CC BY
254
Исследование биоэквивалентности препаратов ондансетрона с использованием
метода ВЭЖХ-МС
Степанова Е.С.1, Овчаров М.В.1, Барсегян С.С.1, Чистяков В.В.1, Никонова С.М.2, Шилов В.В.2
1 — ФГАОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», Центр коллективного
пользования, г. Москва
2 — ФБУН СЗНЦ «Гигиены и общественного здоровья», г. Санкт-Петербург
Резюме. В рамках перекрёстного, открытого, рандомизированного исследования с недельным периодом отмывки, с двумя последовательностями была изучена биоэквивалентность двух таблетированных форм ондансетрона на 18 добровольцах (дозировка 8 мг). Образцы плазмы крови анализировали валидированным методом ВЭЖХ-МС, с внутренним стандартом — трописетроном. Предел количественного определения составил 1 нг/мл.
Для анализируемых препаратов рассчитаны фармакокинетические параметры: AUC0-t, Cmax, Tmax, MRT, Cmax/AUC. 90% доверительный интервал для логарифмически преобразованных значений AUC0-t составил 0,9507 — 1,0037, для AUC(0-m) 0,9402-0,9974 и для Cmax — 0,9255 — 1,0095. По результатам исследования сделан вывод о биоэквивалентности сравниваемых препаратов ондансетрона.
Ключевые слова: ондансетрон, трописетрон, ВЭЖХ/МС, валидация, фармакокинетика, биоэквивалентность
Bioequivalence study of ondansetron tablets by HPLC-MS
Stepanova E.S.1, Ovcharov M.V.1, Barsegyan S.S.1, Nikonova S.M.2, Shilov V.V.2, Chistyakov V.V.1 1 — Peoples' Friendship university of Russia, Shared Research and Education Center, Moscow 2 — Science Center «Hygiene and Public Health», St-Petersburg Abstract. Within the cross, a single, open, randomized study with a week washout period, the two sequences has been studied bioequivalence of tablet forms two ondansetron 18 volunteers (8 mg dosage). Plasma samples were analyzed by a validated HPLC-MS, tropisetron was used as the internal standard. Limit of quantification was 1 ng/ml.
Analyzed for drugs following pharmacokinetic parameters were calculated: AUC , C , T , MRT, C /AUC.
7 1 0-t max max max
90% confidence interval for log-transformed values of AUC was 0,9507 — 1,0037, of AUCm . was 0,9402-0,9974, of C was
0-t ' ' ' (0-») ' ' max
0,9255 — 1,0095. The study concluded that bioequivalence compared ondansetron drugs.
Keywords: ondansetron, tropisetron, HPLC/MS, validation, pharmacokinetics, bioequivalence
Автор, ответственный за переписку:
Степанова Елена Сергеевна — ФГАОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», Центр коллективного пользования, г. Москва; адрес: Россия, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8/2; e-mail: [email protected]; тел.: +7 (985) 442-17-49
Введение
Значительные успехи химиотерапии в последние годы основываются на развитии поддерживающей и сопроводительной терапии, что позволило сделать лечение пациентов с онкологическими заболеваниями более эффективным. Практически весь спектр цито-статических препаратов имеет ряд выраженных побочных эффектов. Тошнота и рвота относятся к наиболее частым осложнениям при проведении химиотерапии. Ещё совсем недавно около 10% больных отказывались от химиотерапии или прерывали её преждевременно из-за развития непереносимой тошноты и рвоты [1].
Ключевую роль в развитии острой тошноты и рвоты играет нейромедиатор — серотонин (5—НТ), высвобождение которого происходит при воздействии лучевой терапии или введении цитостатических препаратов из энтерохромаффинных клеток слизистой тонкой кишки.
Разработка и внедрение в широкую практику в начале 1990 г. антагонистов рецепторов 5—НТ3 позволили кардинально уменьшить тошноту и рвоту при проведении химиотерапии. За счёт селективного действия, эти препараты практически полностью купируют тошноту и рвоту, имея при этом минимальные побочные эффекты [2].
Антагонисты 5-HT3 рецепторов стали препаратами выбора среди противорвотных средств [3]. Внутри класса антагонистов 5-^Г3 рецепторов существенных различий между препаратами в отношении их эффективности не выявлено [4].
Выбор препарата лечения основывается на индивидуальных особенностях пациентов.
