Некоторые морфоиммунологические показатели в саркомах мягких тканей Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

XXI РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ТЕЗИСЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

Цель. Исследование профилей экспрессии генов сигнального каскада EGFR, а также микроРНК, мишенями которых могут быть гены этого сигнального пути, в клетках линии HeLa, культивируемых при различных концентрациях DXR. Материалы и методы. В работе использовали культуру клеток карциномы шейки матки человека линии HeLa CCL-2. Культивирование проводили в среде RPMI-1640 (Биолот, Россия) c добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Thermo Scientific Hyclone, США) в присутствии гентамицина (50 мкг/мл; Биолот, Россия) в условиях 5% CO2 (инкубатор CB 150 Binder, Германия). Питательную среду заменяли при достижении 70% уровня покрытия культуральной поверхности клетками во всех флаконах. В экспериментальных флаконах среду заменяли на RPMI-1640, содержащую 2 или 4 мкг/мл доксорубицина. Экспозиция составила 1; 5 и 24 часа. Экстракцию суммарной РНК проводили с использованием реагента Trizol (Thermo Fisher Scientific, США). Препараты суммарной РНК использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК с помощью набора «Реверта L» (Синтол, Россия) и получения библиотеки кДНК микроРНК после полиаденилирования в присутствии poly (A) поли-меразы E. coli (New England Biolabs, Великобритания). Экспрессию 11-ти генов (EGFR, GRB2, SOS1, KRAS, BRAF, MEK1, STAT1, PIK3CA, Akt, mTOR) и транскрипционный уровень 7-ми микроРНК (Let71, miR92a, miR143, miR126, miR266, miR513a, miR7110) определяли методом RT-PCR на ампли-фикаторе DTprime («ДНК-технологии», Россия) в 25 мкл ПЦР-смеси с красителем EvaGreen DYE (Biotium). Референс-ными локусами служили GADPH для анализа экспрессии генов, RNU6 — для микроРНК. Различия между группами оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с post hoc попарными сравнениями средних значений. Все статистические анализы проводили в пакете IBM SPSS Statistics v. 23.0.

Результаты. При часовой экспозиции клеток HeLa с доксо-рубицином (2 мкг/мл) отмечалась тенденция к снижению уровня экспрессии генов EGFR и mTOR (более чем на 30%), увеличение экспрессии гена BRAF в 1,5 раза по сравнению с уровнем контроля. При концентрации DXR в среде 4 мкг/мл фиксировали снижение уровня экспрессии генов STAT1 и PI3KCA на 50%, гена MEK1 на 88% и увеличение экспрессии гена BRAF в 3 раза. Одновременно отмечено статистически значимое (для p<0,05) увеличение экспрессии всех микроРНК во всех вариантах. Следует отметить, что DXR в концентрации 2 мкг/мл оказывал большее влияние на экспрессию микроРНК.

Культивирование в течение 5-ти часов клеток HeLa с док-сорубицином (2 мкг/мл) понижало транскрипционную активность гена EGFR на 56%. В отличие от 1-часовой экспозиции уровень мРНК гена BRAF падал на 34% по сравнению с контролем. Экспрессия Akt, mTOR снижалась на 34% и 43%, соответственно. Экспрессия гена MEK1 увеличивалась в 8,5 раз. При концентрации доксорубицина 4 мкг/мл фиксировали снижение уровня экспрессии следующих генов: EGFR — на 56%, BRAF — на 59%, STAT1 — на 77%, PI3KCA — на 46% и Akt — на 34%. Увеличение экспрессии гена MEK1 было более выражено и в 18,3 раз превышало значение контроля. Характер экспрессии микроРНК также изменялся по сравнению с часовой инкубацией: экспрессия miR-92a-1-5p в клетках HeLa уменьшалась в 1,2 и 8,28 раз при концентрации DXR 2 мкг/мл и 4 мкг/мл, соответственно; наоборот, увеличивался уровень экспрессии miR-7110-5p — в 2,22 и 8,28 раз; miR-143-3p — в 17,5 и 208 раз; miR-126 — в 1,3 и 1,7 раз; miR-513a-5p — в 2

и 6,3 раза; miR-26b-3p — в 3,14 и 12,5 раз, соответственно. Уровень транскрипционной активности hsa-let-7a изменялся незначительно. При 5-часовой экспозиции доксо-рубицин влиял на относительную экспрессию микроРНК эффективнее в концентрации 4 мкг/мл. Режим культивирования клеток HeLa в течение 24-х часов при концентрации DXR 2 мкг/мл в целом понижал уровень экспрессии генов: от 38% для MEK1 до 94% для PI3KCA. При концентрации DXR 4 мкг/мл в отличие от эффекта дозы 2 мкг/мл наблюдали увеличение экспрессии гена MEK1 в 2,5 раза относительно контроля. Относительная экспрессия микроРНК в клетках HeLa в указанной экспозиции увеличивалась в тысячи раз (кроме miR-143, miR-126 и let-7a), что, возможно, обусловлено запредельно стрессовым или апопто-тическим состоянием клеток.

