CC BY
1
https://doi.org/10.17116/molgen20234103116
Направленная нейрональная дифференцировка клеток нейробластомы человека линии SH-SY5Y на 2D матриксах, содержащих модифицированные пептидами клеточной адгезии рекомбинантные спидроины
© О.Д. КУРКО1, Л.И. ДАВЫДОВА2, К.В. СИДОРУК2, И.А. ГРИВЕННИКОВ1, В.Г. ДЕБАБОВ2, В.Г. БОГУШ2, 3, В.З. ТАРАНТУЛ1, О.В. ДОЛОТОВ1' 4
1ФГБУ «Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Лаборатория молекулярной нейрогенетики и врожденного иммунитета, Москва, Россия;
2ФГБУ «Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Лаборатория белковой инженерии, Москва, Россия; 3ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии», Лаборатория индуцированного рекомбиногенеза, Москва, Россия;
4ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», биологический факультет, Москва, Россия РЕЗЮМЕ
Цель исследования. Важным для создания тканеинженерных конструкций, предназначенных для лечения патологий нервной системы, является использование эффективных и недорогих подложек (2D матриксов) для культивирования и диф-ференцировки нервных клеток in vitro. Перспективными для решения этой задачи представляются рекомбинантные аналоги белков каркасной нити паутины пауков-кругопрядов — спидроинов 1 и 2. Целью исследования являлась оценка влияния клеточных подложек, полученных из смесей рекомбинантных спидроинов (РС) rS1/9 и rS2/12 с гибридными белками (ГБ), содержащими мономер rS1/9, слитый с биологически активными пептидами, на уровни экспрессии генов ключевых синапс-специфичных белков и жизнеспособности клеток нейробластомы человека линии SH-SY5Y при направленной хо-линергической дифференцировке.
Материал и методы. Применяли двухстадийную схему направленной холинергической дифференцировки клеток SH-SY5Y с использованием ретиноевой кислоты и нейротрофического фактора мозга (BDNF). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью MTT-теста и окрашивания кристаллическим фиолетовым. Уровни мРНК исследуемых генов оценивали с помощью ПЦР в режиме реального времени.
Результаты. Направленная дифференцировка клеток SH-SY5Y сопровождалась существенным повышением уровней экспрессии генов синаптофизина, синапсинов I, II и постсинаптического белка PSD-95. Наибольшая жизнеспособность клеток и повышенные уровни экспрессии PSD-95 обнаружены при дифференцировке на подложке, состоящей из смеси РС rS1/9 и rS2/12 с ГБ, содержащими пептид RGDS (присутствующий в белках внеклеточного матрикса) и гепарин-связываю-щий пептид (HBP, фрагмент ламинина).
Заключение. Наибольшую эффективность при направленной холинергической дифференцировке клеток SH-SY5Y показала подложка, состоящая из смеси РС rS1/9 и rS2/12 и ГБ на основе мономера РС rS1/9, слитого с RGDS (лиганд интегринов) и HBP (лиганд ростовых факторов и синдеканов). Подложки, состоящие только из РС rS2/12 или смеси rS2/12 с TORGDS) продемонстрировали более низкую эффективность, однако использование пептида GRGGL (взаимодействующего с ней-ральными молекулами клеточной адгезии и входящего в состав РС rS1/9) приводило к повышению эффективности.
Ключевые слова: комбинированный матрикс, рекомбинантные спидроины, биологически активные пептиды, нейробласто-ма человека, направленная нейрональная дифференцировка, синапс-специфичные белки, жизнеспособность нейронов.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
Курко О.Д. — https://orcid.org/0009-0005-5206-0587; e-mail: [email protected] Давыдова Л.И. — e-mail: [email protected]
Сидорук К.В. — https://orcid.org/0000-0001-8952-5409; e-mail: [email protected] Гривенников И.А. — https://orcid.org/0000-0003-0128-5661; e-mail: [email protected] Дебабов В.Г. — https://orcid.org/0000-0001-7577-7437; e-mail: [email protected] Богуш В.Г. — https://orcid.org/0000-0002-5969-3855; e-mail: [email protected] Тарантул В.З. — https://orcid.org/0000-0002-5525-0395; e-mail: [email protected] Долотов О.В. — https://orcid.org/0000-0003-3187-6331; e-mail: [email protected] Автор, ответственный за переписку: Долотов О.В. — e-mail: [email protected]
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Курко О.Д., Давыдова Л.И., Сидорук К.В., Гривенников И.А., Дебабов В.Г., Богуш В.Г., Тарантул В.З., Долотов О.В. Направленная нейрональная дифференцировка клеток нейробластомы человека линии SH-SY5Y на 2D матриксах, содержащих модифицированные пептидами клеточной адгезии рекомбинантные спидроины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2023;41(3):16-24. https://doi.org/10.17116/molgen20234103116
Directed neuronal differentiation of SH-SY5Y human neuroblastoma cells on 2D matrixes containing recombinant spidroins modified with cell adhesion peptides
© O.D. KURKO1, L.I. DAVYDOVA 2, K.V. SIDORUK2, I.A. GRIVENNIKOV1, V.G. DEBABOV2, V.G. BOGUSH2- 3, V.Z. TARANTUL1, O.V. DOLOTOV1, 4
