CC BY
83
Сибирский медицинский журнал, 2010, № 2 © ВЯТЧИНА О.Ф., ЖДАНОВА Г.О., СТОМ Д.И. — 2010
НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ РЕАКЦИИ ПЕНООБРАЗОВАНИЯ В СУСПЕНЗИИ САХАРОМИЦЕТОВ
О.Ф. Вятчина, Г.О. Жданова, Д.И. Стом ('Иркутский государственный университет, ректор — д.х.н., проф. Смирнов, кафедра микробиологии, зав. — д.б.н., проф. Б.Н. Огарков, НИИ биологии ИГУ, директор, лаборатория водной токсикологии, зав. — д.б.н., проф. Д.И. Стом)
Резюме. При добавлении к суспензии пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae глюкозы происходит интенсивное пенообразование. Эта особенность сахаромицетов была использована для разработки тест-реакции. Подобрано оптимальное соотношение компонентов реакционной смеси. Определено влияние температуры, уровня NaCl, значения рН и концентрации этанола для протекания процесса пенообразования. Показана перспективность реакции пенообразования для биотестирования.
Ключевые слова: биотестирование, тест-реакция, Saccharomyces cerevisiae, пенообразование.
SOME FEATURES OF FOAMING REACTION IN SACCHAROMYCES' SUSPENSION
O.F. Vjatchina, G.O. Zhdanova, D.I. Stom (Irkutsk State University)
Summary. There is an intensive foaming at addition of baking yeast Saccharomyces cerevisiae to glucose suspension. This Saccharomycetes’ characteristic has been used for development of test reaction. The optimal balance of components of a reaction mixture is picked up. The influence of temperature, NaCl level, рН values and concentration of ethanol for streaming of foaming process are defined. The perspectivity of foaming reaction for biotesting is shown.
Key words; biotesting, test reaction, Saccharomyces cerevisiae, foaming.
В последние десятилетия при осуществлении экологического мониторинга все шире используется биотестирование. В этом аспекте трудно переоценить перспективы микробиологического тестирования. Микроорганизмы могут проявлять специфическую чувствительность к отдельным веществам сточных вод и могут быть качественными и количественными индикаторами их присутствия. Некоторые микроорганизмы обладают повышенной чувствительностью к ядам и высокой скоростью ответа на действие токсикантов [4]. Методика содержания и культивирования многих микроорганизмов проста и позволяет за короткое время получать в массовом количестве однородный материал. Всё это существенно снижает систематические ошибки, характерные для биологического эксперимента. Наиболее достоверные сведения о характере воздействия вещества на организм получают при использовании в качестве тест-откликов процессов роста и размножения. Но физиологические и биохимические реакции позволяют обнаруживать более ранние изменения в организмах. Поэтому они больше подходят для проведения экспрессного биотестирования. Дрожжи 8ассНатотусе$ сетеуг$гае являются удобным объектом для биотестирования [1, 5, 6]. При добавлении к суспензии пекарских дрожжей глюкозы происходит интенсивное и быстрое пенообразование. В связи со сказанным целью данного сообщения было изучение реакции пе-нообразования в плане ее возможного использования для биотестирования.
Материалы и методы
Первоначально для проведения тест-реакции готовили суспензию, содержащую 34 мг/мл сухих дрожжей 5. сетеуг$гае, т.е. то количество, которое рекомендовано для проведения ускоренного метода определения быстроты подъема теста по скорости всплывания шариков теста, используемого в заводских лабораториях для внутрипроизводственного контроля качества дрожжей [3]. Источником дрожжей служили коммерческие препараты сухих пекарских дрожжей «Саф-Момент» (производство Франция), «Пять поваров» (ООО «Продсоюз», Красноярск).
Навеску дрожжей суспендировали в 5 мл раствора исследуемого соединения, тщательно перемешивали, затем добавляли Б-глюкозу в количестве 10 мг/мл. Мерную пробирку объемом 10 мл с полученной дрож-
жевой суспензией помещали в термостат (30 °С) и инкубировали 25 мин, после чего определяли объем образовавшейся дрожжевой пены и вычисляли скорость ее подъема:
« = f- > (D
где и — скорость подъема пены, мл/мин, V — объем пены, мл, t — время, мин.
По этому показателю оценивали степень ингибирующего или стимулирующего воздействия тестируемого соединения на дрожжи.
Для оптимизации условий проведения реакции, а также для выявления возможности использования ее для биотестирования варьировали содержание дрожжей и глюкозы, брали другие источники углерода, и оценивали воздействие на процесс пенообразования сахаромицетов температуры, рН, солености среды.
Разработанную тест-реакцию апробировали для определения токсичности водных растворов солей тяжелых металлов CuSO4, Hg(NO3)2, Cd(CH3COO)2.
Для статистическом обработки полученных данных использовали пакет программ Excel Windows. После проверки выборки на нормлаьность с использованием критерия Шапиро-Уилка значимость различий определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Выводы сделаны при вероятности безошибочного прогноза р>0,95.
