CC BY
16Некоторые аспекты совершенствования технологии промышленного получения вакцины гепатита А
М.А. Мунтянова, Ю.В. Немцов, Н.И. Крюк, В.В. Яшин, А.Г. Куслий, Л.Г. Никулин Закрытое акционерное общество «Вектор-БиАльгам», Кольцово, НСО, Россия
Краткий обзор в настоящее время отечественная вакцина АЛЬГАВАК®М изготавливается на основе штамма «HAS — 15/4647» (ЛВА-86) вируса гепатита А. Накопление вирусной массы занимает около 3-х недель с периодической сменой культуральной среды, что трудоемко и финансово затратно. Концентрация вирусного антигена после стадии культивирования редко превышает 1280 ИФА Ед./мл.
Принимая во внимание вышеизложенное, был создан новый быстрорастущий штамм вируса гепатита А. Штамм получил название ВБА-07. Максимальное количество антигена фиксируется на 6-7 сутки и достигает значения 2560 ИФА Ед./мл и выше. На основе этого штамма по новой технологии были изготовлены экспериментально-производственные серии вакцины.
На сегодняшний день успешно закончены доклинические и I фаза клинических исследований.
Ключевые слова: вакцина гепатита А, технология производства, иммуногенная активность, титр антигена, титр антител.
Abstract Some aspects of improving Hepatitis A vaccine production technology
M.A. Muntjanova, Iu. V.Nemtsov, H.I. Krjuk, V.V. Yashin, A.G. Kusliy, L.G. Nikulin Closed joint-stock company «Vector-BiAlgam», Koltsovo, Russia
At present a home-made vaccine ALGAVAC®M is being produced on the basis of "HAS -15/4647 " (LVA-86) strain of the hepatitis A virus. The accumulation of virus mass takes about 3 weeks with culture medium is replaced with a new one, which is expensive and labour-consuming. The viral antigen concentration after cultivation stage rarely exceeds (ELISA) 80 U/ml.
Taking into account the above mentioned, we created a new rapidly growing strain of hepatitis A virus. The strain has called VBA-07. The maximum amount of the antigen is observed on the 6th or the 7th day and reaches (ELISA) 160 U/ml and higher. On the basis of this strain, making use of our new technology we have created experimentally — production series of the vaccine.
There have been successfully carried out pre-clinical and I Phase of clinical tests. Keywords: hepatitis A vaccine, manufacturing technology, immunogenic activity, antigen titer, antibody titer.
Введение
Вирусный гепатит А является повсеместно распространенной инфекцией, но география заболевания носит неравномерный характер. Уровень заболеваемости гепатитом А коррелирует с санитарно-гигиеническим состоянием отдельных территорий. В Российской Федерации данный показатель остается довольно высоким и превышает уровень заболеваемости во многих развитых странах. Широкое внедрение в практику здравоохранения современных методов лабораторной диагностики инфекционных заболеваний закономерно привели к улучшению качества эпидемического надзора за ви-
русными гепатитами, в том числе и вирусным гепатитом А. Это позволяет своевременно фиксировать случаи заболеваемости и возможность начала эпидемии, но основное средство купирования вспышек — вакцинация.
В 90-е годы удалось адаптировать вирус гепатита А к различным культурам клеток: первичным, диплоидным и перевиваемым, что позволило создать хорошо воспроизводимые системы эффективного накопления вируса в количествах, необходимых для коммерческого производства вакцин. В те же годы появились первые сообщения о разработке инактивиро-ванных вакцин против гепатита А с использо-
ванием диплоидных клеточных линий. Однако, изготовление таких профилактических препаратов до сих пор сопряжено с большими трудностями.
На сегодняшний день в Российской Федерации разрешено применение трех зарубежных и двух отечественных вакцин. Основой всех перечисленных вакцин является вирус гепатита А, очищенный, концентрированный, инактивиро-ванный формалином, адсорбированный на алюминия гидроксиде.
При производстве российской вакцины против гепатита А в качестве культуры продуцента используется перевиваемая линия почек зеленой мартышки 4647.