'National Research Center «Kurchatov Institute», Laboratory of Molecular Neurogenetics and Innate Immunity, Moscow, Russia; 2National Research Center «Kurchatov Institute»", Laboratory of Protein Engineering, Moscow, Russia; 3All-Russia Research Institute of Agricultural Biotechnology, Laboratory of induced recombogenesis, Moscow, Russia; 3Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, Moscow, Russia
ABSTRACT
Aim. The use of efficient and inexpensive coatings (2D matrices) for the cultivation and differentiation of nerve cells in vitro is important for the development of tissue-engineered constructs intended for the treatment of pathologies of the nervous system. Promising for such constructs are recombinant analogs of the dragline silk fiber of the orb-weaving spiders web, namely, spidroins 1 and 2. The aim of the study was to evaluate the effects of coatings obtained from mixtures of recombinant spidroins (RSs) rS1/9 and rS2/12 with hybrid proteins (HPs) containing the rS1/9 monomer fused with biologically active peptides on the levels of expression of key synapse-specific genes and viability of SH-SY5Y human neuroblastoma cells in directed cholinergic differentiation.
Material and methods. A two-stage scheme of directed cholinergic differentiation using retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) was applied. Cell viability was assessed using the MTT test and crystal violet staining. The expression levels of the studied genes were assessed using real-time PCR.
Results. Directed differentiation of SH-SY5Y cells was accompanied by a significant increase in the expression levels of the genes of synaptophysin, synapsins I, II, and the postsynaptic protein PSD-95. The highest cell viability and increased levels of PSD-95 expression were found during differentiation on a coating consisting of a mixture of RSs rS1/9 and rS2/12 with HPs containing the RGDS peptide (present in extracellular matrix proteins) and the heparin-binding peptide HBP (a fragment of laminin). Conclusion. The coating consisting of a mixture of RSs rS1/9 and rS2/12 and HP based on the RS monomer rS1/9 fused with RGDS (a ligand for integrins) and HBP (a ligand for growth factors and syndecans) showed the highest efficiency in directed neuronal differentiation of SH-SY5Y cells. Coatings consisting of rS2/12 alone or a mixture of rS2/12 with HP(RGDS) demonstrated less efficiency, but the fusion with the GRGGL peptide (which interacts with NCAMs and is a fragment of rS1/9) resulted in an increase in efficiency.
Keywords: combined matrix, recombinant spidroins, biologically active peptides, human neuroblastoma, directed neuronal differentiation, synapse-specific proteins, viability of neurons.
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS:
Kurko O.D. — https://orcid.org/0009-0005-5206-0587; e-mail: [email protected] Davydova L.I. — e-mail: [email protected]
Sidoruk K.V. — https://orcid.org/0000-0001-8952-5409; e-mail: [email protected] Grivennikov I.A. — https://orcid.org/0000-0003-0128-5661; e-mail: [email protected] Debabov V.G. — https://orcid.org/0000-0001-7577-7437; e-mail: [email protected] Bogush V.G. — https://orcid.org/0000-0002-5969-3855; e-mail: [email protected] Tarantul V.Z. — https://orcid.org/0000-0002-5525-0395; e-mail: [email protected] Dolotov O.V. — https://orcid.org/0000-0003-3187-6331; e-mail: [email protected] Corresponding author: Dolotov O.V. — e-mail: [email protected]
TO CITE THIS ARTICLE:
Kurko OD, Davydova LI, Sidoruk KV, Grivennikov IA, Debabov VG, Bogush VG, Tarantul VZ, Dolotov OV. Directed neuronal differentiation of SH-SY5Y human neuroblastoma cells on 2D matrixes containing recombinant spidroins modified with cell adhesion peptides. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2023;41(3):16—24. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen20234103116
Список сокращений:
БАП — биологически активный пептид ВКМ — внеклеточный матрикс РС — рекомбинантный спвдроин
^(RGDS) — гибридный белок, содержащий тетрапептид RGDS
ГБ(НВР) — гибридный белок, содержащий гепарин-связывающий пептид (HBP)
^(GRGGL) — гибридный белок, содержащий пентапептид GRGGL
BDNF — нейротрофический фактор мозга (brain derived neurotrophic factor)
CV — кристаллический фиолетовый (crystal violet)
Ret — ретиноевая кислота (retinoic acid)
Введение
Тканевая инженерия направлена на разработку клеточных конструктов, содержащих матриксы, клетки и биологически активные макромолекулы, являю-
щихся биологическими заменителями, способными восстанавливать, поддерживать или улучшать функции поврежденной ткани. Несмотря на заметные успехи в создании различных тканеинженерных конструк-
ций, в отношении нервной ткани до сих пор остается нерешенной задача получения матриксов с оптимизированными свойствами, обеспечивающими достаточную для нормального функционирования реконструированной ткани степень выживаемости трансплантируемых нервных клеток, направленную дифференцировку нейрональных предшественников в нейроны требуемых типов, а также высокую степень и скорость васкуляри-зации и иннервации [1].