Ондансетрон — один из представителей группы антагонистов 5-^Г3 рецепторов успешно применяется в клинической практике для купирования тошноты и рвоты развивающейся на фоне химиотерапии, лучевой терапии, а также тошноты и рвоты возникающей в послеоперационный период.
Цель исследования
Целью настоящего исследования является изучение биоэквивалентности препаратов Ондавелл, таблетки, покрытые плёночной оболочкой, 8 мг («ПТ. Новелл Фармасьютикал Лабораториз», Индонезия) и Эметрон®, таблетки, покрытые оболочкой 8 мг («Гедеон Рихтер А.О.», Венгрия).
Материалы и методы
Эппендорфа «Экохим» (РФ); калиброванные мерные колбы вместимостью 50; 100; 250; 1000 мл (ГОСТ 1770-74), мерные цилиндры объёмом 50, 250, 1000 мл (ГОСТ 1770-74).
Реактивы и растворы
Субстанция ондансетрона гидрохлорида 92,16% (Sun Pharma), субстанция трописетрона гидрохлорида, ацетонитрил 99,9% (LabScan), ацетат аммония 99% (Fluka), кислота муравьиная 50% (Fluka), аргон 99,95%, азот (Dominick Hunter) 99 %, вода Milli-Q.
Пробоподготовка
В пробирку Эппендорфа 1,5 мл отбирали 200 мкл плазмы, белки осаждали 400 мкл ацетонитрила, содержащего 10 нг/мл трописетрона (ТР) — внутренний стандарт. Раствор перемешивали 5 с на вихревой мешалке. Образец центрифугировали 3 мин при 14000 об/мин. 400 мкл супернатанта отбирали в 1,5 мл флаконы, прибавляли 400 мкл воды и помещали в термостат авто-самплера при 10°С для последующего хроматографиче-ского анализа.
a)
Субстанции
Ондансетрон (ОНД) N Брутто формула: C18H19N3O Молекулярная масса: 293,15
b)
Трописетрон (TP) Брутто формула: C17H20N2O2 Молекулярная масса: 284,15
Оборудование
Высокоэффективный жидкостной хроматограф «Dionex ultimate 3000» (ФРГ), с масс-детектором Bruker micrOTOF-Q II (ФРГ). Весы аналитические «MX5» «Mettler Toledo» (Швейцария).
Дозаторы переменного объёма на 50,0, 200,0 Колор «Ленпипет» (РФ) 1000,0; и 5000,0 мкл «Biohit» (Финляндия) со сменными одноразовыми пластиковыми наконечниками «Экохим» (РФ); аппарат для встряхивания жидкости «Genius 3», «Vortex» (США); центрифуга Centrifuge 5424, Eppendorf (ФРГ); пробирки
Методика количественного определения
Для количественного определения ондансетрона в плазме крови добровольцев при исследовании биоэквивалентности использован валидированный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ/ МС) [5].
Хроматографические условия:
• колонка XDB-С18 5 мкм 4,6x150 мм
• элюент — раствор 0,05% муравьиной кислоты и ацетонитрил в соотношении 25:75
• поток подвижной фазы — 0,6 мл/мин
• объём вводимой пробы — 50 мкл
Условия масс-детектирования:
Масс-детектор напряжение на игле -5500 В, температура источника 220^, расход осушающего газа 6 л/мин, давление распыляющего газа 1,5 бар. Ионизация электрораспылением, регистрация положительных ионов, целевой ион ОНД 294,15±0,1 и ТР 285,15±0,1. Время удерживания ТР в этих условиях 4,21 мин, ОНД — 4,84 мин. Скорость записи спектров 1 Гц. Общее время анализа 5,5 мин.
Через каждые 50 анализов производилась промывка хроматографической системы в течении 40 мин при потоке 1 мл/мин, градиент: [% ацетонитрила] 25—>0—>0—^100—^100—>25—^25, время [мин] 0—>1—>5—>20—>25—>27—>40.
