CC BY
158
8. Ткачев А.В. Библиотека хромато-масс-спектро- Gas Chromatography/Mass Spectroscopy. 4th Edition, Illinois,
метрических данных летучих веществ растительного проис- USA, 2007. — 804 P.
хождения. — Новосибирск, 2006. — с. 10. Томчук Р.И., Томчук Г. Н. Древесная зелень и ее исполь-
9. Adams R.P. Identification of Essential Oil Components by зование. — М.: Лесн. пром-сть, 1966. — 261 с.
Информация об авторах: Зыкова Ирина Дементьевна — к.т.н., доцент кафедры , 660074, г. Красноярск, ул. Киренского, д. 26, ИФП СФУ, кафедра химии, тел. (391) 2497559, е-mail: [email protected];
Ефремов Александр Алексеевич — д.х.н., профессор, профессор кафедры, заведующий лабораторией;
Нарчуганов Антон Николаевич — аспирант.
© ЖДАНОВА Г.О., ВЯТЧИНА О.Ф., БЫБИН В.А., СТОМ Д.И., ФЕДОСЕЕВА Г.М. — 2013 УДК 615.017:616.079; 615.2/.3
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ДЛЯ ОЦЕНКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
Галина Олеговна Жданова1, Ольга Федоровна Вятчина1, Виктор Александрович Быбин 1’2,
Дэвард Иосифович Стом1,3, Галина Михайловна Федосеева4 ('Иркутский государственный университет, ректор — д.ф.-м.н, проф. А.В. Аргучинцев;
2 Иркутский государственный технический университет, ректор — д.т.н., проф. А.М. Головных;
3Байкальский музей Иркутского научного центра СО РАН, директор — к.г.н. В.А. Фиалков;
4Иркутский государственный медицинский университет, ректор д.м.н., проф. И.В. Малов)
Резюме. Определена биологическая активность ряда лекарственных средств растительного происхождения и противогрибковых препаратов с использованием Saccharomyces cerevisiae. Тест-реакция основана на способности дрожжей верхового брожения образовывать пену на поверхности сбраживаемой жидкости (вода с добавлением 2 % глюкозы). О биоактивности фармацевтических средств судили по их влиянию на скорость пенообразования в дрожжевой суспензии с глюкозой. Показана возможность использования предложенной тест-реакции для оценки биологической активности ряда лекарственных средств растительного происхождения и противогрибковых препаратов.
Ключевые слова: биологическая активность, биотестирование, дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, пенообразова-ние, фитопрепараты, противогрибковые препараты.
THE USE OF SACCHAROMYCES CEREVISIAE FOR ESTIMATION OF BIOLOGICAL ACTIVITY OF MEDICATIONS
G.O. Zhdanova1, O.F. Vyatchina1, V.A. Bybin1'2, D.I.Stom1,3, G.M.Fedoseeva 4 ('Irkutsk State University; 2Irkutsk State Technical University; 3Baikalian Museum at the Irkutsk Scientific Center of the S D of the RAS; 4Irkutsk State Medical University, Russia)
Summary. The biological activity of some herbal medicines and antifungal preparations is defined by the method with use of Saccharomyces cerevisiae. The test-reaction is based on capacity of top fermentation yeast to form foam on a surface of fermentable liquids (water with addition of glucose 2%).The bioactivity of medications was estimated by their influence on speed of foaming in yeast slurry with glucose. The possibility of using the proposed test reaction to evaluate the biological activity of a number of herbal medicines and antifungal drugs has been shown.
Key words: biological activity, bioassay, yeasts, Saccharomyces cerevisiae, foaming, herbal medicinal products, antifungal preparations.