= 0,25
0 5 10 15 20 25 35 40 45 50
концентрация глюкозы, мг/мл
Рис. 1. Зависимость интенсивности реакции от содержания глюкозы в суспензии.
Результаты и обсуждение
При разработке тест-реакции на первом этапе работы варьировали содержание глюкозы и дрожжей в водном растворе. Экспериментально выявили, что с повышением количества глюкозы в дрожжевой суспензии росла и скорость подъема пены. Максимальная скорость реакции была зафиксирована при концентрации глюкозы, равной 20 мг/мл. Дальнейшее увеличение содержания сахара не только не увеличивало, а даже снижало скорость реакции (рис. 1).
Повышение количества дрожжей в суспензии до 120 мг/мл приводило к интенсификации реакции. Однако увеличение скорости пенообразования усложняло задачу фиксации результатов и росло стандартное отклонение. В связи с чем в дальнейших исследованиях в раствор добавляли дрожжи в количестве 68 мг/мл (рис. 2).
Рис. 2. Зависимость интенсивности реакции от содержания дрожжей в суспензии.
Соотношение компонентов: Б-глюкоза — 20, дрожжи сухие — 68 мг/мл оказалось наиболее приемлемым для проведения тест-реакции. При этом время выдерживания суспензии в термостате при 30°С, достаточное для развития пенообразования, сократилось до 15 мин (при соотношении: дрожжи — 34; Б-глюкоза — 10 мг/мл поднятие пены фиксировали по истечении 25 мин.).
В дрожжевой суспензии с сахарозой скорость подъема пены была достоверно ниже (при уровне значимости Р = 0,05), чем в суспензии с глюкозой — 0,12 ± 0,01 и 0,17 ± 0,01 мл/мин., соответственно. Слабое пенообра-зование шло в суспензии дрожжей с Б+-раффинозой и Б+-мальтозой. При замене глюкозы на L+-арабинозу, Б+-галактозу и рамнозу образования пены не происходило.
Предлагаемая для биотестирования реакция может развиваться в достаточно широком диапазоне pH от 4 до 7,5. При рН раствора 5 отмечали наибольшую скорость подъема пены.
Рис. 4. Влияние содержания этанола на скорость подъема пены в дрожжевой суспензии.
Для процесса пенообразования благоприятный уровень солености среды составлял от 0 до 1%. Максимальную скорость реакции наблюдали при концентрации №С1, равной 0,5%. При повышении содержания соли до 3 % происходило угнетение, а в присутствии 7% №С1 — полное подавление процесса.
Тест-реакция с реальной скоростью протекала в растворах с температурой от 20 до 60°С. Наиболее высокую скорость подъема пены фиксировали при температуре воды 40°С (рис. 3).
Пенообразование в условиях достаточно высоких температур делает возможным использовать данный биотест для оценки токсичности или биологической активности тех веществ, точка растворения которых лежит в более высоком температурном диапазоне.
При биотестировании многих гидрофобных веществ для их перевода в растворимую фазу чаше всего используют этанол, поэтому важно, что пенообразующая активность 5. cerevisiae сохранялась в присутствии достаточно высоких концентраций спирта (до 15%). Но интенсивность процесса при содержании этилового спирта в реакционной смеси выше 5%, была существенно ниже, чем в контроле (рис. 4).
Предложенный биотест использовали для определения солей тяжелых металлов в водных растворах. Метод оказался чувствительным к солям кадмия, меди, ртути в концентрациях от 0,00001% (рис. 5).
Рис. 3. Влияние температуры на скорость подъема пены в дрожжевой суспензии.
Рис. 5. Влияние солей тяжелых металлов на скорость подъема пены в дрожжевой суспензии.
Тест-реакция была апробирована и показана ее перспективность и для оценки токсичности ряда других соединений, в частности гуматов и детергентов [2].
Схожие результаты получены и с другими препаратами сухих дрожжей, в частности фирмы «Пять поваров», ООО «Продсоюз», Красноярск.
Таким образом, предложенная реакция, основанная на определении скорости подъема дрожжевой пены, может быть рекомендована для использования при биотестировании, так как она чувствительна к достаточно низким концентрациям токсичных растворимых веществ. Кроме того, разработанный тест отличается такими преимуществами как экспрессность, доступ-
ность, техническая простота, возможность проведения анализа вне микробиологической лаборатории без специального оборудования и без подготовки соответствующих специалистов. Следует также отметить дешевизну и доступность тест-объекта. В качестве последнего могут быть использованы любые коммерческие пре-
параты дрожжей, причем отсутствует необходимость постоянного поддержания тест-культуры в активном состоянии.
Работа выполнена частично при поддержке грантов: Роснауки Госконтракт 02.740.11.0018; ФЦП 2009-1.1154-065-005 и РФФИ 08-04-98057-Сибирь_а.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воронова Е.А., Ильясов П.В., Кувичкина Т.Н. и др. Использование дрожжей рода Агхи1а для определения биологического потребления кислорода // Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера» тезисы. — М., 2007. — С. 23-24.