22
1Фшаишш И Фармащшмш
HC
CH
CH
Дизайн клинического этапа исследования
Таблица 1
Дизайн клинического этапа исследования
Участники исследования 18 добровольцев в возрасте от 18 до 45 лет, отобранных согласно критериям включения и невключения (на случай замены выбывших из исследования добровольцев предусмотрено 2 дублера)
Доза 8 мг однократно
Прием препарата Доброволец натощак принимает 1 таблетку одного из препаратов, запивая 240 мл кипячёной воды комнатной температуры
Период вымывания между этапами исследования 7 дней
Сбор образцов крови для анализа Всего у 18 добровольцев отобрано 504 образца крови в течение двух этапов исследования. Время отбора образцов: до и через 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 ч после приёма препарата
Расчёт фармакокинетических параметров
Для обсуждения биологической доступности лекарственных средств рассчитывали концентрации ондан-сетрона в плазме крови и определяли фармакокинети-ческие параметры:
• максимальная концентрация (C ) — максимальное значение из измеренных;
• время достижения максимальных концентраций (Т ) — время, при котором измерялась C ;
v max7 f ' f f f max'
• площадь под фармакокинетической кривой — в пределах длительности наблюдений (AUC0-t) рассчитывают методом трапеций;
• площадь под кривой в интервале времени от 0 до ® (AUCo-„)
• среднее время удержания препарата в организме (MRT);
• значение Cmax/AUC0-t, отражающее скорость всасывания.
Фармакокинетические параметры рассчитывали на компьютере Pentium 4 с использованием программ «Bioeqv», статистическая обработка данных проведена с использованием «Excel», графика — «SigmaPlot».
Результаты
Калибровочная кривая
Диапазон концентраций для калибровочной кривой выбрали в пределах от 1,0 до 50,0 нг/мл (рис. 1). Коэффициент корреляции R для кривой составил 0,9944. Калибровочная кривая описывалась уравнением y=0,070332*x-0,014394, где х — концентрация ОНД, у — отношение площадей хро-матографических пиков ОНД к ТР.
Валидация методики
Методика количественного определения ОНД была валидирована по нескольким параметрам, представленным в табл. 2, для доказательства её пригодности для исследований биоэквивалентности [6].
Основные фармакокинетические параметры и статистическая обработка данных
Усреднённые графики изменения концентрации ОНД в плазме крови добровольцев после приёма тестируемого и референтного препаратов представлены на рис. 6 (ср. значения ±90% дов.инт., n=18). Видно, что профили концентраций ондансетрона после применения таблеток Ондавелл «ПТ Новелл Фармасью-тикал Лабораториз» (Индонезия) повторяют профили концентраций ондансетрона при использовании таблеток референс-препарата Эметрон® «Гедеон Рихтер А.О.» (Венгрия).
Рассчитанные основные фармакокинетические параметры представлены в табл. 3. Максимальные
Rel. Resp.
Curve Coefficients y = 0.070332 x + -0.014394 R = 0.994373
0J
0 10 20 30 40 50 Rel.Conc.
Рис. 1. График калибровки. Ось Х (Ре!.Сопс.) — концентрация ОНД. Ось У ^^р.) — отношение площадей хроматографических пиков ОНД к ТР
4
3
2
тип мгг< jdi ПШРЛЙmm
Таблица 2
Характеристика валидационных параметров методики
№ п/п Валидационный параметр Результаты анализа
1 Селективность Анализ нескольких образцов интактной плазмы крови и плазмы содержащей аналит доказал высокую селективность выбранной методики (рис. 2-5). В данных условиях эндогенные соединения не мешают определению анализируемого вещества и внутреннего стандарта.
2 Предел обнаружения 0,1 нг/мл, отношение интенсивности сигнала вещества и шума (S/N) равно 4:1.
3 Предел количественного определения Нижний предел количественного определения ОНД равный нижней точке калибровочной кривой составил 1 нг/мл (рис. 3).
4 Линейность, точность, воспроизводимость График калибровки описывается линейным уравнением y=0,070332 xx-0,014394, где х—концентрация ОНД, у — отношение площадей хроматографических пиков ОНД к ТР. Относительное стандартное отклонение (RSD) для всех точек калибровочной кривой не превышает 15%, точность относительно теоретических концентраций от 91,4 до 112,4%.
5 Извлечение Около 100%.
6 Эффект влияния матрицы Не более 17,5%.
7 Стабильность в автосамплере Исследована путём сравнения площадей хроматографических пиков полученных при первичном анализе пробы и повторном анализе после выдерживания образца в термостатируемом автосамплере при 10°С в течение 10 часов. Влияние внешних факторов на стабильность образца составило не более 4%.