В связи с тем, что для производства многокомпонентных животных и растительных препаратов используется сырьё биологического происхождения, количество и качество физиологически активных агентов, входящих в его состав, сильно зависят от действия различных факторов биотической и абиотической природы, в частности от различий в условиях обитания организмов, погоды, условий питания, возраста, времени хранения и т.п. Поэтому крайне важно иметь простые и дешевые методы экспрессной оценки их активности. Наличие таких методов позволило бы преодолеть основной момент, сдерживающий применение в официальной медицине самых различных комплексных многокомпонентных животных и растительных препаратов, — трудности при дозировке их активного начала. Эти приемы могут быть также использованы для контроля условий производства, хранения и эффективного применения ВП. К сожалению, на сегодня подобных способов очень мало [4, 5]. Недостатками существующих методов оценки активности являются длительность получения ответа, дороговизна, потребность в соответственно оборудованных лабораториях.
Ранее нами для биотестирования сред была разработана методика, в которой в качестве тест-отклика
использовали определение скорости подъема пены в суспензии дрожжей S. cerevisiae [1]. В данной работе была проведена проверка возможности использования предложенной тест-реакции для оценки биоактивности ряда лекарственных средств растительного происхождения и противогрибковых препаратов.
Материалы и методы
Оценивали биологическую активность следующих фитопрепаратов: ромашка аптечная (Chamomillae recutitae, L.,1753), курильский чай (лапчатка кустарниковая (Potentilla fruticosa, L., 1753)), каркаде (Hibiscus sabdariffa, L., 1753), тысячелистник обыкновенный (Achillea millefolii, L., 1753), чистотел большой (Chelidonium Major, L., 1753), шалфей лекарственный (Salviae officinalis, L., 1753), грушанка круглолистная (Pyrola rotundifolia, L., 1753), сенна остролистная (Cassia acutifolia, L., 1753), эдельвейс скученный (Leontopodium conglobatum, (Turcz.) Hand.-Mazz.), кошачья лапка двудомная (Antennaria dioica, L.,1753), боровая матка (ор-тилия однобокая - Orthilia secunda, L., 1753), чай «Принцесса Нури» (Camellia sinensis, L., 1753), сбор «Ермак» (листья бадана, брусники, грушанки и смородины,
цветки лабазника, кора осины и трава зверобоя), сбор «Анастасия» (ортилия однобокая, грушанка круглолистная и курильский чай), отвар корня и настойка на 70 %-ом этаноле левзеи сафлоровидной (Rhaponticum carthamoides, (Willd.)), настойка на 40 %-ом этаноле элеутерококка колючего (Eleutherococcus senticosus, (Rupr. et Maxim.)), трутовик скошенный - Inonotus obliquus (Pil., 1942) [2]. Кроме того, в работе использовали также противогрибковые препараты: нистатин (19-микозами-нилнистатиномид; 1 таблетка содержит нистатина 500 000 ЕД, ОАО «Биосинтез», Россия, г. Пенза), амфотери-цин (лиофилизированный порошок для приготовления раствора для инфузий, содержание амфотерицина — 50 мг, производитель ОАО «Биосинтез», Россия, г. Пенза). Также тестировали получаемый из панцирей ракообразных и обладающий микробоцидными свойствами хитозан (ЗАО «Эвалар»).
Тест-объектом являлись дрожжи S. cerevisiae (препарат сушеных пекарских дрожжей «Саф-Момент», «Саф-Нева»).
Для получения отвара лекарственных трав измельченное растительное сырье заливали кипящей водой (1 г сырья на 20 мл воды), настаивали при температуре +24 °С в течение 30 мин и фильтровали через стерильную марлю. Затем из полученного экстракта готовили разведения 1:10, 1:20, 1:40, 1:80. В 20 мл анализируемой пробы вносили 1,36 г сушеных дрожжей, суспендировали, добавляли 0,4 г глюкозы, разливали по 3 мл в мерные пробирки и инкубировали в течение 15 мин при 30 °С. По истечении этого времени определяли объем образовавшейся пены и вычисляли скорость ее подъема по формуле:
v = V ’ (1)
где v — скорость подъема пены (мл/мин), V — объем пены, мл, t — время, мин.
Снижение скорости подъема пены рассматривали как ингибирующий, а повышение как — стимулирующий эффект.