Согласно требованию ВОЗ, содержание примесей в вакцинах, приготовленных на основе вирусных сборов с перевиваемых клеточных линий, жестко лимитированы, в частности, относительно остаточной клеточной ДНК — ее величина не должна превышать 100 пг на дозу. Это должно достигаться высокоэффективной очисткой вируссодержащей клеточной суспензии.
В России единственным отечественным производителем, выпускающим вакцину против гепатита А по полному циклу с 1999 г. является ЗАО «Вектор-БиАльгам». Для ее получения на предприятии имеется музей вирусов с производственными штаммами: «НАБ-15/4647» (получен из ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН, рабочее название ЛВА-86) и быстрорастущий штамм ВБА-07 (патент № 2405037, собственная разработка). Из данных штаммов в дальнейшем создаются банки с посевным вирусом первого и второго пассажа. На предприятии хранится главный банк культуры клеток 4647 (депозит ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН 1-3/1 от 10.03.1983 г.) для создания рабочего банка.
На протяжении всего периода производства вакцины ЗАО «Вектор-БиАльгам» проводило научно-экспериментальные и технологические исследования для повышения качества производимой вакцины и увеличения ее иммуноген-ных свойств. Основной целью усовершенствования технологии производства отечественной вакцины против гепатита А являлось получение препарата, дающего стойкий длительный иммунитет уже после однократного введения.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Создать в ЗАО «Вектор-БиАльгам» новую производственную площадку, существенно увеличив площадь боксовых и вспомогательных помещений, отвечающую всем
требованиям GMP, оснастив ее необходимым лабораторным и технологическим оборудованием.
2. Разработать технологию получения препарата с низким содержанием суммарного белка, бычьего сывороточного альбумина и клеточной ДНК для снижения реактогенно-сти вакцины.
3. Увеличить количество антигена в препарате для повышения иммуногенной активности вакцины.
Поставленные задачи были успешно решены, во многом благодаря созданию новой производственной площадки в отдельно стоящем корпусе, общей площадью 7387 м2, со всей требуемой инженерной инфраструктурой. Вся производственная зона, склады, вспомогательные помещения и инженерные системы (при-точно-вытяжная вентиляция, водоподготовка, обеззараживание отходов, стоки, энергообеспечение) были спроектированы и построены в соответствии с требованиями GMP. Все боксы производственной зоны были построены как «чистые комнаты» с классом чистоты «С», а поточность технологических операций исключала пересечение путей следования персонала, сырья, материалов, отходов, полупродуктов и готовой продукции.
Было дополнительно закуплено современное лабораторное и технологическое оборудование, материалы которых соответствуют классу проводимых работ. Все оборудование прошло этапы валидации на основании договора с ФГУ Новосибирский центр стандартизации, метрологии и сертификации.
Важнейшей составляющей повышения качества вакцины явилось усовершенствованная технология производства с дополнительными этапами очистки, которая прошла все требуемые этапы валидации, а новый способ получения вакцины против гепатита А защищен патентом РФ № 2314125 от 10.01.2008. Таким образом, в настоящий момент производство вакцины осуществляется на новой производственной площадке ЗАО «Вектор-БиАльгам» по усовершенствованной технологии, отвечающей всем основным отечественным и международным критериям качества. Суммарный объем инвестиций по этим этапам составил порядка 250 млн.рублей.
Ниже перечислены основные этапы изготовления вакцины гепатита А.
Посевной вирус 1-го пассажа получают путем заражения культуры продуцента 4647 одним из посевных штаммов ВГА. Для культивирования используют среду MEM Игла с добавле-
нием сыворотки плода коров и сыворотки новорожденных телят. Посевной вирус 1-го пассажа — это взвесь поврежденных методом замораживания-оттаивания клеток, содержащие ВГА. В полученном вируссодержащем материале определяют содержание вирусного антигена и инфекционный титр методом ИФА.