Перспективной основой для создания тканеинже-нерных конструкций для нервной системы являются образующие нити каркаса паутины пауков-кругопря-дов белки спидроин 1 и спидроин 2, характеризующиеся уникальным сочетанием высочайших показателей прочности и эластичности [2]. Были получены реком-бинантные аналоги спидроинов (РС), свойства которых во многом близки к природным спидроинам и характеризуются биосовместимостью, неиммуногенно-стью, неаллергенностью и биоразлагаемостью [3—5].
РС могут быть модифицированы введением в их структуру различных биологически активных пептидов (БАП), в том числе, мотивов белков внеклеточного матрикса (ВКМ), способствующих клеточной адгезии, что потенциально позволяет получать матриксы с уникальными заданными свойствами [6]. В данной работе мы исследовали подложки (2D матриксы), полученные нанесением на поверхность полистирольных планшетов для адгезионных культур клеток (см. Материал и методы) смесей РС Й1/9 и Й2/12 с гибридными белками (ГБ), содержащими мономер Й1/9 и один из рекомбинантных БАП [7—9]. В качестве БАП были использованы: пептид RGDS (входящий в состав некоторых белков ВКМ и связывающийся с клеточными интегри-нами) [10, 11], гепарин ИаЪе связывающий пептид (НВР), входящий в состав ламинина [12], участвующий в связывании различных ростовых факторов и взаимодействующий с синдеканами, и пептид GRGGL (содержащийся также в составе молекулы Й1/9), связывающийся с нейральными молекулами клеточной адгезии (КСЛМ) [13, 14].
Цель данного исследования — оценка влияния различных комбинаций спидроиновых подложек с БАП на жизнеспособность клеток нейробласто-мы человека линии SH-SY5Y и уровни экспрессии в них ключевых синапс-специфичных генов (являющиеся показателем зрелости нейронов ) при направленной холинергической дифференцировке этих клеток. Использованная линия клеток является широко применяемой клеточной моделью для изучения ней-рональной дифференцировки и функционирования нейронов [15—17].
Материал и методы
Рекомбинантные аналоги спидроинов и гибридные белки. Полноразмерные РС Й1/9 и Й2/12 выделя-
ли из водонерастворимой фракции клеток штаммов-продуцентов S. cerevisiae и очищали с помощью ионно-обменной хроматографии, как описано ранее [18]. ГБ, содержащие разные БАП, были сконструированы по одной схеме: H6-SUMO-1F1-G(SGG)4S-^An), где H6 _ his-tag для очистки на Ni-колонке; SUMO (Small Ubiquitin Like Modifier) _ пептид _ продукт гена Smt3 дрожжей, способствующий повышению выхода белка в клетках E. coli; 1F1- мономер РС rS1/9, выполняющий роль «якоря» при взаимодействии с полноразмерными РС; G(S-GG)4S _ нейтральный линкер, способствующий экспозиции БАП над поверхностью матрикса; БАП _ любой из клонированных БАП. Получение и очистку ГБ, приготовление смешанных растворов и покрытие поверхности планшетов исследуемыми растворами проводили, как описано ранее [19].
Были исследованы следующие варианты подложек: 1) смесь [rS2/12 + re(RGDS)] (вариант SP1); 2) rS2/12 (вариант SP2); 3) смесь [rS2/12 + rS1/9 + re(RGDS) + ГБ(НВР)] (вариант SP3); 4) смесь [rS1/9 + rS2/12] (вариант SP4); 5) смесь [rS2/12 + re(GRGGL)] (вариант SP5); 6) контроль (поверхность культуральных планшетов без нанесения на них вышеуказанных смесей).