Антибиотики нистатин, амфотерицин, препарат хитозана растирали в ступке до получения гомогенной массы и готовили растворы с концентрацией 0,1; 0,3 и 0,5 мг/мл. Затем в полученные растворы добавляли дрожжи и глюкозу (1,36 г дрожжей и 0,4 г глюкозы на 20 мл раствора) и проводили тестирование по выше указанной схеме.
Контролем служила суспензия дрожжей, приготовленная на основе водопроводной дехлорированной путем отстаивания воды. Эксперименты проводили в 5-и независимых опытах с 3 параллельными измерениями.
Фунгицидную активность нистатина, амфотерици-на, хитозана по отношению к S. cerevisiae оценивали при помощи метода лунок [3].
Для статистической обработки полученных данных использовали пакет программ Microsoft Exсel. Статистическая значимость различия результатов определяли с помощью критерия Стьюдента при вероятности безошибочного прогноза Р30,95.
Результаты и обсуждение
Отвар эдельвейса скученного (Leontopodium conglo-batum) в разведении 1:20 существенно повышал интенсивность пенообразования в суспензии S. cerevisiae. Аналогичный эффект оказывал водный экстракт (1:20 и 1:40) корня левзеи сафлоровидной (Rhaponticum carthamoides). Отвары кошачьей лапки двудомной (Antennaria dioica) в разведениях 1:20 и 1:40 также стимулировали физиологическую активность дрожжей (рис. 1, 2).
При оценке биологической активности других фитосборов отмечали выраженное антимикробное действие используемых разведений отваров по отношению
Рис. 1. Воздействие отваров эдельвейса скученного (ЬеоМоройшт сощ1оЬаШт) и кошачьей лапки двудомной (Ап1еппат1а Шока) на скорость подъема пены в суспензии & сегеу(з(ае.
□ корень левзеи 1/40 а корень левзеи 1/20
□корень левзеи 1/10 □ контроль
Рис. 2. Воздействие отваров корня левзеи сафлоровидной (КЪаропИсит сагЛато1йе$) на скорость подъема пены в суспензии 5. сетеу1$1ае.
а і -I
S
1.2
Рис. 3. Воздействие отваров лекарственных трав на скорость подъема пены в суспензии 5. сегеу(з(ае.
к S. cerevisiae. Курильский чай, тысячелистник обыкновенный, чистотел, грушанка круглолистная, ромашка аптечная при концентрации по массе в водных экстрактах 1:20 снижали интенсивность пенообразования в дрожжевой суспензии на 75-89% относительно контроля, ортилия однобокая (боровая матка) — на 62%. Наиболее сильное воздействие на S. cerevisiae оказывал шалфей, при указанной концентрации процесс пеноо-бразования не развивался (рис. З).
Сильный угнетающий эффект (на 95% по отношению к контролю) на активность дрожжей оказывал водный экстракт чаги, сбор «Анастасия», чаи «Ермак» и «Каркаде». Чай «Принцесса Нури» подавлял интенсивность пенообразования на 8З% по сравнению с контролем, что говорит о его сильном антимикробном действии (рис. З).
Дрожжи сетеугзгае оказались пригодными для оценки биологической активности противогрибковых препаратов. Антибиотики нистанин и амфотерицин, а также хитозан подавляли пенообразование в суспензии дрожжей с глюкозой, обладали фунгицидным действием (рис. 4, 5, табл.1).
Таблица 1
Влияние нистатина и амфотерицина на рост вассНатотусез сетеу1з1ае
Антибиотик Концент- рация, мг/мл Зона подавления роста, мм
Нистатин 0,5 28,0±1,0
Амфотерицин 0,1 20,0±3,0
0,3 19,7±1,67
Хорошая воспроизводимость результатов, техническая простота исполнения, доступность и дешевизна тест-объекта и самого процесса определения позволяют рекомендовать предложенный биотест для оценки биологической активности фитопрепаратов и противогрибковых антибиотиков.
Авторы выражают признательность Н.М. Будневу и
Н.И. Граниной за ценные советы и поддержку исследований в данном направлении.