Для наработки вирусного антигена для вакцины используют посевной вирус 2-го пассажа. Посевной вирус второго пассажа представляет собой разрушенные замораживанием-оттаиванием клетки с вирусом в культуральной жидкости, получаемые путем заражения культуры продуцента посевным вирусом 1 -го пассажа.
Концентрация вирусного антигена 2-го пассажа должен быть не ниже 1280 ИФА Ед./мл. Для заражения монослоя клеток используют посевной вирус в среде Игла MEM. Вносимый объем составляет 10 мл с концентрацией по антигену 160 ИФА Ед./мл на одну роллерную бутыль. Инкубацию вируса (штамм ЛВА-86) осуществляют в течение 14-18 суток со сменой среды, либо 6-7 суток без смены среды — для штамма ВБА-07. По окончании инкубации куль-туральную жидкость удаляют, а клетки, содержащие вирус, снимают раствором Версена с добавлением химопсина.
Полученную вируссодержащую клеточную суспензию центрифугируют при 3000 об./мин и к осадку добавляют расчетный объем лизиру-ющего буфера (0,01 М ФСБ, 1% твин-80). Затем лизат клеток освобождают от ядер низкоскоростным центрифугированием, а надосадочную жидкость подвергают доочистке от балластных высокомолекулярных клеточных компонентов в режиме двустадийного ультрацентрифугирования и дополнительного низкоскоростного центрифугирования. Технологии очистки сводятся к следующим стадиям:
1 стадия — очистка через ступенчатый градиент сахарозы.
Процедура выполняется на ультрацентрифуге при 25000 об./мин в течение 12 ч. В каждый
бакет-ротор наливают осветленный клеточный лизат, к которому последовательно подслаивают расчетные количества 10 %, 20 % и 30 % растворов сахарозы. По окончании центрифугирования осадки растворяют в 0,01 М ФСБ с 1 % твин-80.
2 стадия — очистка объединенного первичного концентрата.
Несколько концентратов с 1 стадии объединяют и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 мин, после чего супернатант дочищают через «подушку» из 20% сахарозы на ультрацентрифуге при 25000 об./мин в течение 12 ч. Осадок вируса после удаления супернатанта растворяют в фосфатно-солевом буфере 0,01 М.
3 стадия — получение очищенного концентрата ВГА.
Растворенный осадок осветляют на центрифуге при 8000 об./мин в течение 30 мин, а затем концентрат ВГА фильтруют через стерильные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.
Завершающий этап — инактивация вируса формальдегидом при температуре 36,7±0,3 °С в термостатах в течение 15 суток. По истечении времени инактивации материал подвергают стерилизующей фильтрации.
После проверки препарата на полноту инактивации (специфическую безвредность), полуфабрикат (субстанция) вакцины сорбируют на геле алюминия гидроксида, доводят до конечного объема 0,01 М фосфатно-солевым буферным раствором и разливают по ампулам, шприцам или флаконам. Далее препарат поступает на стадию проведения контролей, после прохождения которых получается готовая форма вакцины.
Результаты и обсуждение
Основные отличительные характеристики препарата, полученного по усовершенствованной технологии, представлены в таблице 1.
Показатель Нормы по «старой» технологии Нормы по «новой» технологии
Остаточная клеточная ДНК Не более 100 пкг/мл Менее 100 пкг/мл
Бычий сывороточный альбумин Не более 50 нг/мл Менее 10 нг/мл
Общий белок по Лоури Не более 9 мкг/мл Менее 0,6 мкг/мл
Содержание антигена ВГА Не менее 50 ИФА ед. в одной дозе вакцины для взрослых. Не менее 25 ИФА ед. в одной дозе вакцины для детей. Не менее 320 ИФА ед. в одной дозе вакцины для взрослых. Не менее 160 ИФА ед. в одной дозе вакцины для детей.
Таблица 1. Различия в показателях качества вакцинных препаратов
Основные методы контролей описаны ранее
[!]■
Остаточную клеточную ДНК определяют по методике, рекомендованной Европейской Фармакопеей, 1997 г. Метод основан на молекулярной ДНК-ДНК гибридизации меченного биотином зонда, полученного путем ник-трансляции чистого препарата тотальной клеточной ДНК с остаточной клеточной ДНК, при-
сутствующей в анализируемом препарате и иммобилизованной на нитроцеллюлозном фильтре.