Культивирование и направленная дифференцировка клеток. Клетки нейробластомы человека линии SH-SY5Y (ATCC CRL-2266; «Спутник-К», Россия) культивировали в среде DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium High Glucose, «Gibco», США), содержащей добавку Glutamax («Gibco», США) и 10% инактиви-рованной эмбриональной сыворотки коровы («Hy-Clone», США) при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% CO2. Через 24 ч после засева клеток на культураль-ные планшеты проводили направленную нейрональ-ную дифференцировку клеток согласно описанной ранее двухстадийной схеме в указанной культураль-ной среде без сыворотки, содержащей дополнительно добавку B-27 («Gibco», США) и 10 мкМ ретино-евой кислоты (Ret) (all-íra«s-Retinoicacid, «Sigma», США) в течение 5 дней (первая стадия дифференцировки). Далее в среду вводили нейротрофический фактор мозга BDNF (50 нг/мл, «Peprotech», Великобритания) и через 4 дня повторно вводили BDNF (общее время инкубации с BDNF составляло 7 дней, заключительная стадия дифференцировки).
В работе использовали 12- и 96-луночные поли-стирольные планшеты для адгезионных клеточных культур (Cat.No. 30012 и 30096 «SPL LifeSciences», Республика Корея). Полистирольная поверхность этих планшетов модифицирована производителем в целях оптимальной адгезии клеток. Поверхность планшетов, не покрытая исследуемыми 2D матриксами, служила в качестве контроля [20].
Оценка жизнеспособности клеток. Использовали два колориметрических метода (CV-тест и MTT-тест) согласно описанным стандартным методи-
кам — с применением красителя кристаллического фиолетового (crystal violet, CV) и 3-(4,5-диметилтиа-зол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (MTT) («Sigma», США). Оптическую плотность (соответствующую количествам связавшегося красителя CV или образовавшегося из MTT формазана и являющуюся характеристикой жизнеспособности клеток), измеряли с использованием многоканального спектрофотометра при длине волны 600 нм [21, 22].
Определение уровней транскрипции генов. Выделение тотальной РНК проводили с помощью набора ExtractRNA («Евроген», Россия), очистку от примесей геномной ДНК проводили с помощью набора ThermoScientificDNasel («ThermoFisherScientific», США), обратную транскрипцию и ПЦР в реальном времени проводили с помощью смесей MMLVSK022L и 5xqPCRmix-HSSYBR («Евроген», Россия) согласно инструкциям производителей. Результаты ПЦР анализировали с помощью метода 2(-Delta Delta C(T)). Для проведения ПЦР использовали опубликованные ранее последовательности праймеров: синапсин I, синапсин II, синаптофизин, PSD-95. В качестве ре-ференсного гена использовали бета-актин [23—28].
Статистическая обработка результатов. Анализ данных проводили с помощью программы GraphPad Prism. Сравнения групп осуществляли с помощью одно- и двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA); множественные сравнения групп проводили с помощью теста Холма—Шидака. Нормальность выборок проверяли тестом Шапиро—Уилка. Однородность дисперсий проверяли тестом Брауна—Форсайта. Примененные тесты ANOVA, уровни значимости различий между группами и объемы групп указаны в подписях к рисункам.
Результаты
Сравнение жизнеспособности клеток SH-SY5Y на различных стадиях направленной нейрональной диф-ференцировки на исследуемых 2D матриксах. Уровни жизнеспособности клеток перед началом дифферен-цировки (стадия «0» на рисунках) на подложках SP1, SP5, SP2 не различались между собой и от контроля по данным обоих тестов жизнеспособности (рис. 1 а, б). По данным CV-теста (см. рис. 1, а) различий не обнаружено также после первой стадии дифференци-ровки (стадия «Ret» на рисунках). После заключительной стадии дифференцировки (стадия «BDNF») обнаружено значимое снижение жизнеспособности клеток, культивированных на подложках SP2 (rS2/12) и SP1 [rS2/12 + TB(RGDS)] по сравнению с контролем. В то же время, на подложке SP5 [rS2/12 + TB(GRGGL)] жизнеспособность клеток была значимо выше, чем на подложках SP2 и SP1, и не отличалась от контрольной. По данным MTT-теста (рис. 1, б) после первой стадии дифференцировки происходит значимое снижение жизнеспособно-
сти клеток, культивированных на 8Р2 по сравнению с контролем и подложкой 8Р1. После заключительной стадии дифференцировки обнаружена тенденция к значимому (9=0,08) снижению жизнеспособности клеток при их культивировании на SP2 по сравнению с контролем и значимое повышение жизнеспособности при культивировании на подложке SP5 по сравнению с SP2. Таким образом, на подложке SP2 после первой стадии дифференцировки (по МТТ-тесту) и после заключительной стадии дифференцировки (по СУ-тесту) наблюдалась более низкая жизнеспособность клеток, чем на контрольной поверхности. В то же время, по обоим тестам жизнеспособность клеток при дифференцировке на подложке SP5 была выше, чем на SP2.
