова ВА., Гудкова О.Е., Черныш А.М. Строение и функция эритроцита в норме и при критических состояниях. Общая реаниматология. 2012; 8 (1): 52—60. http://dx.doi.org/10.15360/1813-9779-2012-1-52
19. Ефремов Ю.М., Багров Д.В., Дубровин Е.В., Шайтан К.В., Яминский И.В. Атомно-силовая микроскопия животных клеток: обзор достижений и перспективы развития. Биофизика. 2011; 56 (2): 288-303. PMID: 21542359
Поступила 26.01.2015
5. Dupres V., Verbelen C., Dufrêne Y.F. Probing molecular recognition sites on biosurfaces using AFM. Biomaterials. 2007; 28 (15): 2393— 2402. http://dx.doi.org/10.10167j.biomaterials.2006.11.011. PMID: 17126394
6. Butt H.-J., Cappella B., Kappl M. Force measurements with the atomic force microscope: technique, interpretation and applications. Surface Sci. Rep. 2005; 59: 1 — 152. http://dx.doi.org/10.10167j.surfrep.2005. 08.003
7. Kim Y., Kim K., Park Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. In: Moschandreou T.E. (ed.). Blood cell — an overview of studies in hematology. Croatia, 2012: 167—195. http://dx.doi.org/10.5772/50698
8. Roduit C., van der Goot F.G., De Los Rios P., Yersin A., Steiner P., Dietler G., Catsicas S., Lafont F., Kasas S. Elastic membrane heterogeneity of living cells revealed by stiff nanoscale membrane domains. Biophys. J. 2008; 94 (4): 1521 — 1532. http://dx.doi.org/10.1529/bio-physj.107.112862. PMID: 17981897
9. Moroz V.V., Golubev A.M., KozlovaE.K., Afanasyev A.V., Gudkova O.E., NovoderzhkinaI.S., Marchenkov Yu.V., Kuzovlev A.N., Zarzhetsky Yu.V., Kostin A.I., Volkov D.P., Yakovlev V.V. Dinamika morfologicheskikh izmenenii eritrotsitov i biokhimicheskikh pokazatelei konservirovan-noi tselnoi krovi v razlichnye sroki khraneniya. Obshchaya Reanimatologiya. [Time course of morphological changes in red blood cells and stored whole blood biochemical parameters in different storage periods. General Reanimatology]. 2013; 9 (1): 5—13. http://dx.doi.org/10.15360/1813-9779-2013-1-5. [In Russ.]
10. Moroz V.V., Myagkova E.A., Sergunova V.A., Gudkova O.E., Ostapchenko D.A., Chernysh A.M., Reshetnyak V.I. Morfologicheskie osobennosti eritrotsitov u bolnykh s tyazheloi sochetannoi travmoi. Obshchaya Reanimatologiya. [Morphological features of red blood cells in patients with severe concomitant injury. General Reanimatology]. 2013; 9 (3): 14—23. http://dx.doi.org/10.15360/1813-9779-2013-3-14. [In Russ.]
11. Moroz V.V., Sergunova VA., Nazarov B.F., Kozlova E.K., Chernysh A.M., Vlasov I.B. Izmeneniya nanostruktury membran krasnykh kletok krovi pri krovopotere na etapakh khirurgicheskogo lecheniya u bolnykh pri operatsiyakh na spinnom mozge. Obshchaya Reanimatologiya. [Changes in the nanostructure of red blood cells in intraoperative blood loss during spinal cord surgery. General Reanimatology]. 2013; 9 (2): 5—11. http://dx.doi.org/10.15360/1813-9779-2013-2-5. [In Russ.]
12. Voïtchovsky K., Antoranz Contera S., Kamihira M., Watts A., Ryan J.F. Differential stiffness and lipid mobility in the leaflets of purple membranes. Biophys. J. 2006; 90 (6): 2075—2085. http://dx.doi. org/10.1529/biophysj.105.072405. PMID: 16387758
13. Lekka M., Fornal M., Pyka-Fosciak G., Lebed K., Wizner B., Grodzicki T., Styczen J. Erythrocyte stiffness probed using atomic force microscope. Biorheology. 2005; 42 (4): 307—317. PMID: 16227658
14. Buys A.V., Van Rooy M.J., Soma P., Van Papendorp D., Lipinski B., Pretorius E. Changes in red blood cell membrane structure in type 2 diabetes: a scanning electron and atomic force microscopy study. Cardiovasc. Diabetol. 2013; 12: 25. http://dx.doi.org/10.1186/1475-2840-12-25. PMID: 23356738
15. Li M., Liu L., Xi N., Wang Y., Dong Z., Xiao X., Zhang W. Atomic force microscopy imaging and mechanical properties measurement of red blood cells and aggressive cancer cells. Sci. China Life Sci. 2012; 55 (11): 968—973. http://dx.doi.org/10.1007/s11427-012-4399-3. PMID: 23160828
16. Yu M., Wang J., Wang H.X., Liu L., Yan Y., Zhang J., Liang Y., Dong S. Calculation of the intracellular elastic modulus based on an atomic force microscope micro-cutting system. Sci. Bull. 2012; 57 (15): 1868— 1872. http://dx.doi.org/10.1007/s11434-012-5053-y
17. Moroz V.V., Chernysh A.M., Kozlova E.K., Sergunova V.A., Gudkova O.E., Fedorova M.S., Kirsanova A.K., Novoderzhkina I.S. Narushenie nanostruktury membran eritrotsitov pri ostroi krovopotere i ikh kor-rektsiya perftoruglerodnoi emulsiei. Obshchaya Reanimatologiya. [Impairments in the nanostructure of red blood cell membranes in acute blood loss and their correction with perfluorocarbon emulsion. General Reanimatology]. 2011; 7 (2): 5—9. http://dx.doi.org/ 10.15360/1813-9779-2011-2-5. [In Russ.]
18. Moroz V.V., Golubev A.M., Afanasyev A.V., Kuzovlev A.N., Sergunova V.A., Gudkova O.E., Chernysh A.M. Stroenie i funktsiya eritrotsita v norme i pri kriticheskikh sostoyaniyakh. Obshchaya Reanimatologiya. [The structure and function of a red blood cell in health and critical conditions. General Reanimatology]. 2012; 8 (1): 52—60. http://dx.doi.org/10.15360/1813-9779-2012-1-52. [In Russ.]
19. Efremov Yu.M., Bagrov D.V., Dubrovin E.V., Shaitan K.V., Yaminsky I.V.
Atomno-silovaya mikroskopiya zhivotnykh kletok: obzor dostizhenii i perspektivy razvitiya. [Atomic force microscopy of living cells: advances and future outlooks]. Biofizika. 2011; 56 (2): 288-303. PMID: 21542359. [In Russ.]
Submited 26.01.2015