В таблице 2 представлены данные контролей производственных серий вакцины на основе штамма ЛВА-86 (серии №№ 94, 95 и 96) и экспериментально-производственные серии препарата на основе штамма ВБА-07 (серии №№ 010907,020907, 020907 и 041007).
Таблица 2. Основные показатели качества промышленных и экспериментально-производственных серий вакцины гепатита А_
Номер серии рН Формальдегид (мг/мл) Алюминия гидроксид (мг/мл) Остаточная клеточная ДНК (пкг/мл) Бычий сывороточный альбумин (нг/мл) Общий Белок (мкг/мл) Содерж. АГ ВГА (ИФА ед.) Знач. ИД50 не менее 10/доза
Фармацевтическая субстанция - инактивированный вирус штамм ЛВА-68
94 7,30 0,120 0,49 * 48 менее 4,0 0,012 320 11,22
95 7,30 0,118 0,49 * 47 менее 3,9 0,012 320 12,02
96 7,15 0,114 0,45 « 48 менее 3,9 0,014 320 12,88
Фармацевтическая субстанция - инактивированный вирус штамм ВБА-07
010907 7,32 0,13 0,45 - 25 менее 2,8 0,009 320 12,02
020907 7,34 0,134 0,45 - 32 менее 3,2 0,011 340 12,88
030907 7,34 0,128 0,42 - 14 менее 1,8 0,010 360 13,08
041007 7,26 0,15 0,5 - 27 менее 2,0 0,027 640 31,62
В таблицах 3-10, представленных ниже, указаны данные проведенных исследований серий вакцины гепатита А, изготовленных на основе
штаммов ЛВА-86 или ВБА-07, после хранения препаратов при температуре от 2 до 8 °С в течение 39 месяцев.
Таблица 5. Данные по контролю — «иммуногенная активность» (М±т при п=3)
Номера Дата Значение ИД50
серий изготовления 0 месяцев 24 месяца 39 месяцев
Фармацевтическая субстанция - инактивированный вирус штамм ЛВА-86
94 02.02.2009 г. 11,22±1,2 11,22±1,8 11,22±2,4
95 03.02.2009 г. 12,02±1,8 12,02±1,8 12,02±2,4
96 04.02.2009 г. 12,88±1,2 12,88±1,2 12,88±1,8
Фармацевтическая субстанция - инактивированный вирус штамм ВБА-07
010907 19.09.2007 г. 12,02±1,2 12,02±1,2 11,20±1,2
020907 20.09.2007 г. 11,20±1,2 11,20±1,8 11,20±1,8
030907 21.09.2007 г. 12,88±1,2 12,88±1,2 12,02±2,4
041007 09.10.2007 г. 31,62±0,6 31,62±1,2 31,62±2,4
Таблица 4. Определение содержания АГ ВГА (М±т при п=3)
Номера Дата Обратные титры АГ ВГА в вакцине после десорбции
серий изготовления 0 месяцев 24 месяца 39 месяцев
Фармацевтическая субстанция - инактивированный вирус штамм ЛВА-86
94 02.02.2009 г. >320 >320 >320
95 03.02.2009 г. >320 >320 >320
96 04.02.2009 г. >320 >320 >320
Фармацевтическая субстанция - инактивированный вирус штамм ВБА-07
010907 19.09.2007 г. >320 >320 >320
020907 20.09.2007 г. >340 >340 >340
030907 21.09.2007 г. >360 >360 >360
041007 09.10.2007 г. >640 >640 >640
Таблица 5. Данные по контролю - «аномальная токсичность»
Номера Дата Токсичность
серий изготовления 0 месяцев 24 месяца 39 месяцев
Фармацевтическая субстанция — инактивированный вирус штамм ЛВА-86
94 02.02.2009 г. нетоксичен нетоксичен нетоксичен
95 03.02.2009 г. нетоксичен нетоксичен нетоксичен
96 04.02.2009 г. нетоксичен нетоксичен нетоксичен
Фармацевтическая субстанция — инактивированный вирус штамм ВБА-07
010907 19.09.2007 г. нетоксичен нетоксичен нетоксичен
020907 20.09.2007 г. нетоксичен нетоксичен нетоксичен