Жизнеспособность клеток на подложке SP4 [Й1/9 + Й2/12] по данным СУ-теста (рис. 1, в) и МТТ-теста (рис. 1, г) не отличалась от контроля на всех стадиях дифференцировки. При культивировании на подложке SP3 [Й2/12+ Й1/9 + ГБ(RGDS) + ГБ(HBP)] обоими тестами не обнаружено различий в жизнеспособности клеток перед началом дифференцировки, но по данным СУ-теста (см. рис. 1, в) выявлено значимое повышение жизнеспособности по сравнению как с контрольной поверхностью, так и с подложкой SP4 после первой стадии и заключительной стадии диффе-ренцировки. По данным МТТ-теста (см. рис. 1, г) на первой стадии обнаружено повышение жизнеспособности только по сравнению с подложкой SP4, а на заключительной стадии — по сравнению и с подложкой SP4, и с контролем. Таким образом, при дифференцировке клеток на подложке SP3 наблюдалась более высокая жизнеспособность клеток, чем на контрольной поверхности и подложке SP4, причем на заключительной стадии дифференцировки повышение жизнеспособности обнаружено по данным обоих тестов.
Изменения уровней транскрипции генов синапс-специфичных белков на различных стадиях дифференцировки клеток SH-SY5Y на контрольной поверхности. Уровни экспрессии синапс-специфичных генов рассматриваются как показатель зрелости нейронов. Так как данные об экспрессии этих генов при направленной нейрональной дифференцировке клеток SH-SY5Y в литературе отсутствуют, нами была проведена оценка изменений уровней транскрипции синапсина I, синапсина II, синаптофизина и PSD-95 в процессе нейрональной дифференцировки на контрольной поверхности. После первого этапа дифференцировки клеток обнаружено значимое повышение уровней мРНК синапсина I (рис. 2, а), синаптофизина (рис. 2, в) и PSD-95 (рис. 2, г) по сравнению с недифференцированными клетками. При этом не было значимого различия между уровнями мРНК синапсина II (рис. 2, б) до начала и после первой стадии дифференцировки.
Обнаружено значимое повышение уровней мРНК всех исследуемых генов после заключительной ста-
Рис. 1. Жизнеспособность клеток SH-SY5Y по данным CV-теста (а, в) и MTT-теста (б, г) на различных стадиях нейро-нальной дифференцировки на исследуемых подложках.
Обозначения: 0 — до начала дифференцировки, Ret — после первой стадии дифференцировки, BDNF — после заключительной стадии. Жизнеспособность на контрольной поверхности на каждой стадии принята за 100%. Двухфакторный ANOVA, тест Холма—Ши-дака. Mean±SEM, N=5. * — Р<0,05, ** — Р<0,01, *** — Р<0,001, **** — Р<0,0001.
дии дифференцировки по сравнению как с первой стадией, так и с недифференцированными клетками (см. рис. 2, а—г). Таким образом, направленная нейрональная дифференцировка клеток SH-SY5Y сопровождается существенным повышением уровней транскрипции ключевых синапс-специфичных генов, что указывает на ее эффективность.
Сравнение уровней транскрипции генов синапс-специфичных белков на разных стадиях нейрональной дифференцировки клеток SH-SY5Y на исследуемых ма-триксах. На всех стадиях дифференцировки не было обнаружено различий в уровнях мРНК синапсина I, синапсина II и синаптофизина между всеми исследованными подложками (данные не приведены).
Рис. 2. Уровни транскрипции синапс-специфичных генов на различных стадиях дифференцировки клеток SH-SY5Y на контрольной поверхности: синапсин I (а), синапсин II (б), синаптофизин (в), PSD-95 (г).
Обозначения: 0 — до начала дифференцировки, Ret — после первой стадии дифференцировки, BDNF — после заключительной стадии дифференцировки. Уровни мРНК до начала дифференцировки (стадия 0) приняты за 100%. Однофакторный ANOVA, тест Хол-ма—Шидака. Mean±SEM, N=4—6. * — Р<0,05, ** — Р<0,01, *** — Р<0,001, **** — Р<0,0001.
Для уровней мРНК PSD-95 также не обнаружено различий между подложками SP1, SP5, SP2 и контролем на всех стадиях (рис. 3, а, в), но они значимо повыше-
ны для подложки SP3 по сравнению с контролем после первой (Ret) (рис. 3, б) и заключительной (BDNF) (рис. 3, г) стадий дифференцировки. При этом после
Рис. 3. Уровни транскрипции гена постсинаптического белка PSD-95 после первой (Ret) (а, б) и заключительной (BDNF) (в, г) стадий дифференцировки при культивировании клеток SH-SY5Y на исследуемых подложках.