Согласно результатам двухфакторного ANOVA, оба фактора и их сочетание (экспозиция и концентрация DXR) достоверно изменяют экспрессию всех проанализированных микроРНК. В отношении генной экспрессии значимый совокупный эффект времени культивирования и дозы доксорубицина был выявлен только для гена MEK1 (р=0,0001). В условиях эксперимента наблюдали обратную достоверную корреляцию между уровнем экспрессии miR-143 и генов EGFR, BRAF и Akt; уровнем экспрессии miR-126 и гена SOS1 (p<0,05).

Заключение. DXR в различных дозах (2 и 4 мкг/мл) повышает транскрипционную активность гена MEK1 после 1, 5, 24-х часов культивирования клеток HeLa и достоверно изменяет динамику экспрессии исследованных микроРНК. Данные эксперимента указывают на большую чувствительность, как с точки зрения латентного периода, так и амплитуды ответа изменения экспрессии исследованных микроРНК по сравнению с экспрессией генов сигнального пути EGFR.

Некоторые морфоиммунологические показатели в саркомах мягких тканей

Е.М. Непомнящая', И. А. Новикова', Л. Н. Ващенко', Т.А. Алиев', Е. П. Ульянова', Г. И. Закора'

Место работы: 'ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ, Ростов-на-Дону, Россия

e-mail: [email protected]

Цель. Изучить некоторые морфоиммунологические особенности сарком мягких тканей: первичных и рецидивных. Материалы и методы. Материалом исследования послужили истории больных первичными и рецидивными саркомами, операционный материал удаленных опухолей. Группу первичных сарком составили 30 наблюдений, рецидивных — 29. Фрагменты удаленных опухолей вырезали, фиксировали в 10% забуференном формалине, проводили по стандартной методике и заливали в парафин. В дальнейшем окрашивали гематоксилином и эозином. Просмотр гистологических препаратов осуществляли на светооптическом уровне. Имму-ногистохимическое исследование проводили на срезах с парафиновых блоков. Окрашивание проводили на авто-стейнере Thermo Scientific. Для визуализации иммуногисто-химической реакции использовали систему детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB Detection System. Определяли следующие маркеры: пролиферативную активность (ki 67), факторы апоптоза и проапоптоза (bcl2, bax), ангиогенеза (CD34). Статистический анализ результатов исследования проводился с помощью программы STATISTICA 7.0 (StatSoftInc., США).

Злокачественные опухоли

www.malignanttumours.org

Том / Vol. 7 № 3 S 1 /2017

Malignant Tumours

www.malignanttumours.org

XXI РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ТЕЗИСЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

Результаты. Одной из важных характеристик опухоли является пролиферативная активность. Определяли про-лиферативную активность в группе первичных и рецидивных СМТ. В группе первичных сарком показатель Ю67составили 30,7±9,2%, а в группе рецидивов 35,5±8,72%, t> 2. (Р>0,05). Пролиферативная активность в группе рецидивных сарком была выше по сравнению с первичными, однако показатель %2 оказался недостоверным. Экспрессия Ki67, в ядрах опухолевых клеток, колебалась от 5% до 45% в каждом конкретном случае. Тоже относилось и к рецидивным опухолям мягких тканей. В развитии рецидивов и метастазов имеют значение факторы ангиогенеза. CD34 и VEGF (фактор роста эндотелия сосудов). Показатели были следующими: в группе первичных сарком мягких тканей CD34 составил 12,2±0,94 а в рецидивных 9,18±1,6 (p<0,05). VEGF в первичных СМТ составил 10,6±1,88, а в рецидивных 8,12±1,6 (p>0,05). Вероятно, некоторое снижение факторов ангиогенеза в рецидивных опухолях можно объяснить проводимой адъювантной химиотерапией, способствующей подавлению роста опухоли. Учитывая, что особое значение в механизмах опухолевого роста имеют факторы апоптоза, и в частности в СМТ, были изучены маркеры Bax и Bcl2. При этом, в группе первичных опухолей показатели были следующими: bax 7,67± 2,3; bcl24,42±1,46. Экспрессия bax отсутствовала в трех наблюдениях, bcl2 — в двух. Соотношение bax/bcl2 составило 1,68±0,54. В литературе имеются противоречивые сведения, касающиеся соотношения bax/bcl2 в развитии метастазов. В некоторых работах отмечена его позитивная роль, например при меланоме увеального тракта, раковых опухолях яичников. Однако до конца эти механизмы не раскрыты. В группе рецидивных опухолей: bax1,68±0,54; bcl24,28±0,67). В данной группе экспрессия bax отсутствовала в 4х наблюдениях, bcl2-7. Соотношение bax/bcl2 составило 0,60±0,15. При проведении статистической обработки отмечена тенденция к изменению показателей. В группе первичных СМТ Bax по сравнению с рецидивными, был статистически выше (7,67±2,3 и 1,68±0,54) соответственно (p<0,05). Данные статистически достоверны. Показатели bcl2 как в группе первичных, так и в рецидивных были примерно одинаковы (4,42±1,46 и 4,28±0,67 соответственно). Заключение. Таким образом, проведенное ИГХ исследование некоторых показателей пролиферативной активности, апоп-тоза и проапоптоза, факторов ангиогенеза выявило ряд особенностей в первичных и редидивных СМТ.