2. Вятчина О.Ф., Жданова Г.О., Стом Д.И. Экспрессный приём биологического анализа качества вод с помощью сахаромицетов // Естественные науки. Журнал фундаментальных и прикладных исследований. — ГОД. — №3 (28). — С. 86-88.
3. Зюзина О.В., Матвейкина Г.В., Муратова Е.И. и др. Промышленные технологические линии — Тамбов: Изд-во Тамб. гос. тех. ун-та, 2006. — 60 с.
4. Постнов И.Е., Туманов А.А. Биологический метод ана-
лиза: проблемы избирательности и чувствительности определения биологически активных веществ // Журнал аналитической химии. — 2000. — Т. 55, №2. — С. 208-211.
5. Старовойтова О. В., Борисова С.В., Мингалеева З.Ш., Решетник О.А. Исследование влияние стимуляторов на свойства дрожжей // Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспектива развития», Москва, 12-16 марта 2007: Материалы конгресса. — М., 2007. — С. 220.
6. Филиппова Т.О., Галкин Б.Н., Зинченко О.Ю. и др. Взаимодействие микроорганизмов с природными и синтетическими порфиринами // Вестник Одесского национального университета. — 2001. — Т. 6. Вып. 4. — С. 317-321.
Информация об авторах: бб4003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5.
Вятчина Ольга Федоровна — доцент, к.б.н., биолого-почвенный факультет ИГУ, кафедра микробиологии.
Тел. (3952) 4б3178;
Жданова Галина Олеговна — аспирант, E-mail: [email protected];
Стом Дэвард Иосифович — заведующий лабораторией, д.б.н., профессор, E-mail [email protected]
© ГОЛЬТВАНИЦА Г.А. — 2010
НАРУШЕНИЕ БАЛАНСА СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ ПРИ ЭПИЛЕПСИИ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ
Г.А. Гольтваница
(Краевая детская клиническая больница, г. Чита, гл. врач — В.В. Комаров, краевой реабилитационный противоэпилептический центр, руководитель — к.м.н. Г.А. Гольтваница)
Резюме. У 98 детей и подростков с эпилепсией, в возрасте от 4 до 18 лет, изучен уровень стероидных гормонов (кортизола, кортизона, альдостерона). Зарегистрировано не соответствие норме уровня кортизола у 58,0% пациентов, кортизона — 32,0%, альдостерона — 62,0% при фармакорезистентных эпилепсиях, только альдостерона — 40,6% при эпилепсиях с положительным эффектом от антиэпилептической терапии. Выявлено превышение нормальных показателей кортизола (50,0%), кортизона (32,0%), альдостерона (60,0%) при фармакорезистентных эпилепсиях и только альдостерона (40,6%) при эпилепсиях с положительным эффектом от антиэпилептической терапии.
Ключевые слова: эпилепсия фармакорезистентная, стероидные гормоны.
SHIFTING OF BALANCE OF STEROID HORMONES AMONG CHILDREN AND TEENAGERS WITH EPILEPSIES
G.A. Goltvanitsa (Regional Children’s Clinical Hospital, Chita)
Summary. The level of steroid hormones among children aged from 4 to 18 has been investigated. It has been registered that the level of cortisol doesn’t correspond the norm among 58,0% of patients, the level of cortisone — 32,0%, the level of aldosteronum — among 62,0% of patients with pharmacoresistant epilepsies; the level of aldosteronum only — 40,0% epileptics with positive treatment effect. The excess of normal range of cortisol was reveled (50,0%), as well as of cortisone (32,0%) and aldosteronum (60,0%) in cases of pharmacoresistant epilepsies, and aldosteronum only (40,6%) in cases of epilepsies with positive treatment effect.
Key words: pharmacoresistant epilepsy, steroid hormones.
Многообразие физиологических эффектов гормонов является общепризнанным фактом. В настоящее время широко исследована связь центральной нервной системы (ЦНС) с эндокринной системой [1, 3], тогда как обратная связь действие гормонов на ЦНС изучена меньше [2, 5].
Многими авторами изучалась роль гормонов в патогенезе дополнительной стимуляции эпилептической активности, выявлялась роль нарушений эндокринной системы при эпилептической активности в мозге, действие антиконвульсантов на гормональную систему, оценка возможности применения гормональной терапии в комплексной терапии эпилепсии [4, 7].
Многие гормоны и, в первую очередь, адренокорти-котропный гормон (АКТГ) и кортикостероид — кор-
тизол, обладают значительным влиянием на процессы регуляции судорожной готовности головного мозга. Экспериментально доказано, что кортикостероиды способны редуцировать возбудимость пирамидальных клеток гиппокампа, снижают возбудимость в септуме, увеличивают судорожный порог в них, и проявляют свойства антиконвульсантов [10].
По данным других исследователей, данный эффект может быть обусловлен индукцией синтеза молекул триптофангидроксилазы в мозге [6].
Кортизол вызывает эпилептическую активность, проявляет свойства эпилептогена, альдостерон — анти-эпилептическую активность [3, 13].
Значительное накопление (повышение секреции) некоторых гормонов (альдостерона, мелатонина, тесто-