а, в — уровни мРНК PSD-95 при дифференцировке на подложках SP1 [rS2/12 + rB(RGDS)], SP5 [rS2/12 + rB(GRGGL)] и SP2 (rS2/12);
б, г — уровни мРНК PSD-95 при дифференцировке на подложках SP3 [rS2/12 + rS1/9 + TB(RGDS) + rB(HBP)] и SP4 [rS1/9 + rS2/12]. Уровни мРНК PSD-95 в клетках на контрольной поверхности приняты за 100%. Однофакторный ANOVA, тест Холма—Шидака. Mean±SEM, N=6. * — Р<0,05.
первой стадии дифференцировки клеток повышение в них уровней мРНК PSD-95 при культивировании на SP3 по сравнению с SP4 близко к значимому (р=0,054) (см. рис. 3, б), а после заключительной стадии уровень мРНК PSD-95 для SP3 значимо превышает уровень для SP4 (рис. 3, г).
Обсуждение
Полученные результаты свидетельствуют о том, что адгезионные свойства исследованных подложек
в отношении недифференцированных клеток ней-робластомы человека 8И-8У5У (соответствующих нейрональным предшественникам) сопоставимы по данным обоих тестов оценки жизнеспособности клеток. Однако при проведении направленной дифференцировки клеток нейробластомы на разных подложках обнаружены различия как в жизнеспособности клеток, культивируемых на различных подложках, так и в результатах двух использованных тестов жизнеспособности в отношении клеток на одной и той же подложке. В СУ-тесте
оценка основана на способности красителя связываться с клеточными макромолекулами. Нейрональ-ная дифференцировка и нейрональный морфогенез включают в себя такие процессы, как рост нейритов и синаптогенез, требующие постоянного синтеза de novo белков и соответствующих мРНК [29]. Обнаруженное нами по данным CV-теста повышение жизнеспособности культивируемых клеток на обеих стадиях дифференцировки только при использовании подложки SP3 может свидетельствовать о большей интенсивности роста нейритов и процессов си-наптогенеза при культивировании на данной подложке, чем на других подложках, и более высоком содержании в клетках белков и мРНК, связывающих краситель CV. Таким образом, уровни жизнеспособности клеток по CV-тесту в ходе нейрональ-ной дифференцировки клеток нейробластомы могут отражать не только количество живых клеток, но и интенсивность процесса нейрональной диф-ференцировки.
В MTT-тесте оценка основана на измерении активности присутствующих в живых клетках NADPH-зависимых оксидоредуктаз, что отражает как количество живых клеток, так и их митохондри-альный статус [22]. Обнаруженное на заключительной стадии дифференцировки на подложке SP3 повышение уровня жизнеспособности клеток не только по CV-тесту, но и по MTT-тесту может отражать повышенную потребность дифференцированных нейронов в обеспечении энергией функционирования синапсов, что обусловливает концентрирование митохондрий в пре- и постсинаптических областях [30]. Эти предположения о повышенном синтезе клеточных макромолекул и возрастающем митохондриаль-ном статусе нейронов согласуются с более высокими уровнями транскрипции гена постсинапическо-го белка PSD-95 при дифференцировке на подложке SP3. Подложка SP3 содержит в своем составе наиболее богатый набор БАП: пептид GRGGL (18 копий в составе РС rS1/9), пептиды RGDS и HBP, все способные взаимодействовать с разными мишенями (соответственно, с NCAM, с интегринами и синдекана-ми), вызывая таким образом более разнообразный клеточный ответ.
Снижение жизнеспособности клеток по данным обоих тестов по сравнению с контролем при дифференцировке на подложках SP1 и SP2 может свидетельствовать о меньшей эффективности подложек на основе только РС rS2/12. Введение в смесь с rS2/12 ГБ с БАП RGDS, который взаимодействует с интегринами и положительно влияет на адгезию и пролиферацию многих видов клеток, существенно не повышало эффективность подложки. Однако введение ГБ с БАП GRGGL (лиганд NCAM) повышало
ее до уровня контроля, что указывает на перспективность использования в тканеинженерных конструкциях ГБ с этим БАП и РС rS1/9, содержащего 18 копий этого пептида.
Представленные данные о наибольшей эффективности подложки SP3 при проведении нейрональной холинергической дифференцировки линии нейробластомы человека SH-SY5Y соответствуют полученным нами ранее результатам на модели до-фаминергической дифференцировки нейрональных предшественников, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Полученные там результаты также свидетельствовали о наиболее высокой по MTT-тесту жизнеспособности клеток и повышенных уровнях транскрипции генов ряда синапс-специфичных белков, включая PSD-95, при культивировании на подложке SP3. Таким образом, первичная оценка и сравнение эффективности разрабатываемых матриксов в отношении нейрональной дифференцировки клеток человека может проводиться с использованием более простой и доступной клеточной модели на основе линии SH-SY5Y.