Работа частично проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашения: ГК № 14.B37.21.0785 от 24.08.12, ГК №11.519.11.5016 от 28.10.11) и Программы стратегического развития.
Рис. 4. Влияние антибиотиков на скорость подъема пены в суспензии 5. сетеугзгае.
Г
и
-J
Рис. 5. Определение чувствительности Saccharomyces cerevisiae к антибиотикам (А — нистатин 0,5 мг/мл; Б — амфотерицин 0,1 мг/мл; В — амфотерицин 0,3 мг/мл).
ЛИТЕРАТУРА
1.Вятчина О.Ф., Жданова Г.О., Стом Д.И. Экспрессный приём биологического анализа качества вод с помощью сахаромицетов // Естественные науки. Журнал фундаментальных и прикладных исследований. — 2009. — № 3 (28). — С. 86-88.
2. Государственная фармакопея СССР: Справочник. — XI издание (ГФ XI), вып. 2. «Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье». — М.: Медицина, 1990. — 400 с.
3.Нетрусов А.И. и др. Практикум по микробиологии:
Учеб. пособие для студ. вузов. / Под ред. А. И. Нетрусова. — М.: Академия, 2005. — 608 с.
4. Способ оценки активности вермипрепарата / В. А. Бы-бин, А.Э. Балаян, Д.И. Стом и др. //Патент РФ № 2413219; За-явл. 05.11.2008; Приоритет 05.11.2008; Опубл. 27.02.2011, Бюл. № 6.
5. Тимофеев Н.П. Фитоэкдистероиды: Фармакологическое использование и
Информация об авторах: Жданова Галина Олеговна — младший научный сотрудник, 664003, г. Иркутск, ул. Ленина 3, тел. (3952) 343437, e-mail: [email protected]; Вятчина Ольга Федоровна — к.б.н., доцент кафедры, 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, e-mail: [email protected]; Быбин Виктор Александрович — к.б.н., научный сотрудник, e-mail: [email protected]; Стом Дэвард Иосифович — д.б.н., ведущий научный сотрудник, 664020, г. Иркутск, ул. Бульвар Гагарина, 20, e-mail: [email protected]; Федосеева Галина Михайловна — д.ф.н., профессор кафедры, 664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 10, e-mail: [email protected].
© ЕРУУЛТ Ч., НАРАНХАЖИД М., ЧОЙЖАМЦ Г., ПУРЭВДОРЖ И. — 2013 УДК: 615.322.276.036.8:616.24-002.5-08
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ йАВІРНОЙА РйиГІСОВА РАСТУЩЕГО В МОНГОЛИИ
Ч.Еруулт, М. Наранхажид, Г.Чойжамц, И. Пурэвдорж (Монгольский государственный медицинский университет, ректор — д.м.н., проф. Ц. Лхагвасурэн, Биомедицинский институт, директор — к.м.н., проф. Г.Батбаатар, кафедра фармакологии,
зав. — к.м.н., проф. Г.Чойжамц)
Резюме. Мало что известно о ДНК Ма1к последовательностей и филогенетического анализа пятилистника ку-старникова (БазгрНота/тиЫсова), произрастающей в Монголии. Для исследования молекулярно-генетического анализа БазгрНота/тШгсоза и филогенетические отношения связаны родов мы использовали часть последовательности ДНК хлоропластов. таК-гены 92 изолятов были амплифицированы, 48 изолятов были секвенированы для изучения филогенетических. ПЦР-анализ выполненнен с полученными последовательностями таК-гена показал> 98% сходства с Д. кустарниковая. Прямое секвенирование выбранных ампликонов определили четыре разных типа последовательности для каждого локуса, присутствующий в четырех различных комбинаций. Нуклеотидные последовательности данных, были получены из следующих инвентарными номерами М1 гаплотипов (АВ793589), М2 гаплотипов (АВ793590), Мз гаплотипов (АВ793591), М4 гаплотипов (АВ793592).
Ключевые слова: пятилистник кустарниковый, БазгрНота/тШгсоза, гаплотип, секвенс, фруктоза, полимеразная цепная реакция, матураза К, Монголия.