Воздействие различных комбинаций цитокиновых препаратов на рост и метастазирование меланомы B-16 в эксперименте на мышах линии C57Bl/6

Е.Ю. Златник', Е.И. Золотарева', Е.М. Непомнящая1, О.Г. Шульгина', И.А. Новикова', А. О. Гранкина' Место работы: 'ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону, Россия e-mail: [email protected]

В настоящее время известно, что метастазирование является одной из основных причин смертности онкологических больных. Иммунодепрессия, вызываемая противоопухолевыми средствами, способствует продолженному опухолевому росту из химиорезистентных клеток. В последнее время активно ведется изучение противоопухолевых агентов естественного происхождения. Вместе с тем разработаны

и применяются отечественные рекомбинантные препараты, характеризующиеся двойным действием на опухолевые клетки: непосредственным, ведущим в реализации которого является угнетение пролиферативной активности опухолевых клеток и индукция их апоптоза, и опосредованным через активацию различных звеньев иммунной системы, прежде всего, цитотоксических (CTL- и NK-клеточного), благодаря чему они нашли применение в клинике, в т. ч., при лечении меланомы (Абрамов М. Е., 2006, 2009; Proper D. J., 2003), рака яичника (Windbichler G. H., 2000) и других опухолей (Артамонова Е. В., 2014; Vladimirova L. Y., 2013). Цель. Разработка и экспериментальное обоснование новых методов иммунотерапии меланомы с применением различных комбинаций цитокиновых препаратов. Материалы и методы. Эксперимент проведен на 30 мышах-самках линии С57Bl/6 с перевиваемой меланомой В16, которую трансплантировали подкожно в правую надлопаточную область в количествах 5х106 живых опухолевых клеток, разведенных в 0,5 мл физиологического раствора. Вводились различные комбинации иммуномодуляторов на основе рекомбинантных цитокинов: IL-2 (Ронколейкин), IFN-y (Инга-рон), TNF-a с тимозином (Рефнот) по схемам: 1 группа — 4 дня «Ронколейкин», затем 4 дня «Доксорубицин»;2-я «Ронколейкин» и «Ингарон» через день; 3-я «Ронколейкин» и «Рефнот» через день; 4-я чередование «Ронколейкин», «Ингарон» и «Рефнот»; 5-я «Доксорубицин»; 6-я контроль (физиологический раствор).

Воздействие начинали на 10 день после перевивки (по достижении опухолью замеряемого размера) и продолжали в течение 8 дней. Изучали динамику опухолевого роста, наличие макро- и микрометастазов меланомы в легкие и селезенку, морфологию меланомы, селезенки и тимуса, состав субпопуляций лимфоцитов в крови и в селезенке методом проточной цитофлюориметрии.

Результаты. В процессе сравнительного анализа эффективности различных сочетаний цитокиновых препаратов было выявлено торможение роста опухоли под действием комбинации Ронколейкин+Ингарон, которая как в процессе введения, так и после его окончания, тормозит рост опухоли на 30-38%. Эффект торможения наблюдался и при комбинациях Ронколейкин+Доксорубицин, Ронколейкин+Рефнот, а также Доксорубицин, но только до тех пор, пока продолжалось воздействие препарата, а по окончании воздействия опухолевый рост возобновлялся. При применении комбинации Ронколейкин+Ингарон наблюдался выраженный (100%) антиметастатический эффект, т. е., полное отсутствие метастазов у животных, тогда как в контрольной группе они выявлены у 60%. Количество метастатических очагов было минимальным в группе, получавшей Ронколейкин+Инга-рон+Рефнот, а также в группе, получавшей Ронколейкин+-Доксорубицин. Процент животных с метастазами в этих двух группах одинаков (25%), однако количество метастатических очагов в группе Ронколейкин+Доксорубицин было значительно больше и сравнимо с их количеством в контроле, тогда как в группе с введением Доксорубицина количество метастатических очагов было меньше, чем в контроле. Морфологическое изучение опухоли показало обширные очаги некроза (до 2/3 площади опухоли), лейкоцитарную инфильтрацию, кровоизлияния, тромбы в просвете сосудов и дистрофические изменения опухолевых клеток, отмеченные при действии всех исследованных комбинаций иммуномоду-ляторов. У животных контрольной группы меланома имела типичное строение. Выявленные метастазы были как мелкими, так и крупными, иногда множественными с обширным

Злокачественные опухоли

www.malignanttumours.org

Том / Vol. 7 № 3 S 1 /2017

Malignant Tumours

www.malignanttumours.org