030907 21.09.2007 г. нетоксичен нетоксичен нетоксичен
041007 09.10.2007 г. нетоксичен нетоксичен нетоксичен
Таблица 6. Данные по контролю — «пирогенность»
Номера Дата Пирогенность
серий изготовления 0 месяцев 24 месяца 39 месяцев
Фармацевтическая субстанция — инактивированный вирус штамм ЛВА-86
94 02.02.2009 г. апироген апироген апироген
95 03.02.2009 г. апироген апироген апироген
96 04.02.2009 г. апироген апироген апироген
Фармацевтическая субстанция — инактивированный вирус штамм ВБА-07
010907 19.09.2007 г. апироген апироген апироген
020907 20.09.2007 г. апироген апироген апироген
030907 21.09.2007 г. апироген апироген апироген
041007 09.10.2007 г. апироген апироген апироген
Таблица 7. Данные по контролю — «содержание алюминия гидроксида» (М±ш при п=3)
Номера Дата Содержание алюминия гидроксида (мг/мл)
серий изготовления 0 месяцев 24 месяца 39 месяцев
Фармацевтическая субстанция — инактивированный вирус штамм ЛВА-86
94 02.02.2009 г. 0,49±0,3 0,49±0,3 0,48±0,7
95 03.02.2009 г. 0,49±0,1 0,49±0,3 0,48±0,7
96 04.02.2009 г. 0,45±0,3 0,45±0,7 0,45±0,3
Фармацевтическая субстанция — инактивированный вирус штамм ВБА-07
010907 19.09.2007 г. 0,45±0,1 0,43±0,3 0,42±0,7
020907 20.09.2007 г. 0,45±0,3 0,44±0,7 0,42±0,3
030907 21.09.2007 г. 0,42±0,1 0,42±0,3 0,42±0,3
041007 09.10.2007 г. 0,50±0,3 0,50±0,3 0,49±0,7
Таблица 8. Данные по контролю — «содержание формальдегида» (М±ш при п=3)
Номера Дата Содержание формальдегида (мг/мл)
серий изготовления 0 месяцев 24 месяцев 39 месяцев
Фармацевтическая субстанция — инактивированный вирус штамм ЛВА-86
94 02.02.2009 г. 0,120±0,033 0,120±0,033 0,120±0,033
95 03.02.2009 г. 0,118±0,033 0,118±0,033 0,118±0,033
96 04.02.2009 г. 0,114±0,033 0,114±0,033 0,114±0,067
Фармацевтическая субстанция — инактивированный вирус штамм ВБА-07
010907 19.09.2007 г. 0,130±0,033 0,130±0,033 0,130±0,033
020907 20.09.2007 г. 0,134±0,033 0,133±0,033 0,133±0,067
030907 21.09.2007 г. 0,128±0,033 0,128±0,033 0,128±0,033
041007 09.10.2007 г. 0,150±0,033 0,149±0,033 0,149±0,033
Таблица 10. Данные по контролю — «pH» (М±ш при п=3)
Таблица 9. Данные по контролю — «стерильность»
Номера серий Дата изготовления Стерильность
0 месяцев 24 месяцев 39 месяцев
Фармацевтическая субстанция - инактивированный вирус штамм ЛВА-86
94 02.02.2009 г. стерилен стерилен стерилен
95 03.02.2009 г. стерилен стерилен стерилен
96 04.02.2009 г. стерилен стерилен стерилен
Фармацевтическая субстанция - инактивированный вирус штамм ВБА-07
010907 19.09.2007 г. стерилен стерилен стерилен
020907 20.09.2007 г. стерилен стерилен стерилен
030907 21.09.2007 г. стерилен стерилен стерилен
041007 09.10.2007 г. стерилен стерилен стерилен
Номера серий Дата изготовления pH (М±т)
0 месяцев 24 месяцев 39 месяцев
Фармацевтическая субстанция — инактивированный вирус штамм ЛВА-86
94 02.02.2009 г. 7,30±0,03 7,30±0,03 7,28±0,07
95 03.02.2009 г. 7,30±0,03 7,30±0,03 7,29±0,03
96 04.02.2009 г. 7,15±0,03 7,15±0, 0,03 7,13±0,07
Фармацевтическая субстанция — инактивированный вирус штамм ВБА-07
