CC BY
88
КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ БИОАНАЛИТИЧЕСКОЙ ЧАСТИ ИЗУЧЕНИЯ БИОЭКВИВАЛЕНТНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
В.В. Чистяков
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации», Москва
Резюме: В изучении биоэквивалентности воспроизведенных лекарственных препаратов биоаналитическая часть является важнейшим экспериментальным разделом, от качества проведения которого зависит достоверность выводов о взаимозаменяемости препаратов. Исследование биоэквивалентности — вид клинического исследования, проведение которого осуществляется для определения скорости всасывания и выведения фармацевтической субстанции, количества фармацевтической субстанции, достигающего системного кровотока. Окончательное заключение о биоэквивалентности (или небиоэквивалентности) сравниваемых препаратов делается на основе фармакокинетического анализа, сопровождающегося статистической обработкой данных. От выбранного аналитического метода и методик, используемых при количественном определении анализируемого вещества в биообъекте, зависит правильность вывода о фармакокинетическом подобии тестируемого препарата и препарата сравнения. Ключевые слова: биоэквивалентность, биоаналитическая часть, валидация.
CERTAIN ASPECTS OF THE BIOANALYTICAL PART OF DRUG BIOEQUIVALENCE STUDIES
V.V. Chistyakov
Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow Abstract: Bioanalytical studies are the most important experimental part of generic drugs bioequivalence studies. It affects the reliability of the conclusions regarding drug interchangeability. Bioequivalence study is a type of clinical study, carried out to determine the rate of absorption and excretion of a pharmaceutical substance, as well as the quantity of a substance reaching the systemic circulation. The final conclusion on bioequivalence (or non-bioequivalence) of the drugs compared, is made on the basis of pharmacokinetic analysis, along with statistical data processing. Analytical methods and techniques selected for the quantitative determination of an analyte in biological object defines the reliability of the conclusion, concerning pharmacokinetic similarity of test and reference preparations.
Key words: bioequivalence, bioanalytical part, validation.
Заключение о биоэквивалентности (или небиоэк-вивалентности) сравниваемых препаратов делается на основе фармакокинетического анализа, сопровождающегося статистической обработкой данных. Основными критериями биоэквивалентности являются степень и скорость всасывания, время достижения максимальной концентрации в крови и её значение, т.е. два препарата биоэквивалентны, если они эквивалентны фармакокинетически. Таким образом, фактически, от аналитического метода и методик, используемых при количественном определении анализируемого вещества в биообъекте (плазма, сыворотка, цельная кровь) во многом зависит правильность вывода о фармакокинетическом подобии тестируемого и референс препаратов.
В методических рекомендациях РФ 2012 г (Руководство по проведению клинических исследований лекарственных средств. Часть. I. Глава 4. Методические рекомендации по оценке биоэквивалентности лекарственных препаратов): «Для опpеделения конценфации лекарственных средств в биологических жидкостях могут быть использованы pазличные
методы (физико-химические, иммунологические, микpобиологические и до.), обеспечивающие возможность получения достоверных данных о концендоации лекарственного средства дои выданных условиях фаpмакокинетического исследования, в частности, его длительности, и отвечающие общим доебованиям селективности, точности и восдооизводимости». Аналитический метод должен быть валидирован, то есть иметь обоснование адекватности и достоверности.
Вместе с тем, с развитием современной аналитической техники, новых возможностей по количественному анализу малых количеств веществ в биологических жидкостях, есть потребность остановиться на некоторых особенностях биоаналитической части изучения биоэквивалентности.
ВЫБОР МЕТОДА
По существующим нормам предполагаемый метод количественного анализа препарата в биообъекте прописывается уже в протоколе клинического исследования биоэквивалентности, который в дальнейшем
утверждается. Здесь надо отметить два момента. Первый - еще на стадии организации исследования специалистами биоаналитической лаборатории, где будут анализироваться биопробы, должна быть проведена тщательная проработка литературного материала (по генерическим препаратам она вполне доступна) по возможности использования того или иного аналитического метода с необходимой селективностью и чувствительностью. Например, изучение биоэквивалентности препарата небиволол, таблетки 5 мг. Надо иметь в виду, что в этом случае необходимо анализировать пикограммовые количества (С =1,5 нг/мл, предел количественного определения 10 пг/мл плазмы). На сегодняшний день это ВЭЖХ с тройным квадруполь-ным анализатором [1]. Второй момент — на наш взгляд в протоколе исследования биоэквивалентности необходимо не ограничиваться только одной (валиди-рованной) методикой. Практика показывает, что не всегда можно воспроизвести опубликованные данные, даже имея хорошее оборудование.