8 Эффект переноса Исследован при последовательном анализе образца с концентрацией ОНД 30 нг/мл и образца, не содержащего аналит. Перенос ОНД отсутствует.
|-Blank5_BE7_01_4607.d: ЕС294,2±0,1 +AII MS~
5 Time [rrtn]
еяал 295.2
298.2
XI
Jj
+MS, 4.9-5.lnin #{293-302} 309.1
311.2 I 312.2
jj 308.1 1 ■ А Г. А
Рис. 2. Типичная хроматограмма и масс-спектр плазмы крови, не содержащей ОНД
Рис. 3. Хроматограмма и масс-спектр плазмы крови с концентрацией ОНД 1 нг/мл
Рис. 4. Хроматограмма и масс-спектр плазмы крови, содержащей внутренний стандарт ТР
+MS, 4.8-4.8mln #(288-289)
2В23 285,2 295,2 309.1 1 296.2 299.2 302.2 1 -eLd .rtip.rA, я, Л.А ri р .rf, р. , „ ,Д м
Рис. 5. Типичная хроматограмма и масс-спектр плазмы крови добровольца содержащая ОНД и внутренний стандарт ТР
24 -
20 -
и- 16 -
- Ондавелл Эметрон
г 2
12 -
8 -
4 -
Время, час
Рис. 6. Усреднённые кинетические кривые ОНД в плазме крови добровольцев после однократного приёма таблеток Ондавел (Т) и Эметрон (Ю (п=18; х ± С.1. 90%)
Таблица 3
Основные фармакокинетические параметры тестируемого и референтного препаратов
x SD Sx C.I. 90% W, %
С max нг/мл T 25,42 9,86 4,02 3,82 38,79
R 27,60 10,65 4,35 4,13 38,59
Т max ч T 2,14 0,74 0,30 0,29 34,77
R 2,33 0,99 0,40 0,38 42,22
MRT ч T 4,62 0,45 0,18 0,17 9,74
R 4,83 0,54 0,22 0,21 11,13
лис0-12 нг/млхч T 138,93 51,52 21,03 19,97 37,08
R 153,15 56,63 23,11 21,95 36,98
AUC0 нг/млхч T 140,40 52,76 21,53 20,45 37,58
R 160,19 57,69 23,55 22,37 36,01
С / max AUC0-12 T 0,183 0,025 0,010 0,010 13,71
R 0,181 0,027 0,011 0,010 14,76
Примечания: x — среднее арифметическое; SD — стандартное отклонение; Sx — стандартная ошибка; C.1.90% — 90% доверительный интервал; CV—коэффициент вариации.
Таблица 4
Результаты дисперсионного анализа фармакокинетических параметров !пАиС0(, 1пСтах определяющих биодоступность ондансетронаах из таблеток
!пАУС„„
Источник вариации SS DF MS F
Препарат 0,106 1 0,106 1,86496
Последовательность 0,083 1 0,083 1,45607
Испытуемые 4,012 17 0,236 4,14688
Остаточная вариация 0,911 16 0,57 -
Общая вариация 5,112 35 - -
InC
Источник вариации SS DF MS F
Препарат 0,082 1 0,082 1,47759
Последовательность 0,076 1 0,076 1,37413
Испытуемые 4,814 17 0,283 5,11766
Остаточная вариация 0,885 16 0,055 -
Общая вариация 5,857 35 - -
Примечания: SS — сумма квадратов отклонений; DF — число степеней свободы; MS—средняя квадратичная ошибка; F—рассчитанное значение F-критерия Фишера (при уровне значимости а=5%).
концентрации регистрируются спустя, в среднем, 2,14-2,33 ч после приёма препаратов и составляют для тестируемого препарата (х±C.I. 90%) 25,42+3,82 нг/ мл, для препарата сравнения — 27,60+4,13 нг/мл. Параметр среднего времени удерживания (MRT) составил, соответственно, 4,62+0,17 и 4,83+0,21 ч. Нет достоверных различий и в параметре AUC, отражающем степень всасывания. Для тестируемых таблеток AUC0-12
(АиС0ю) - 138,93+19,97 (140,40+20,45), для препарата сравнения - 153,15+21,95 (160,19+22,37) нг/млхч. Отношения максимальных концентраций к площадям под фармакокинетическими кривыми С /АиС0-12, отражающие скорость всасывания, для сравниваемых лекарственных препаратов, практически одинаковы и составили 0,183+0,010 (тест препарат) и 0,181+0,010 (препарат сравнения).