Заключение
Проведенное сравнение нескольких комбинированных подложек на основе рекомбинантных аналогов спидроинов и БАП указывает на наиболее эффективную для проведения направленной нейрональной дифференцировки клеток нейробластомы человека SH-SY5Y подложку, состоящую из смеси РС rS1/9 и rS2/12 и ГБ на основе мономера РС rS1/9, слитого с БАП RGDS (лиганд интегринов) и HBP (лиганд ряда ростовых факторов и синдеканов). Подложки, состоящие только из РС rS2/12 или смеси rS2/12 с re(RGDS), обеспечивали более низкую эффективность нейрональной дифференцировки клеток, однако, использование пептида GRGGL, взаимодействующего с NCAM и входящего также в состав РС rS1/9, приводит к повышению этой эффективности.
Финансирование работы
Работа поддержана Министерством науки и высшего образования РФ (соглашение № 075-15-2023-324).
Соблюдение этических стандартов
Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Gholipourmalekabadi M, Zhao S, Harrison BS, Mozafari M, Seifalian AM. Oxygen-Generating Biomaterials: A New, Viable Paradigm for Tissue Engineering? TrendsBiotechnol. 2016;34(12):1010-1021. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2016.05.012
2. Blackledge TA. Spider silk: a brief review and prospectus on research linking biomechanics and ecology in draglines and orb webs. J Arachnology. 2012;40(1):1-12, 12.
3.
6.
Debabov VG, Bogush VG. Recombinant Spidroins as the Basis for New Materials. ACS Biomater Sci Eng. 2020;6(7):3745-3761. https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials.0c0010 9
Rising A, Widhe M, Johansson J, Hedhammar M. Spider silk proteins: recent advances in recombinant production, structure-function relationships and biomedical applications. Cell Mol Life Sci. 2011;68(2):169-184. https://doi.org/10.1007/s00018-010-0462-z
Bogush VG, Sokolova OS, Davydova LI, Klinov DV, Sidoruk KV, Esipova NG, et al. A novel model system for design of biomaterials based on recombinant analogs of spider silk proteins. Journal of neuroimmunepharmacology : the official journal of the Society on Neuroimmune Pharmacology. 2009;4(1):17-27.
https://doi.org/10.1007/s11481-008-9129-z
Jansson R, Thatikonda N, Lindberg D, Rising A, Johansson J, Nygren P, Hedhammar M. Recombinant spider silk genetically functionalized with affinity domains. Biomacromolecules. 2014;15(5):1696-706. https://doi.org/10.1021/bm500114e
7. Matsuda A, Kobayashi H, Itoh S, Kataoka K, Tanaka J. Immobilization of laminin peptide in molecularly aligned chitosan by covalent bonding. Biomaterials. 2005;26(15):2273-2279. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2004.07.032
8. Mauri E, Sacchetti A, Vicario N, Peruzzotti-Jametti L, Rossi F, Pluchino S. Evaluation of RGD functionalization in hybrid hydrogels as 3D neural stem cell culture systems. Biomaterials science. 2018;6(3):501-510. https://doi.org/10.1039/c7bm01056g
9. Moisenovich MM, Silachev DN, Moysenovich AM, Arkhipova AY, Shai-tan KV, Bogush VG, et al. Effects of Recombinant Spidroin rS1/9 on Brain Neural Progenitors After Photothrombosis-Induced Ischemia. Frontiers in cell and developmental biology. 2020;8:823. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00823
10. Hirano Y, Okuno M, Hayashi T, Goto K, Nakajima A. Cell-attachment activities of surface immobilized oligopeptides RGD, RGDS, RGDV, RGDT, and YIGSR toward five cell lines. Journal of biomaterials science Polymer edition. 1993;4(3):235-243. https://doi.org/10.1163/156856293x00546
11. Wohlrab S, Müller S, Schmidt A, Neubauer S, Kessler H, Leal-Egana A, Scheibel T. Cell adhesion and proliferation on RGD-modified recombinant spider silk proteins. Biomaterials. 2012;33(28):6650-6659. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2012.05.069
12. Timpl R, Rohde H, Robey PG, Rennard SI, Foidart JM, Martin GR. Lami-nin--a glycoprotein from basement membranes. The Journal oof biological chemistry. 1979;254(19):9933-9937.