БИОМАТЕРИАЛ
В методических рекомендациях РФ 2012 г (Руководство по проведению клинических исследований лекарственных средств. Часть.1. Глава 4. Методические рекомендации по оценке биоэквивалентности лекарственных препаратов): «При проведении исследований биоэквивалентности концентрация лекарственных средств определяется в плазме, сыворотке или цельной крови».
В подавляющем большинстве исследований биоэквивалентности в качестве биожидкости используется плазма крови. Вместе с тем, необходимо по каждому конкретному препарату знать литературу, по крайней мере, посмотреть в Интернете материалы FDA (Food and Drug Administration) [2]. Например, изучение биоэквивалентности препарата такролимус, капсулы 5 мг (Смакс = 7 нг/мл). Надо иметь в виду, что в этом случае
концентрацию препарата надо определять в пробах цельной крови. Соотношение такролимуса цельная кровь/плазма = 15 [3]. Необходимо предусмотреть применение высокочувствительного метода ВЭЖХ/МС/ МС или ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay).
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА
Валидацию используемого метода необходимо проводить до анализа биопроб, полученных от испытуемых и полностью включать в отчет по биоэквивалентности. В отчете указываются используемые реагенты и реактивы, подробная методика пробопод-готовки, описание метода количественного анализа с указанием прибора, системы и условий хроматографирования, системы регистрации (детектирования).
Обязательным является предоставление следующих валидационных характеристик (ниже приведены данные, полученные при изучении биоэквивалентности противорвотного препарата ондансетрона (ОНД), внутренний стандарт — трописетрон (ТР), метод - ВЭЖХ/МС/МС, ионизация — электроспрей).
Селективность. На рисунках 1 и 2 представлены хроматограммы и масс-спектры, показывающие высокую селективность выбранного метода. Видно, что в данных условиях эндогенные соединения не мешают определению анализируемого вещества.
Извлечение и эффект влияния матрицы. Влияние матрицы (ВМ) на эффективность ионизации оценивали на 1 и 6 уровнях концентраций. Сравнивали концентрации раствора вещества, не содержащего компонентов плазмы (раствор А), и супернатанта после осаждения белков с внесенным эквивалентным количеством аналита (раствор Б). Для оценки извлечения (Re) сравнивали количество ОНД, найденное в растворах Б с точками калибровочной кривой. Извлечение определяли для двух уровней концентраций — 1,0 нг/ мл и 30 нг/мл. Из таблицы 1 видно, что влияние матрицы составляет не более 17,4%, извлечение 86,5-116%.
Рис. 1. Хроматограмма и масс-спектр плазмы крови не содержащей ОНД
Рис. 2. Хроматограмма и масс-спектр ОНД с концентрацией в плазме 1 нг/мл
КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
Таблица 1
ИЗВЛЕЧЕНИЕ И ЭФФЕКТ ВЛИЯНИЯ МАТРИЦЫ
Концентрация, нг/мл Средняя концентрация ОНД в растворах А (п=6) Средняя концентрация ОНД в растворах Б (п=6) Средняя концентрация ОНД в точках калибровки (п=6) ВМ % % ^ ,
1,0 1,04 1,22 1,03 117,4 86,5
30,0 29,3 25,3 29,41 84,4 116,0
Линейность, точность, воспроизводимость. Для
построения калибровочной кривой выбраны восемь уровней концентраций. Диапазон калибровочной кривой находится в пределах концентраций 1,0-50,0 нг/мл. В этих пределах методика удовлетворяет критериям линейности, точности, воспроизводимости. Относительное стандартное отклонение (RSD) для выбранных точек калибровочной кривой не превышает 15% [4], точность от 91,4 до 112,4% (таб. 2).
Коэффициент корреляции R для кривой составил 0,994 (рис. 3). Полученные результаты доказывают надежность и воспроизводимость методики.