tfiinliu Ж4 J □ fl np\J UII CO JU I>JJ □
Таблица 5
Значения фармакокинетических параметров после логарифмической трансформации данных
Параметр Ондавелл Эметрон® Отношение T/R,% Границы 90% CI, %
нг/млхч GMean 4,845 4,958
SD 0,407 0,358 97,72 95,07-100,37
CV,% 8,383 7,206
AUC^ нг/млхч GMean 4,853 5,009
SD 0,414 0,341 96,88 94,02-99,74
CV, % 8,495 6,795
С max нг/мл GMean 3,122 3,227
SD 0,438 0,384 96,75 92,55-100,95
CV,% 13,88 11,84
Примечание: GMean — среднее геометрическое
Для установления статистически значимых различий между препаратами проводили дисперсионный анализ значений С , ЛиС0-( после их логарифмического преобразования (табл. 4).
Для установления статистически значимых различий между средними значениями показателя биоэквивалентности сравниваемых препаратов значение F для строки «препарат» (различия между препаратами) должно превзойти соответствующее табличное значение (таблица критерия Фишера для числа степеней свободы (1; п-2) и выбранного уровня значимости а).
Критическим значением для оценки вклада факторов типа препарата является значение Б0 = 4,49. Как можно видеть, Б-отношение для вклада фактора типа препарата нигде не превосходит этого критического значения.
Оценка биоэквивалентности изучаемых препаратов проводилась по показателям: ЛиС, ЛиС0-ю, С . В табл. 5 приведены границы 90% доверительного интервала для логарифмически преобразованных рас-
считанных фармакокинетических параметров: AUC 95,07%-100,37%; для AUC(0 и) 94,02%-99,74%, для С 92,55%-100,95%.
(0-t)
Выводы
Значения всех определяемых параметров статистически достоверно не различались. Дисперсионный анализ значений lnAUC0-12, lnC , проведённый после их логарифмического преобразования, не выявил статистически значимых различий между препаратами. Границы оценённого 90% доверительного интервала для индивидуальных отношений логарифмически преобразованных значений (табл. 4) находятся в допустимых пределах: 80-125% для AUC0-12 и AUC0-m и 75-133% для C [7].
max L J
Таким образом, препарат Ондавелл, таблетки, покрытые пленочной оболочкой, 8 мг («ПТ. Новелл Фармасьютикал Лабораториз», Индонезия) и препарат Эметрон®, таблетки, покрытые оболочкой, 8 мг («Гедеон Рихтер А.О.», Венгрия) биоэквивалентны.
max
Литература
1. Kris M.G., Hesketh P.J., Herrstedt J., Rittenberg C., Einhorn L.H., Grunberg S. et al. Consensus proposals for the prevention of acute and delayed vomiting and nausea following high — emetic — risk chemotherapy. // Support Care Cancer 2005, Vol. 13:85—96.
2. Oge A., Alkis N., Oge O., Kartum A. Comparison of granisetron, ondansetron and tropisetron for control of vomiting and nausea induced by cisplatin. // J Chemother 2000, Vol. 12(1):105-108.
3. Steven M. Grunberg, and Paul J. Hesketh. Control of Chemotherapy—Induced Emesis. // The New England journal of medicine, 1993, Vol. 329:1790—1796.
4. Stiakaki E., Savvas S., Lydaki E., Bolonaki I., Kouvidi E., Dimitriou H., et al. Ondansetron and tropisetron in the control of nausea and vomiting in children receiving combined cancer chemotherapy. // Pediatr Hematol Oncol. 1999, Vol. 16(2):101-108.
5. Yara Popst Armando, Simone Grigoleto Schramm, Marina de Freitas Silva, Eunice Kazue Kano. Bioequivalence assay between orally disintegrating and conventional tablet formulations in healthy volunteers. // International Journal of Pharmaceutics, 2009, Vol. 366, 149—153.
6. Guideline on bioanalytical method validation. // European Medicines Agency, 2011.
7. Методические рекомендации «Изучение биоэквивалентности воспроизведенных лекарственных средств, гл. 7 в «Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том I. — М.: Гриф и К, 2013.
26
Фшшкишш И фармащшмш