13. Ishihara J, Ishihara A, Fukunaga K, Sasaki K, White MJV, Briquez PS, Hubbell JA. Laminin heparin-binding peptides bind to several growth factors and enhance diabetic wound healing. Nature communications. 2018;9(1):2163. https://doi.org/10.1038/s41467-018-04525-w
14. An B, Tang-Schomer M, Huang W, He J, Jones J, Lewis RV, Kaplan DL. Physical and biological regulation of neuron regenerative growth and network formation on recombinant dragline silks. Biomaterials. 2015;48:137-146. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.01.044
15. Goldie BJ, Barnett MM, Cairns MJ. BDNF and the maturation of posttran-scriptional regulatory networks in human SH-SY5Y neuroblast differentiation. Frontiers in cellular neuroscience. 2014;8325.
16. de Medeiros LM, De Bastiani MA, Rico EP, Schonhofen P, Pfaffenseller B, Wollenhaupt-Aguiar B,et al. Cholinergic Differentiation of Human Neuro-
blastoma SH-SY5Y Cell Line and Its Potential Use as an In vitro Model for Alzheimer's Disease Studies. Molecular neurobiology. 2019;56(ll):7355-7367. https://doi.org/10.1007/sl2035-019-1605-3
17. Gimenez-Cassina A, Lim F, Diaz-Nido J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of neuroscience research. 2006;84(4):755-767. https://doi.org/10.1002/jnr.20976
18. Revkova VA, Sidoruk KV, Kalsin VA, Melnikov PA, Konoplyannikov MA, Kotova S, et al. Spidroin Silk Fibers with Bioactive Motifs of Extracellular Proteins for Neural Tissue Engineering. ACS omega. 2021;6(23):15264-15273. https://doi.org/10.1021/acsomega.1c01576
19. Novosadova EV, Dolotov OV, Novosadova LV, Davydova LI, Sidoruk KV, Arsenyeva EL, et al. Composite Coatings Based on Recombinant Spidroins and Peptides with Motifs of the Extracellular Matrix Proteins Enhance Neuronal Differentiation of Neural Precursor Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. International journal oof molecular sciences. 2023;24(5)4871.
https://doi.org/10.3390/ijms24054871
20. Lerman MJ, Lembong J, Muramoto S, Gillen G, Fisher JP. The Evolution of Polystyrene as a Cell Culture Material. Tissue Engineering Part B: Reviews. 2018;24(5):359-372.
https://doi.org/10.1089/ten.teb.2018.0056
21. Feoktistova M, Geserick P, Leverkus M. Crystal Violet Assay for Determining Viability of Cultured Cells. Cold Spring Harbor protocols. 2016;2016(4):pdb prot087379.
https://doi.org/10.1101/pdb.prot087379
22. Vistica DT, Skehan P, Scudiero D, Monks A, Pittman A, Boyd MR. Tetra-zolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer research. 1991;51(10):2515-2520.
23. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods (San Diego, Calif). 2001;25(4):402-408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262
24. Goudarzi F, Tayebinia H, Karimi J, Habibitabar E, Khodadadi I. Calcium: A novel and efficient inducer of differentiation of adipose-derived stem cells into neuron-like cells. Journal of cellular physiology. 2018;233(11):8940-8951. https://doi.org/10.1002/jcp.26826
25. Imai C, Sugai T, Iritani S, Niizato K, Nakamura R, Makifuchi T, et al. A quantitative study on the expression of synapsin II and N-ethylmaleim-ide-sensitive fusion protein in schizophrenic patients. Neuroscience letters. 2001;305(3):185-188.
https://doi.org/10.1016/s0304-3940(01)01844-4
26. Sen A, Hongpaisan J, Wang D, Nelson TJ, Alkon DL. Protein Kinase C (PKC) Promotes Synaptogenesis through Membrane Accumulation of the Postsynaptic Density Protein PSD-95. The Journal oof biological chemistry. 2016;291(32):16462-16476. https://doi.org/10.1074/jbc.M116.730440
27. Artyukhov AS, Dashinimaev EB, Tsvetkov VO, Bolshakov AP, Konovalova EV, Kolbaev SN, et al. New genes for accurate normalization of qRT-PCR results in study of iPS and iPS-derived cells. Gene. 2017;626:234-240. https://doi.org/10.1016/j.gene.2017.05.045
28. Song Y, Zuo Y. Occurrence of HHIP gene CpG island methylation in gastric cancer. Oncology letters. 2014;8(5):2340-2344. https://doi.org/10.3892/ol.2014.2518
29. Tojima T, Ito E. Signal transduction cascades underlying de novo protein synthesis required for neuronal morphogenesis in differentiating neurons. Progress in neurobiology. 2004;72(3):183-193. https://doi.org/10.1016/j.pneurobio.2004.03.002
30. Son G, Han J. Roles of mitochondria in neuronal development. BMB reports. 2018;51(11):549-556. https://doi.org/10.5483/BMBRep.2018.51.11.226
Поступила в редакцию 06.04.2023 Поступила после доработки 07.07.2023 Принята к публикации 10.07.2023