Предел обнаружения, предел количественного определения. Измеренный предел обнаружения ОНД получили равным 0,1 нг/мл (рис. 4), при этом отношение интенсивности сигнала вещества и шума равно 4:1.
Нижний предел количественного определения ОНД составил 1 нг/мл (рис. 5).
Стабильность образцов в автосамплере. Стабильность образцов в автосамплере — важная характеристика, поскольку современные приборы позволяют сразу загружать до 120 проб и анализировать их в течение определенного промежутка времени. В этом случае ав-тосамплеры должны быть термостатированы.
Время нахождения образца в автосамплере до анализа не более 10 часов. Для проверки стабильности 6 образцов с концентрациями 1 нг/мл и 30 нг/мл анализировали дважды через 22 часа нахождения в авто-
5pg_lim_BE2_01_5330.d: EIC 294.2±0.1 +All MS
Рис. 3. График калибровки. Ось Х — концентрация ОНД. Ось Y— отношение площадей хроматографических пиков ОНД к ТР
Рис.4. Предел обнаружения ОНД
Таблица 2
ТОЧНОСТЬ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ
Концентрация Уровень Среднее значение концентрации, Ы8Б, Точность,
в плазме, нг/мл концентрации нг/мл (п=6, доверит. интервал 90%) % %
1,0 1 1,03+0,07 9,85 102,7
3,0 2 2,90+0,14 7,05 96,8
5,0 3 4,57+0,07 2,29 91,4
10,0 4 9,61+0,38 5,92 96,1
20,0 5 19,56+0,70 5,33 97,8
30,0 6 29,41+1,47 7,44 98,02
40,0 7 44,97+0,74 2,45 112,4
50,0 8 52,30+0,51 1,46 104,6
= Стандартное отклонение (8Б)/средняя найденная концентрация *100%
Рис. 5. Предел количественного определения ОНД в плазме крови
самплере при 10°С. Результаты эксперимента представлены в таблице 3. Измеренное влияние внешних факторов на стабильность концентрации ОНД в образцах не более 4%. Исследовано перекрестное загрязнение во время анализа, при последовательном вводе образца с концентрацией 30 нг/мл и не содержащего вещества. Перенос ОНД отсутствует (рис 6).
Таким образом, данный метод отвечает всем требованиям, предъявляемым к использованию аналитических методик в части селективности, линейности, точности и воспроизводимости при исследовании биоэквивалентности лекарственных препаратов [4].
АБСОЛЮТНАЯ КАЛИБРОВКА ИЛИ ВНУТРЕННИЙ СТАНДАРТ
При изучении биоэквивалентности для количественных расчетов возможно применять как метод абсолютной калибровки (добавление в «чистую» плазму разных калибровочных количеств препарата), так и метод внутреннего стандарта (добавление в плазму разных калибровочных количеств препарата
СТАБИЛЬНОСТЬ ОБРА
Рис. 6. Хроматограмма раствора ОНД 30 нг/мл и хроматограмма пробы без ОНД
и постоянной концентрации внутреннего стандарта). Вместе с тем, для методик, включающих процедуры экстракции (извлечение препарата из плазмы крови с использованием органических растворителей) необходимо применение внутренних стандартов. Такой подход снижает разбросы данных (в том числе влияние человеческого фактора), поскольку при относительно разной степени экстракции соотношение содержания препарат/внутренний стандарт постоянно. В случае использования «упрощенных» методик пробоподготовки (одношаговое осаждение белков, например, ацетонитрилом) применение абсолютной калибровки дает хороший результат с коэффициентом корреляции 0,999.
Выбор конечной точки (схема отбора биопроб). Выбор конечной точки (время отбора последней пробы крови у испытуемого) - прерогатива клиницистов. Однако, при должном участии специалистов биоана-литической лаборатории в формировании протокола клинического испытания биоэквивалентности должно соблюдаться следующее условие: схема отбора
Таблица 3
ОВ В АВТОСАМПЛЕРЕ
Исходные значения Найденные значения, после выдерживания образца в автосамплере
Исходная концентрация, нг/мл Среднее значение, нг/мл Каждой пробы, нг/мл Среднее значение (п=3, доверит. интервал 90%) Я8Б, % Точность,%
1,09 1,01
1,03 1,07 1,09 1,05+0,04 3,86 104,67
1,08 1,04
30,88 29,62
31,49 31,06 30,29 30,0+0,33 1,14 99,99
31,61 30,08
= Стандартное отклонение (8Б)/средняя найденная концентрация *100%
КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
Таблица 4
ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ
Показатель
T C max max AUCt AUC 0 0-œ MRT Cl V , T1/2 ss’ 1/2
ч мкг/мл мкгХч/мл мкгХч/мл ч мл/кг/ч мл/кг ч
Среднее ариф. 1,22 0,162 1,54 2,73 19,49 266,07 5,12 12,71
Таблица 5
ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ
С макс. Т макс. MRT AUC0-12 AUC^ Смакс.