010907 19.09.2007 г. 7,32±0,03 7,31±0,03 7,32±0,03
020907 20.09.2007 г. 7,34±0,03 7,34±0,03 7,32±0,07
030907 21.09.2007 г. 7,34±0,03 7,34±0,03 7,33±0,03
041007 09.10.2007 г. 7,26±0,03 7,25±0,03 7,25±0,07
Заключение
Совокупность усилий, направленных на создание новой современной производственной площадки в ЗАО «Вектор-БиАльгам», отвечающей всем требованиям СМР, и внедрение усовершенствованной технологии производства вакцины позволило достичь поставленных целей:
1. Производить вакцину в промышленном масштабе по качеству соответствующую мировым стандартам.
2. Значительно снизить содержание суммарного белка, бычьего сывороточного альбумина и клеточной ДНК в пересчете на готовую продукцию — вакцину.
3. Увеличить количество антигена (инактивированный ВГА) в вакцине, значительно повысив ее иммуногенную активность без ухудшения других важных свойств препарата — реактогенности и безвредности.
4. Выпускать вакцину, сохраняющую свою стабильность в течение 3-х лет.
5. Добиться стимулирования быстрого накопления противовирусных антител в защитных титрах уже после однократного введения, и, тем самым, большого процента сероконверсии.
Последнее нашло свое подтверждение в ходе применения коммерческих серий вакцины против гепатита А для вакцинации, как взрослых, так и детей в период 2009-2011 гг. Высокие качества вакцины были отмечены и нашли свое подтверждение в ходе вакцинации воинского контингента [2].
Литература
[1] Андреев Ю.Л., Маева Т.Е., Куслий А.Г., и др. Физико-химическая и иммунологическая характеристики вакцины «ГЕП-А-ин-ВАК» при различных условиях хранения. // Биопрепараты. - 2008. - № 4(32). -С.26-28.
[2] Акимкин В.Г., Коротченко С.И., Алимов A.B., Шевцов В.А., Результаты иммунопрофилактики гепатита А в Вооруженных силах Российской Федерации. Опыт применения отечественной вакцины ГЕП-А-ин-ВАК в организованных коллективах военнослужащих // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2011. -№3.(58) - С.70-74.
[3] Горбунов М.А., Павлова Л.И., Карпович Л.Г., Калашникова Т.В. и др. " Оценка реактогенности иммуногенности культуральной концентрированной инактивированной вакцины против гепатита А "Геп-А-ин-Вак". Вопр. вир., 1995, № 5, с. 219-220,
[4] Карпович Л.Г., Калашникова Т.В., Горбунов М.А. и др. "Сравнительное изучение иммуногенности инактивированной вакцины против гепатита А ГЕП-А-ин-ВАК по данным экспериментальных и клинических
исследований", Вопр. вирусологии, 1995, № 5, с. 268270.
[5] Майданюк А.Г., Немцов Ю.В., Бондаренко Е.П., Мунтянова М.А., Крюк Н.И. и др. "Оптимизация условий получения инактивированной вакцины против гепатита А и ее характеристики". Вопр. вир., 1995, № 6, с. 215-218,.
[6] Патент на изобретение № 2514125 «Способ получения инактивированной вакцины против вируса гепатита А».
[7] Патент на изобретение № 2405057 «Штамм вируса гепатита А для приготовления вакцинных и диагностических препаратов».
Контактная информация:
Мунтянова Мария Алексеевна, тел.: (383) 3367367; email: [email protected]