нг/мл час час нг/мл/час нг/мл/час AUC0-12
Среднее ариф. 27,60 2,33 4,83 153,15 160,19 0,181
проб определяется формой кривой «концентрация лекарственного средства — время». Выбор моментов времени отбора проб должен обеспечивать получение нескольких точек для каждого фрагмента фармакокинетической кривой - не менее 3 - для фазы первоначального возрастания концентрации и не менее 5 - для фазы ее снижения. При однократном приеме длительность наблюдения считается достаточной, если для усредненного фармакокинетического профиля величина площади (AUC) под кривой «концентрация - время» в пределах от нуля до момента отбора последней пробы составляет не менее 80% от полной площади (таблица 4 — AUCt/AUCa ¡x х100 = 56,4% - не корректный анализ; таблица 5 - AUC0-12/ AUC0_^x100 = 95,6% - корректный анализ).
АНАЛИЗ РОДИТЕЛЬСКОГО СОЕДИНЕНИЯ ИЛИ МЕТАБОЛИТА
Важный вопрос при исследовании биоэквивалентности лекарственных препаратов, подвергающихся преси-стемной элиминации (метаболизму), что измерять: неизмененное (родительское) соединение или метаболит (метаболиты), или и то и другое (другие)? Требования европейцев и американцев практически одинаковы.
Так, в документах EMEA (European Medicines Agency) и FDA сказано, что «Оценка биоэквивалентности должна быть основана на измерении концентраций исходного соединения. Использование метаболита вместо активного исходного соединения допустимо лишь в том случае, если заявитель предоставит убедительные доводы, что достоверно измерить исходное соединение после однократного или курсового при-
ЛИТЕРАТУРА_____________________________________________
1. Ramakrishna N.V.S., Vishwottam K.N, Koteshwara et all. Rapid quantification of nebivolol in human plasma by liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, № 39 (2005), p. 1006-1013.
2. http://www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation.
ема не представляется возможным». Обоснованием этой рекомендации является то, что фармакокинетический профиль «концентрация — время» исходного соединения более чувствителен к фармацевтическим изменениям, чем образующийся метаболит. Вместе с тем, если метаболит вносит существенный вклад в эффективность и безопасность применения данного препарата, нужно представлять данные, как по самому исходному соединению, так и по метаболиту.
В методических рекомендациях РФ 2012 г (Руководство по проведению клинических исследований лекарственных средств. Часть.I. Глава 4. Методические рекомендации по оценке биоэквивалентности лекарственных препаратов): «В тех случаях, когда действие лекарственного средства реализуется в результате образования его активного метаболита, оценка биоэквивалентности препаратов должна быть основана на измерении концентрации такого метаболита, а не неизмененного лекарственного средства (пролекарство). В тех случаях, когда неизмененное лекарственное средство обладает собственной биологической активностью, использование данных о концентрации метаболита (ов) вместо данных о концентрации неизмененного лекарственного средства допустимо лишь при обосновании целесообразности подобной замены».
Таким образом, в клиническом изучении биоэквивалентности воспроизведенных (генерических) лекарственных препаратов биоаналитическая часть является важнейшим экспериментальным разделом, от качества проведения которого зависит достоверность главного вывода всего исследования: взаимозаменяемы сравниваемые препараты или нет.
3. Bekersky I., Dressier D., Colburn W., Mekki Q. Bioequivalence of 1 and 5 mg tacrolimus capsules using a replicate study design. // J. Clin. Pharmacol., 1999, № 39 (2005), p. 1032.
4. Guideline on bioanalytical method validation // European medicines agency, 2011.
